专利名称：一种畜禽饲料添加剂酪酪肽卵黄抗体粉的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物活性肽卵黄抗体粉的制备方法，尤其是涉及一种畜禽诱食剂酪酪肽卵黄抗体粉的制备方法。
背景技术：
酪酪肽(PYY)作为一类胃肠道衍生激素，不仅能使机体产生饱感、减少摄食和体重，而且还影响消化道生理与功能，作用机制复杂，涉及范围广泛，成为受人关注的新型食欲调控因子(欧荣娣，陈永辉，沈维军等.酪酪肽生理功能及其在哺乳母猪养殖中的应用前景[J].动物营养学报，2010，22 (5):1142-1146.)。禁食和自由采食的啮齿类动物体内的PYY浓度在摄食前下降而摄食后增加的现象说明，PYY是一个调节摄食的饱感信号。动物和人体实验均证实外周注射ΡΥΥ3_36可产生厌食作用，且摄食减少量与ΡΥΥ3_36的注射量呈剂量反应关系，长期注射可使动物体重增重减少(Maria A., Papadimitriou, Alicja A.,et al.Peptide YY3—36_induced inhibition of food intake in female monkeys.BrainResearch.2007,1175:60-65.)。肥胖病人空腹血浆PYY水平较低，摄入相同的试验餐后，肥胖对象的PYY释放低于正常对照，提示内源性PYY不足引起的摄食过量与肥胖密切相关，补充外源性ΡΥΥ3_36可能成为治疗肥胖的有效方法。研究表明，PYY及其受体对摄食具有调节作用，能使机体产生饱感，减少摄食。PYY能自由通过血脑屏障，与受体结合，将激素信号转换为神经信号，激活前黑素细胞皮质素原/苯丙胺调节转录物(P0MC/CART)神经元的表达，促进阿片黑皮质素的分泌，同时还能抑制神经肽Y/刺鼠色蛋白相关蛋白(NPY/AGRP)神经元活动，减少NPY和AGRP的分泌，从而使机体产生饱感，抑制采食(MartinN Μ，Small C J，Sajedi A, et al.Pre-obese and obese agouti mice are sensitive to theanorectic effects of peptide YY(3-36)but resistant to ghrelin.1nt JObes RelatMetab Disord.2004,28:886-893.)。理论上，通过外源注射对抑制摄食有影响的激素的抗体到血液中中和体内的某种激素，即采用抗原抗体中和的免疫技术能降低这种激素作为抑制摄食信号的能力，或者通过添加某种激素受体拮抗剂减弱激素信号从外周神经系统传到中枢神经系统的能力，就能降低这种激素的饱感作用，促进动物采食。部分研究者在上世纪50年代就已经认识到利用激素的抗体改变动物生产性能的可能性。抗体作为介导体液免疫的重要效应分子，是B细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的糖蛋白，主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性的结合，显示免疫功能。由于抗体半衰期较长，避免了蛋白质类激素在体内容易降解而难以在实际运用的不便。但是由于被中和的物质通常是内源性的，在体内不具有免疫原性，所以必须与一个适当的免疫性载体(一种大分子的内源性蛋白)进行交联，目前常用的有牛血清蛋白(BSA)，人血清蛋白(HSA)等。当这种物质与载体交联后，就要选择佐剂(维持免疫原性稳定释放并可延长免疫反应时间)来刺激中和循环物质的免疫应答，确保免疫产物包含部分针对靶物质的高特异性抗体，发挥中和体内靶物质的生物学作用。免疫调控技术利用免疫学抗原抗体中和反应原理实现对动物生产性能的调控。实质上是通过给予动物某种物质(影响动物生产性能)的外源性抗原或抗体，在动物体内发生免疫中和反应，消除或减弱内源性该种物质水平，导致该种物质正常的生理效应消失或减弱，从而达到调控动物生产性能的目的。为解决动物生产过程中，各种逆境不利条件下导致的采食量低下和生长受阻问题，本发明利用被动免疫技术，以PYY制备的抗原免疫蛋鸡后，利用其所产鸡蛋制备成卵黄抗体冻干粉，实现了既有效利用PYY抗体的生物学诱食作用，也能部分补充卵黄蛋白，同时满足了安全绿色的现代饲料添加剂的需求，成为一种非常有吸引力的生物技术产品。
发明内容
本发明所要解决的技术问题:本发明的原理是以PYY和牛血清蛋白偶联制备的完全抗原为基础，通过科学合理地制定蛋鸡免疫程序，在所产鸡蛋中提取蛋黄并冷冻干燥后制备成冻干粉，生产条件简单，无需特殊昂贵设备。所以，本发明的目的是提供一种低成本、高效价、生产工艺简单，对畜禽采食量有明显改善效果的饲料添加剂PYY卵黄抗体的制备方法。为实现上述目的，本发明采用PYY、戊二醛、牛血清蛋白、费氏不完全佐剂等为原料。其特征包括下列步骤:(I)PYY完全抗原的制备:准确称取一定质量的PYY溶解于装有PBS溶液的IOOmL烧杯中，称为A液；准确称取4倍PYY质量的牛血清蛋白(BSA)同样溶解于装有PBS溶液，称为B液的IOOmL烧杯中。A、B液PBS溶液均满足一定要求(IOmL0.01M, pH = 7.4)，然后将A液缓慢滴加到B液中，放人磁力搅拌器转子，在搅拌条件下用移液管逐滴加入100 μ L浓度为25%戊二醛溶液，密封烧杯，外层用锡箔纸包裹避光，室温下反应24小时后，将偶联物反应液全部转移到透析袋中，4°C下用PBS溶液透析24小时，中间换液两次。(2)包被抗原制备:包被抗原制备方法与PYY-BSA完全抗原的制备方法相同，以血蓝蛋白(KLH)为载体蛋白，以戊二醛为交联剂制备包被抗原PYY-KLH。(3)免疫程序:选择300日龄的健康产蛋母鸡，按照胸肌多点注射(一般4-6点)的方式进行免疫，初次免疫抗原剂量为200 μ g/只,初次免疫后每隔15天加强免疫一次,共加强免疫3次，加强免疫抗原剂量均为100 μ g/只。初次免疫时在抗原中加入等量的弗氏完全佐剂,加强免疫时则加入等量的弗式不完全佐剂。初次和加强免疫注射剂量均为0.5mL。(4)抗PYY卵黄抗体制备①卵黄样品前处理:鸡蛋打破后，除去卵白和卵黄膜，用注射器取0.3m L卵黄液于离心管中，按照卵黄液:PBS:氯仿=1: I: 2的比例分别加入PBS缓冲液和氯仿，强力振荡后，室温静置lh，然后3500r/min离心15min，取上清液，于_20°C保存待测。②卵黄粉制备:初次免疫后每周收集鸡蛋I次，抗体效价即达到1: 1600的第4周开始收集鸡蛋，效价达到1: 4096 —周后的第7周结束收集，将所采集的鸡蛋无菌分离卵黄，利用冷冻干燥机制成卵黄粉。③抗体效价检测:用间接酶联免疫吸附(ELISA)测定卵黄中抗体效价，在酶标仪上以450nm波长测定OD值，从而确定卵黄中PYY的抗体效价(以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍则为阳性。即待测卵黄在一定稀释倍数下吸光度/阴性卵黄在相同稀释倍数下吸光度> 2.1定为阳性)。表IELISA测得混合卵黄粉抗体效价
权利要求
1.一种畜禽饲料添加剂酪酪肽(PYY)卵黄抗体粉的制备方法，步骤包括: (1)PYY完全抗原的制备及鉴定:将PYY与牛血清蛋白偶联，制成PYY-BSA偶联复合物(PYY完全抗原)，经SDS-PAGE检测偶联情况。
(2)PYY-BSA偶联复合物对蛋鸡的免疫程序及其卵黄抗体制备:将(I)制得的PYY-BSA偶联复合物和弗氏佐剂混匀，充分乳化，制成油乳苗，免疫蛋鸡，收集鸡蛋，并将含PYY特异性抗体的卵黄液冷冻干燥制成PYY卵黄抗体粉。
2.权利要求(I)中所述的PYY-BSA偶联复合物的制备，其步骤包括:准确称取4mgPYY溶解于装有IOml0.0lM PBS (pH = 7.4)溶液的IOOml烧杯中，称为A液；准确称取16mg牛血清蛋白(BSA)溶解于装有IOml0.0lM PBS (pH = 7.4)溶液的IOOml烧杯中，称为B液。然后将A液缓慢滴加到B液中，放人磁力搅拌器转子，在搅拌条件下用移液管逐滴加入IOOul浓度为25%戊二醛溶液，密封烧杯，外层用锡箔纸包裹避光，室温下反应24小时。将偶联物反应液全部转移到透析袋中，4°C下用PBS (pH值7.4)透析24小时，中间换液两次。将制备好的完全抗原分装，_20°C保存备用。采用SDS-PAGE凝胶电泳方法检测偶联程度:取少量冻干复合物，溶于Ph = 7.40.005M PBS，在制好的浓缩胶上，一次每空加入5uL上述物质，开始SDS-PAGE凝胶电泳。
3.权利要求(2)中所述的PYY-BSA偶联复合物与弗氏佐剂混合制备的PYY油乳苗对蛋鸡的免疫程序及利用所产鸡蛋提取制备PYY卵黄抗体过程，其步骤包括:选择300日龄的健康产蛋母鸡，按照胸肌多点注射(一般4-6点)的方式进行免疫，初次免疫抗原剂量为200ug/只，初次免疫后每隔15天加强免疫一次，共加强免疫3次，加强免疫抗原剂量均为IOOug/只。初次免疫时在抗原中加入等量的弗氏完全佐剂，加强免疫时则加入等量的弗式不完全佐剂。初次和加强免疫注射剂量均为0.5ml。免疫后经ELISA检测卵黄抗体效价，呈阳性时收集鸡蛋直至呈阴性时停止收集，无菌分离卵黄，利用冷冻干燥机制成卵黄粉。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种畜禽饲料添加剂酪酪肽卵黄抗体粉及其制备方法，该方法生产工艺简单，使用方便，对提高动物采食量效果明显，其制备主要包括下列步骤酪酪肽完全抗原的制备、酪酪肽免疫油乳苗的制备和酪酪肽对蛋鸡特异性免疫及其卵黄抗体粉的制备。本发明方法所制备的酪酪肽卵黄抗体效价高，维持时间长，耐保存，安全无毒无污染，符合资源节约与环境友好的可持续性畜牧业发展需求。因此，本发明所制得的酪酪肽卵黄抗体是一种可有效增加食欲，提高采食量，促进动物生长的安全绿色饲料添加剂产品。
文档编号C07K16/26GK103168924SQ20131005177
公开日2013年6月26日 申请日期2013年2月1日 优先权日2013年2月1日
发明者范志勇, 田启宇, 李玉莲, 吴信, 龙次民 申请人:湖南农业大学