一种甘木通总黄酮的制备方法及其在抗心肌缺血药物中的应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于中药领域，涉及一种抗心肌缺血的药物，用于隐匿性冠心病、心绞痛、 心肌梗死、缺血性心肌病等心肌缺血性疾病的防治，具体地说是一种甘木通总黄酮的制备 方法及其在抗心肌缺血药物中的应用。
【背景技术】：
[0002] 冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronaryarterydisease,CAD)多为因冠状动脉病 变引起冠脉血流量减少与心肌需求不平衡，即心肌缺血，从而导致的心肌损害，临床表现为 心绞痛、心肌梗死（myocardialinfarction,MI)、心律失常、粹死或心力衰竭，由此引起的 心脏病就是常说的"冠心病"。冠心病不仅发病率高，还将导致的高致残率和高病死率，是美 国死亡的头号病因，在中国也是第三位致死性疾病。据世界卫生组织统计，全球死于心血管 疾病的人数将从2004年的1180万增加到2030年的1710万，而冠心病占所有疾病死因的 第一位，预计到2030年仍将占第一位，大约占14. 2%。
[0003]冠心病的治疗在某种程度上取决于存活心肌细胞的多少，及缺血心肌血供的改 善。近年来，动脉搭桥术、溶栓疗法、经皮腔内冠脉血管成形术、体外循环心脏外科手术和心 肺脑复苏术等手段的建立和推广应用，使得缺血心脏能在短时间内重新获得血液灌注并恢 复氧供应。多数情况下，缺血后再灌注可使损伤的结构得到修复，心功能恢复，病情好转； 但有时不仅不能使心功能恢复，反而会加重心脏功能障碍和结构损伤。这种在心肌缺血基 础上恢复血流后组织损伤加重、甚至发生不可逆性损伤的现象称为心肌缺血再灌注损伤 (myocardialischemia-reperfusioninjury，MIRI)。目前，如何减少MIRI已经成为心脏 血运重建治疗领域的一个新的挑战，研发抗心肌缺血药物也成为冠心病治疗的研究热点。
[0004] 甘木通ClematisfilamentosaDunn又名丝铁线莲，民间俗称"眼蛇药"，为毛茛科 丝铁线莲属植物。甘木通喜生于海拔500-1600m的溪边、山谷的灌木丛中或密林，常攀缘于 其他植物之上，主要分布在广东、广西、福建、台湾、云南、海南等地。
[0005] 甘木通以叶、茎入药，味甘、性微寒，归肝经，具清肝火、宁心神、降血压、通络止痛 之功效。关于甘木通在心血管方面的药理作用，已有相关报道：一、甘木通乙醇提取物不仅 能防止家兔实验性高脂血症的形成，还能抑制动脉粥样硬化的形成；二、甘木通水煎剂对麻 醉狗急性降压率为25. 6~40. 2%，麻醉大鼠降压率21. 85%，增加离体兔心冠脉灌流量、提 高小鼠减压缺氧耐力，对正常大鼠有显著降甘油三酯作用；三、甘木通提取物通过提高自 由基清除能力对结扎家兔冠脉致心肌缺血发挥保护作用，通过提高抗氧化能力和抑制细胞 凋亡发挥抗心肌缺血作用等。甘木通广泛分布于我国南方地区，在防治心血管方面的作用 确切，被认为是一种无毒性，安全度大，及药源丰富的防治冠心病和高血压的植物药。
[0006]以甘木通的水提取醇沉物为原料，生产的纯中药制剂冠心康片，是临床应用较广 的心血管治疗药物。冠心康片具有清热平肝，活血通脉之功效，用于肝经有热、肝阳上亢、脉 络瘀阻所致之头痛眩晕、胸痹心痛，肢体麻木等症，临床多用于治疗冠心病心绞痛、高血压 等症。临床研究显示，冠心康片治疗冠心病心绞痛安全，临床总有效率达78. 3%，能有效减 少减轻心肌缺血发作和改善缺血性心电图改变。
[0007] 目前，关于甘木通在心血管方面作用的研究和临床应用，均为其提取物，其确切的 有效成分尚不清楚。甘木通的水提取物和醇提物，经盐酸镁粉反应、硝酸铝反应均呈阳性， 提示甘木通含有黄酮类成分。大量研究证实黄酮类化合物具有抗心肌缺血、降血压、抗心律 失常等功效，结合甘木通及其制剂的临床应用，甘木通中黄酮类化合物是其有效成分之一。
[0008] 检索中国期刊网，文献报道的主要集中在甘木通提取物的药理作用、提取方法及 提取物中黄酮的含量测定三方面。中国专利检索有两项报道。专利CN102389468A描述了 一种含甘木通冠心康制剂及其制备方法，以甘木通水提取醇沉的稠膏，或乙醇提取的稠膏 为原料，加辅料制备成药物制剂，并采用高效液相法建立了制剂中山奈素的含量测定方法。 专利CN102426207A描述了一种甘木通黄酮类成分的检测方法及应用，以含山柰素为对照 品溶液，采用高效液相色谱法对甘木通黄酮类成分进行定性和/或定量分析。而市售的甘 木通单方制剂"冠心康片"，执行《卫生部药品标准中药成方制剂第十四册》WS3-B-2759-97 标准，采用甘木通的水提取醇沉物为原料。
[0009] 甘木通在治疗冠心病、高血压等方面有着良好的药效作用，但目前关于甘木通的 研究和临床应用，均停留在其粗提取物上，其重要的药效成分甘木通总黄酮，在提取物中含 量也不超过1. 〇%，含量低，既不利于其药效的充分发挥，也不利益于其新药新剂型的开发。 本发明采用乙醇提取、层析分离、纯化等工序，从甘木通药材中制备高纯度的甘木通总黄 酮，药理实验证实其具有良好的抗心肌缺血作用，可用于缺血性心血管药物的开发。
【发明内容】
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[0010] 本发明的目的在于解决现有技术的不足，经过大量实验研究，提供一种甘木通总 黄酮的制备方法及其在抗心肌缺血药物中的应用。
[0011] 本发明针对当前甘木通在的研究和临床应用中，均为其粗提取物的现状，以甘木 通药材为原料，利用大孔树脂-硅胶层析耦合法富集作用，制得高纯度的甘木通总黄酮。 为实现研究目的，本发明采用如下技术方案：
[0012] 一种采用醇提水沉提取，或协同超声波、微波、酶解提取，经大孔树脂-硅胶层析 二级分离技术，制得甘木通总黄酮的方法，其步骤如下：
[0013] (1)取甘木通地上部分，阴干，粉碎成粗粉，加入60%~90%乙醇，加热回流提取 1~3次，过滤，合并滤液，浓缩至比重1. 13~1. 17,得甘木通浸膏；
[0014] (2)将甘木通浸膏以10~20倍量水分散均匀，放置沉淀Ih~12h，滤过，滤液浓 缩至比重1. 10~1. 15,得甘木通醇提水沉液；
[0015] (3)将所得甘木通醇提水沉液上大孔树脂吸附柱，用水洗杂质，再用5%~20%乙 醇洗杂质，然后用50 %~80%乙醇洗脱，得甘木通总黄酮半成品洗脱液；
[0016] (4)将所得甘木通总黄酮半成品洗脱液上硅胶层析柱，用丙酮与甲醇的体积比为 1~3 : 1的混合物洗杂质，再用丙酮与甲醇的体积比为5~7 : 1洗脱，得甘木通总黄酮 洗脱液；
[0017] (5)将所得总黄酮洗脱液经纯化处理，浓缩，减压干燥，得甘木通总黄酮成品。
[0018] 所述的加热回流提取为直接加热回流提取，或协同超声波、微波、酶解提取中的一 种，优选协同提取法。所述的大孔树脂选自HPD400、HPD100、DM-13、AB-8或DlOl等广谱型 大孔树脂中的一种，优选DlOl型。树脂吸附步骤采用湿法装柱，保留液面，将甘木通醇提水 沉液通过吸附柱，收集洗脱液。所述的硅胶层析步骤采用湿法装柱，保留液面，将半成品按 重量I: 1拌活化后硅胶，并将拌好的混合物移入硅胶柱，加洗脱机，收集洗脱液。硅胶活 化条件为110°c持续30min。所述的纯化处理采用活性炭脱色、重结晶等步骤，按4g/100mL 总黄酮洗脱液加入活性炭，于25~40°C搅拌10~60分钟，滤过；滤液回收混合溶剂后，浓 缩干燥得中间体；中间体用5~10倍乙醇热溶，滤过；滤液放凉析出结晶，抽滤得甘木通总 黄酮成品。