专利名称：一种鸡传染性法氏囊病的鸡卵黄抗体的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种鸡传染性法氏囊病的鸡卵黄抗体的制备方法，属于疾病免疫技术 领域。
背景技术：
鸡传染性法氏囊病是养鸡业中常见的疾病，容易大面积爆发从而造成严重的经济 损失。目前主要的防止方法包括抗生素、中西药及其制剂、卵黄抗体及其生物制剂等，其中 卵黄抗体是采用鸡传染性法氏囊病抗原免疫健康鸡，从免疫鸡蛋的卵黄中提取鸡传染性法 氏囊病抗体，这种通过鸡免疫后卵黄抗体对鸡传染性法氏囊病见效快、疗效显著，而且针对 性强，对鸡传染性法氏囊病具有很好的预防效果。目前卵黄抗体的制备及生产工艺在现在 生产中已经成熟，主要采用的是离心沉淀法提取抗体，这样效率比较高，但是在高速离心的 情况下会造成抗体的损失，从而影响卵黄抗体生产率。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸡传染性法氏囊病的卵黄抗体的提取方法，以减少卵黄 抗体的损失，提高卵黄抗体的效价。为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是一种鸡传染性法氏囊病的鸡卵 黄抗体的提取方法，取得免疫卵黄后，打碎，分别采用乙酸-乙酸钠缓冲溶液、辛酸溶液及 硫酸铵进行提纯净化，然后用滤膜过滤得到卵黄抗体。本发明提取方法的具体步骤如下
1)将免疫鸡蛋进行清理、消毒，晾干备用；
2)从免疫鸡蛋中取得卵黄，打碎，加入抗生素和无菌生理盐水，再进行打碎混勻，得到 卵黄液；
3)向卵黄液中加入pH为4.8-5. 2的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，混勻，静置，取上清液；
4)向步骤3)得到的上清液中加入占上清液0.8-1. 0%体积的辛酸，混勻，静置，取上清
液；
5)向步骤4)得到的上清液加入0.6-1. 4倍体积的硫酸铵溶液，震荡、离心，弃去上清液 后，用PBS溶液重新悬浮沉淀至初体积，再在搅拌下加入0. 3-0. 7倍初体积的饱和硫酸铵溶 液，静置，再用100KD的滤膜进行抽滤，得到大于等于100KD分子量的沉淀物，用PBS溶液重 悬沉淀，得到卵黄抗体溶液；
步骤2)所述抗生素的加入量为每毫升卵黄2000-4000U。在进行100KD的滤膜抽滤前采用0. 22 μ m的滤膜过滤，取滤液。步骤3)和4)中的静置的温度为4-6°C，静置时间为10_12h。步骤5)中的PBS溶液的浓度为0. 8-1. 0%。步骤5)所述第一次加入的硫酸铵溶液的浓度为25-30%。将步骤5)得到的卵黄抗体溶液用甲醛灭活除菌。
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本发明的鸡传染性法氏囊病的卵黄抗体的提取方法，分别采用乙酸-乙酸钠缓冲 溶液、辛酸溶液及硫酸铵溶液进行提纯和净化，最终采用滤膜抽滤，减少抗体的损失和抗体 的破坏，提高了卵黄抗体的生产率，而且本发明的方法操作简单、便于生产推广应用。
具体实施例方式实施例1
本实施例的鸡传染性法氏囊病的卵黄抗体的提取方法，其步骤如下
1)将免疫鸡蛋进行清洗，然后用无菌生理盐水清洗，晾干，接着用消毒液进行42°c浸泡 20min,晾干，用95%的酒精喷洒消毒，晾干备用；
2)采用蛋黄分离器进行分离，从免疫鸡蛋中取得卵黄，打碎，加入与卵黄体积等量的无 菌生理盐水，然后按照每毫升卵黄2000U的量分别加入青霉素和链霉素，再进行打碎混勻， 得到卵黄液；
3)向卵黄液中加入pH为4.8的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，加入量为卵黄液体积的5倍 量，混勻，于4°C静置10h，取上清液；
4)向步骤3)得到的上清液加入上清液体积0.8%的辛酸，混勻，于室温静置2h，取上清
液；
5)向步骤4)得到的上清液加入0.6倍体积的25%硫酸铵溶液，4°C振荡l_2h，ISOOOr/ min离心20min，弃去上清液后，用0. 8% PBS溶液重新悬浮沉淀至初体积，再在搅拌下加入 0. 3倍初体积的饱和硫酸铵溶液，静置lh，接着用100KD的滤膜(型号MWC0)进行抽滤，得到 大于等于100KD分子量的沉淀物，用0. 8% PBS溶液重悬沉淀，得到卵黄抗体溶液；
6)用甲醛对卵黄抗体溶液灭活，防止其它垂直传染病的感染。实施例2
本实施例的鸡传染性法氏囊病的卵黄抗体的提取方法，其步骤如下
1)将免疫鸡蛋进行清洗，然后用无菌生理盐水清洗，晾干，接着用消毒液进行42°C浸泡 20min,晾干，用95%的酒精喷洒消毒，晾干备用；
2)采用蛋黄分离器进行分离，从免疫鸡蛋中取得卵黄，打碎，加入与卵黄体积等量的无 菌生理盐水，然后按照每毫升卵黄3000U的量加入青霉素和链霉素，再进行打碎混勻，得到 卵黄液；
3)向卵黄液中加入pH为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，加入量为卵黄液体积的6倍， 混勻，于5°C静置11小时，取上清液；
4)向步骤3)得到的上清液加入上清液体积0.9%的辛酸，混勻，于5°C静置2h，取上清
液；
5)向步骤4)得到的上清液加入1.0倍体积的28%硫酸铵溶液，4°C振荡l_2h，ISOOOr/ min离心20min，弃去上清液后，用0. 9% PBS溶液重新悬浮沉淀至初体积，再在搅拌下加入 0. 5倍初体积的饱和硫酸铵溶液，静置lh，接着用100KD的滤膜(型号MWC0)进行抽滤，得到 大于等于100KD分子量的沉淀物，用0. 9% PBS溶液重悬沉淀，得到卵黄抗体溶液；
6)用甲醛对卵黄抗体溶液灭活，防止其它垂直传染病的感染。实施例3
本实施例的鸡传染性法氏囊病的卵黄抗体的提取方法，其步骤如下1)将免疫鸡蛋进行清洗，然后用无菌生理盐水清洗，晾干，接着用消毒液进行42°C浸泡 20min,晾干，用95%的酒精喷洒消毒，晾干备用；
2)采用蛋黄分离器进行分离，从免疫鸡蛋中取得卵黄，打碎，加入与卵黄体积等量的无 菌生理盐水，然后按照每毫升卵黄4000U的量加入青霉素和链霉素，再进行打碎混勻，得到 卵黄液；
3)向卵黄液中加入pH为5.2的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，加入量为卵黄液体积的7倍， 混勻，于6°C静置12小时，取上清液；
4)向步骤3)得到的上清液加入上清液体积1%的辛酸，混勻，于室温静置2h，取上清
液；
5)向步骤4)得到的上清液加入1.4倍体积的30%硫酸铵溶液，4°C振荡l_2h，ISOOOr/ min离心20min，弃去上清液后，用1.0% PBS溶液重新悬浮沉淀至初体积，再在搅拌下加入 0. 7倍初体积的饱和硫酸铵溶液，静置lh，接着采用0. 22 μ m的滤膜过滤取滤液，保证滤液 中物质分子量低于200KD，再用100KD的滤膜(型号MWC0)进行抽滤，得到大于等于100KD分 子量的沉淀物，用1. 0% PBS溶液重悬沉淀，得到卵黄抗体溶液；
6)用甲醛对卵黄抗体溶液灭活，防止其它垂直传染病的感染。实验例
一、对实施例1-3和常规提取方法的卵黄抗体利用琼脂扩散凝胶试验琼脂为1. 2%， 氯化钠为8%，配制成平板，要求平板厚度为5mm，孔距为4 mm,孔径为5mm，加入量约30 μ 1， 37°C培养过夜，观察结果。结果见表1。表1各实施例效价试验结果
组别实施例1实施例2实施例3常规提取抗体效价1:641:641:321:32
二、毒性试验以实施例1的卵黄抗体为例。选取三组试验动物每组20只健康的SPF 小鸡，一组生理盐水，二组常量(lml)，三组大于治疗量(3ml)，采用完全自由饲养方式，接 种后观察两周，三组的鸡群精神比较均一，饮食欲几乎无变化。 三、攻毒试验将试验动物分成五组每 20只健康的SPF小鸡，一组生理盐水，二、 三、四组分别为实施例1、2、3的试验组，五组常规提取抗体，接种量为lml/只，采用完全自 由饲养方式，五天后，接种分离的强毒株进行攻毒，观察两周。结果见表2 表2统计抗体保护动物试验情况
权利要求
一种鸡传染性法氏囊病的鸡卵黄抗体的提取方法，其特征在于取得免疫卵黄后，打碎，分别采用乙酸 乙酸钠缓冲溶液、辛酸溶液及硫酸铵进行提纯净化，然后用滤膜过滤得到卵黄抗体。
2.根据权利要求1所述的鸡传染性法氏囊病的鸡卵黄抗体的提取方法，其特征在于 具体步骤如下1)将免疫鸡蛋进行清理、消毒，晾干备用；2)从免疫鸡蛋中取得卵黄，打碎，加入抗生素和无菌生理盐水，再进行打碎混勻，得到 卵黄液；3)向卵黄液中加入pH为4.8-5. 2的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，混勻，静置，取上清液；4)向步骤3)得到的上清液中加入占上清液0.8-1. 0%体积的辛酸，混勻，静置，取上清液；5)向步骤4)得到的上清液加入0.6-1. 4倍体积的硫酸铵溶液，震荡、离心，弃去上清液 后，用PBS溶液重新悬浮沉淀至初体积，再在搅拌下加入0. 3-0. 7倍初体积的饱和硫酸铵溶 液，静置，再用100KD的滤膜进行抽滤，得到大于等于100KD分子量的沉淀物，用PBS溶液重 悬沉淀，得到卵黄抗体溶液；
3.根据权利要求2所述的鸡传染性法氏囊病的鸡卵黄抗体的提取方法，其特征在于 步骤2)所述抗生素的加入量为每毫升卵黄2000-4000U。3.根据权利要求2所述的鸡传染性法氏囊病的鸡卵黄抗体的提取方法，其特征在于 在进行100KD的滤膜抽滤前采用0. 22 μ m的滤膜过滤，取滤液。
4.根据权利要求2所述的鸡传染性法氏囊病的鸡卵黄抗体的提取方法，其特征在于 步骤3)和4)中的静置的温度为4-60C，静置时间为10-12h。
5.根据权利要求2所述的鸡传染性法氏囊病的鸡卵黄抗体的提取方法，其特征在于 步骤5)中的PBS溶液的浓度为0. 8-1. 0%。
6.根据权利要求2所述的鸡传染性法氏囊病的鸡卵黄抗体的提取方法，其特征在于 步骤5)所述第一次加入的硫酸铵溶液的浓度为25-30%。
7.根据权利要求2所述的鸡传染性法氏囊病的鸡卵黄抗体的提取方法，其特征在于 将步骤5)得到的卵黄抗体溶液用甲醛灭活除菌。
全文摘要
本发明公开了一种鸡传染性法氏囊病的鸡卵黄抗体的提取方法，取得免疫卵黄后，打碎，分别采用乙酸-乙酸钠缓冲溶液、辛酸溶液及硫酸铵进行提纯净化，然后用滤膜过滤得到卵黄抗体。本发明的鸡传染性法氏囊病的卵黄抗体的提取方法，分别采用乙酸-乙酸钠缓冲溶液、辛酸溶液及硫酸铵溶液进行提纯和净化，最终采用滤膜抽滤，减少抗体的损失和抗体的破坏，提高了卵黄抗体的生产率，而且本发明的方法操作简单、便于生产推广应用。
文档编号C07K1/34GK101955532SQ201010514068
公开日2011年1月26日 申请日期2010年10月21日 优先权日2010年10月21日
发明者吴红云, 李建正, 郭俊清 申请人:郑州后羿制药有限公司