专利名称：日本血吸虫单克隆抗独特型抗体np30单特异性双链抗体及其制备方法、应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗 体及其制备方法、应用，是利用基因工程技术制备日本血吸虫单克隆抗独特型抗 体NP30单特异性双链抗体，应用overlap PCR法扩增双链抗体基因 VH-linker-VL(Diabody,简称D)， linker长度选用5个氨基酸残基，序列为GGGGS， 强迫两个scFv分子互相形成VH和VL配对，以非共价键结合而形成的二聚体, 被称为双链抗体。该抗体可以用于急性血吸虫感染的治疗，以及血吸虫病的免疫 保护。
背景技术：
危害人体的血吸虫主要有日本血吸虫、埃及血吸虫和曼氏血吸虫三种，主 要分别分布于亚洲(东部和南部)、非洲和南美洲广大地区，患病人数约2亿左 右.在我国流行的是日本血吸虫病，分布在长江流域及其以南的十二个省、市、 自治区。解放时全国约有一千余万患者， 一亿人口受到本病威胁，有螺面积143 亿平方米，是危害农民健康最严重的寄生虫病。我国血吸虫病防治工作取得了 很大成绩。但目前长江中下游江湖洲滩地区及大山区的防治任务仍很艰巨，少部 分地区血吸虫病疫情有回升、扩展趋势，所以血吸虫病被列为我国"十一五" 期间重点防治的重大传染病。目前受血吸虫感染威胁人口约1亿，有现症病人 84万，作为重要传染源的牛、羊、猪也有数千万头，所以血吸虫病的防治任务 非常艰巨。
目前血吸虫病的治疗以吡喹酮化疗为主，虽然吡喹酮的治疗可取得可靠疗 效，但急性血吸虫感染的死亡时有发生，慢性血吸虫病肝脏纤维化尚无有效的治 疗方法,可引起显著的门脉高压，由此导致的上消化道出血、脾肿大、腹水，是 引起患者死亡、丧失劳动力的主要原因。另外，吡喹酮长期应用还有可能诱发抗 药虫株。因此，血吸虫病的治疗仍然存在很多问题，直接影响国家的投资环境， 影响和谐社会和小康社会的建设。所以，探索新的高效低毒的血吸虫病治疗药物 就显得尤为重要。
Olds根据抗独特型抗体的免疫调节作用，将抗独特型抗体用于曼氏血吸虫 急性感染的治疗，研究结果表明抗独特型抗体可降低急性虫卵肉芽肿反应和急性 血吸虫感染的死亡率，提示抗独特型抗体有可能用于急性血吸虫感染的治疗。
一株日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30，为肠相关抗原(GAA)的内影像 抗独特型抗体，具有模拟抗原的作用，可替代虫源抗原用于血吸虫病免疫诊断和 疫苗的研究。研制的血吸虫病NP30抗体检测试剂盒已列入科技部推广计划，现 场应用达200万人次。应用NP30主动免疫昆明种、C57BL/6、 BALB/c小鼠，对 尾蚴攻击感染可分别诱导50.46%、 42.05°/。、 39.53%的保护力，主动免疫山羊， 也可诱导42.86%的保护力，并对虫卵肉芽肿和肝纤维化具有负调节作用，可明 显减轻血吸虫病造成的宿主免疫病理损害，证明NP30具有抗感染免疫和抗病免 疫的双重功效。NP30也是我国唯一应用细胞工程技术制备的血吸虫病疫苗候选 分子。
ScFv多聚体是通过将单链抗体的连接肽縮短至12个氨基酸以下而构成的一 种新型小分子抗体,由单链抗体聚合为二聚体(Diabodies)、三聚体(Tribodies)等形 式,使抗原结合价增加、亲和力得到提高、功能多样,具有广阔的应用前景。曰本 血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体可以用于急性血吸虫感染 的治疗，以及血吸虫病的免疫保护。
发明内容
本发明目的是针对上述不足之处提供一种日本血吸虫单克隆抗独特型抗体 NP30单特异性双链抗体及其制备方法、应用，是利用基因工程技术制备日本血 吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体，应用overlap PCR法扩增双 链抗体基因VH-linker-VL(Diabody，简称D), linker长度选用5个氨基酸残基，序 列为GGGGS,强迫两个scFv分子互相形成Vh和Vl配对，以非共价键结合而 形成的二聚体，被称为双链抗体。该抗体可以用于急性血吸虫感染的治疗，以及 血吸虫病的免疫保护。
曰本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体及其制备方法、应
用是采取以下方案实现
日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体，即两个scFv 分子互相形成VH和VL配对，以非共价键结合而形成的二聚体，由228个氨
基酸组成，其氨基酸序列为
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Arg He Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala Gly Met Gin Trp Val Gln Lys Met Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp lie Gly Trp lie Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln lie Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Arg Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Asn Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Val Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu lie Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr He Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 。
日本血吸虫单克隆抗独特型抗体np30单特异性双链抗体的制备方法是采
取以下步骤实施的
1. NP30双链抗体的基因构建 构建双链抗体基因VH-linker-VL(D)， Vh-Vl方向，采用OverlapPCR方法扩增
(1) PCR扩增vh-linker根据已知的NP30的Vh基因序列，设计上下游引物， Formed: 5， C GAG CTC GGATCC CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTG 3,， Reserve 1: 5， CTCAGAACCACCGCCACCTGAGGAGACAGTGACTGTGG 3，， linker长度为5个氨基酸，上游引入SacI BamHI酶切位点。以pMD18-T-Vh为模 板,反应体系为25d,扩增目的片段，具体条件为95'C 4min预变性，94'C 30 s, 56 °C 30s,72°C 30s共30个循环，72°C 10min终末延伸。产物用琼脂糖凝胶电泳 观察，用胶回收试剂盒回收。
(2) PCR扩增linker- VL根据已知的NP30的Vl基因序列，设计上下游引
物，Fo誕r2: 5， TCAGGTGGCGGTGGTTCTGAGAATCTGCTCACCCAGTCTCC
Reserve2:5' GGAATTCC AGGACCGCCTCCTGGTTTC AGTTCC AGCTTGGTCC 3'，下游引入EcoRI酶切位点。以pMD18-T-Vt为模板，扩增并回收目的片段， 方法同上。
(3) Overlap PCR法扩增VH-linker-VL 将纯化后的VH-linker、 linker-VL等 物质的量混合，各以0.5，加入10XBuffer 5 ul ， 25 mmol/L M gCl2 3 ul, 2.5mmol/L dNTPs 4 ul, 5 U/ul Ex Taq 0.5 ul. ddH20 32.5 ul， 95 °C 4m in预变性，94 °C 30 s, 45 °C 30 s, 72°C 60 s , 8个循环后，再加入Formed 、 Reserve2引物各2ul，总 体积为50ul，94 °C 30 s, 56°C 30 s， 72 °C lmin,进行22个循环后72 °C 10 m in。产物以琼脂糖凝胶电泳观察，用胶回收试剂盒回收。
(4) 双链抗体基因的序列分析将回收的D基因与pMD18-T vector连接，转 化E. coli DH5a,蓝白斑挑选阳性克隆，经菌落PCR鉴定后测序。测序结果与 NP30已知序列完全匹配。
GAG ACA GTC AGG ATC TCC TGC AAG GCT TCT GGG TAT ACC TTC ACA
AAG TGG ATT GGC TGG ATA AAC ACC CAC TCT GGA GTG CCA AAA TAT GCA GAA GAC TTC AAG GGA CGG TTT GCC TTC TCT TTG GAA ACC TCT GCC AGC ACT GCA TAT TTA CAG ATA AGC AAC CTC AAA AAT GAG GAC ACG GCT ACG TAT TTC TGT GCG AGA TCA AGG GAC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC ACA GTC ACT GTC TCC TCA GGT GGC GGT GGT TCT GAG AAT CTG CTC ACC CAG TCT CCA GCA ATC ATG TCT GCA
GTT AGT TAC GTT TAC TGG TAC CTG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GTT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG
GAA CTG AAA
2. pBAD/glll A -D重组表达质粒的构建
pMD18-T - D质粒，用Sacl、 EcoRI双酶切后，将D基因片段与经过同样双 酶切的pBAD/glll A进行粘端连接，连接产物转化E. coli TOP10F', SacI、EcoRI 双酶切鉴定pBAD/glll A-D重组质粒。
3. NP30双链抗体的诱导表达和表达产物的纯化
(1) NP30双链抗体的诱导表达和Westernblot鉴定将pBAD/glll A -D转化 菌株E. coli TOP10F',挑取单克隆菌落在含终浓度100 mg/L氨苄青霉素的SB 培养基中37 'C培养过夜，按1 : 100转接于含相同浓度氨苄青霉素的培养液中 继续培养到A6。Qnm" 1.0，加入终浓度为0.02%的左旋阿拉伯糖23。C诱导20h, 以空载质粒表达菌的菌液作为对照,10% SDS-PAGE初步分析重组质粒的表达。 10% SDS-PAGE电泳分离后，采用电转移装置，恒流300mA,90min,将电泳后凝 胶上的蛋白成分转移到硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶封闭，HRP标记的抗His 抗体处理,DAB显色。
(2) NP30双链抗体纯化 左旋阿拉伯糖诱导的培养液经离心回收菌体，用含 有20mmol/L咪唑的磷酸盐缓冲液重悬，超声碎菌.离心，超声上清用H is-T rap 镍亲合层析柱纯化，不同咪唑浓度的磷酸盐缓冲液梯度洗脱，300mmol/L咪唑 洗脱得到比较纯的NP30双链抗体，大小在34kD左右，即获得日本血吸虫单克 隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体。
将纯化的NP30双链抗体用50 mmol/L的碳酸盐(PH9.6)倍比稀释后包被酶 联板，分别加入血吸虫病人血清及正常人血清，孵育洗涤，然后加入辣根过氧化 物酶(HRP)标记的鼠源NP30单抗，孵育洗涤显色，双抗夹心法检测血吸虫病 人血清及正常人血清，结果显示，NP30双链抗体能与血吸虫病人血清反应，不 与正常人血清反应，说明该双链抗体有较高的敏感性和特异性。
日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体在制备检测急性 血吸虫抗体、抗原制剂，血吸虫病免疫保护及免疫治疗药物中的应用。
本发明的优点
血吸虫病是我国"十一五"期间重点防治的人畜共患病。目前血吸虫病的治 疗以吡喹酮化疗为主，虽然吡喹酮的治疗可取得可靠疗效，但急性血吸虫感染的 死亡时有发生，慢性血吸虫病肝纤维化尚无有效治疗方法。国内外血吸虫病疫苗 经半个多世纪的研究，发现了一些疫苗候选分子，但对小鼠仅可诱导部分保护力， 迄今还没有一种血吸虫病疫苗上市。
一株日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30，为肠相关抗原(GAA)的内影像 抗独特型抗体，具有模拟抗原的作用，可替代虫源抗原用于血吸虫病免疫诊断和 疫苗的研究。研制的血吸虫病NP30抗体检测试剂盒已列入科技部推广计划，现 场应用达200万人次。应用NP30主动免疫昆明种、C57BL/6、 BALB/c小鼠， 对尾蚴攻击感染可分别诱导50.46%、 42.05%、 39.53%的保护力，主动免疫山羊， 也可诱导42.86%的保护力，并对虫卵肉芽肿和肝纤维化具有负调节作用，可明 显减轻血吸虫病造成的宿主免疫病理损害，证明NP30具有抗感染免疫和抗病免 疫的双重功效。NP30也是我国唯一应用细胞工程技术制备的血吸虫病疫苗候选 分子。
但NP30为鼠源性单抗，作为异种蛋白用于人体可引起免疫反应，产生人抗小 鼠抗体(human anti-mouse antibody, HAMA)，可中和继之接种的单抗，或诱发 过敏反应。本发明日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体 Diabodies由两种相同ScFv分子构成，具有双特异性,具有以下优点
(1) 由于体积小,最大限度地降低宿主的抗异源抗体反应。
(2) Fc区的缺失减少了与FcR阳性细胞发生非特异性结合的机会。
(3) 分子量小，有利于穿透组织，到达治疗靶点。
(4) 具有双结合价，可同时与细胞膜上相邻的两个靶抗原结合，提高了亲和力。
以下将结合附图对本发明作进一步说明。 图1是用培养的鼠源NP30杂交瘤细胞提取的RNA。
图2是PCR扩增的VH-linker， linker-VL,，大小分别是366bp和333bp.M:核酸
标准分子量(TaKaRa DL2000)。
图3是overiapPCR扩增的双链抗体基因，大小是684bp. M:核酸标准分子量 (TaKaRa DL2000)。
图4是构建成功的重组质粒双酶切图，大片段为酶切的pBAD/gl11 A片段， 小片段为酶切成功的双链抗体基因片段diabody。
图5是表达双链抗体的重组菌SDS-PAGE分析结果，图示1为表达双链抗体 的重组菌超声上清，2为超声沉淀，可见双链抗体主要在超声沉淀中表达，而超 声上清中表达量较少，M:低分子量蛋白标准(Fermentas)。
图6是表达双链抗体纯化后的SDS-PAGE分析结果，300mM咪唑洗脱条件下得 到的蛋白较纯，M:低分子量蛋白标准(Fermentas)。
具体实施例方式
本发明实施方式的详细说明
日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体的表达
应用overlap PCR法扩增双链抗体基因VH-linker-VL(Diabody,简称D),将该基 因与pBAD/glIIA载体进行SacI、 EcoRI双酶切，连接，构件重组质粒pBAD/gl11 A -D。将重组质粒转化E.coli TOP10F'，表达NP30单特异性双链抗体。 SDS-PAGE以及Westernblot鉴定结果，该蛋白比以包涵体和可溶性两种形式存 在。
材料与方法
1. 菌种与质粒E.coli TOP10F'，本室保存。pMD18-T-Vn、 pMD18-T-VL质 粒，其中分别克隆有NP30可变区轻链(VL)和重链(VH )基因，pBAD/glll质粒
本室保存。
2. 工具酶与生化试剂 PCR试齐l」，ExTaq酶，DL 2000 DNA Marker,小量胶回收 纯化试剂盒和pMD18-T载体系统，T4 DNA连接酶等购自大连宝生物公司，限 制性核酸内切酶Sacl、 EcoRI购自大连宝生物公司，H is-T rap镍亲合层析柱纯化 购自GE Healthcare公司;其它均为进口分装或国产分析纯试剂。
3. 引物的合成由南京金思特公司合成。
4. 基因克隆的方法PCR; DNA的酶切、连接、电泳；质粒的提取、转化；蛋
白的SDS-PAGE等一般分子克隆方法按常规方法进行。其它试剂盒按说明书进
行操作。
5. DNA序列分析由南京基天生物公司测序。
结果
1. NP30单特异性双链抗体的基因构建 构建双链抗体基因VH-linker-VL(D)， V『Vl方向，采用OverlapPCR方法扩增。
(1) PCR扩增VH-linker根据已知的NP30的Vh基因序列，设计上下游引物， Formed: 5， C GAG CTC GGATCC CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTG 3'， Reserve 1: 5， CTCAGAACCACCGCCACCTGAGGAGACAGTGACTGTGG 3，， linker长度为5个氨基酸，上游引入SacI BamHI酶切位点。以pMD18-T-Vh为模 板,反应体系为25ul，扩增目的片段，具体条件为95t: 4min预变性，94'C 30 s, 56 °C 30s，72。C 30 s共30个循环，72°C 10min终末延伸。产物用琼脂糖凝胶电泳 观察，用胶回收试剂盒回收。
(2) PCR扩增linker- VL根据已知的NP30的Vl基因序列，设计上下游引 物，Former2: 5， TCAGGTGGCGGTGGTTCTGAGAATCTGCTCACCCAGTCTCC 3， ， Reserve2: 5'GGAATTCCAGGACCGCCTCCTGGTTTCAGTTCCAGCTTGGTCC 3，，下游引 入EcoRI酶切位点。以pMD18-T-Vi为模板，扩增并回收目的片段，方法同上。
(3 ) Overlap PCR法扩增VH-linker-VL 将纯化后的VH-linker、 linker-VL等 物质的量混合，各以0.5,加入10XBuffer 5 ul ， 25 mmol/LM gCl2 3 ul ， 2.5mmol/L dNTPs 4 ul, 5 U/ul Ex Taq 0.5 ul. ddH20 32.5 ul， 95 °C 4m in预变性，94 °C 30 s, 45 °C 30 s， 72°C 60 s ， 8个循环后，再加入Formerl、 Reserve2引物各2 ul ，总 体积为50ul，94 °C 30s，56°C 30 s， 72 °C lmin,进行22个循环后72 °C 10 m in。产物以琼脂糖凝胶电泳观察，用胶回收试剂盒回收。
(4)双链抗体基因的序列分析将回收的D基因与pMD18-T vector连接，转 化E. coli DH5a,蓝白斑挑选阳性克隆，经菌落PCR鉴定后测序。测序结果与
NP30已知序列完全匹配。
CAG GTACAGCTGGTGGAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACA GTC
AGG ATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAACTGCTGGAATGCAG TGG
GTG CAAAAGATGCCAGGAAAGGGTTTGAAGTGGATTGGCTGGATAAACACC CAC
TCT GGAGTGCCAAAATATGCAGAAGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCT TTG
GAA ACCTCTGCCAGCACTGCATATTTACAGATAAGCAACCTCAAAAATGAG GAC
ACG GCTACGTATTTCTGTGCGAGATCAAGGGACTATGCTATGGACTACTGG GGT
CAA GGAACCACAGTCACTGTCTCCTCAGGTGGCGGTGGTTCTGAGAATCTG CTC
ACC CAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATG ACC
TGC AGTGCCAGCTCAAGTGTTAGTTACGTTTACTGGTACCTGCAGAAGCCA GGA
TCC TCCCCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTC CCT
GTT CGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGC CGA
ATG GAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGACTAGTTAC CCA
TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACC AAG CTG GAA CTG AAA
2. pBAD/glIIA-D重组表达质粒的构建及鉴定
pMD18-T - D质粒，用Sacl、 EcoRI双酶切后,将D基因片段与经过同样双 酶切的pBAD/glll A进行粘端连接，连接产物转化E. coli TOPI OF', Sacl、 EcoRI 双酶切鉴定pBAD/glll A -D重组质粒。
3. NP30双链抗体的诱导表达及鉴定
将pBAD/glll A -D转化菌株E. coli TOP10F',挑取单克隆菌落在含终浓度100 mg/L氨苄青霉素的SB培养基中37 'C培养过夜，按1 : 100转接于含相同浓度 氨苄青霉素的培养液中继续培养到A , nm" 1.0，加入终浓度为0.02%的左旋 阿拉伯糖23'C诱导20h，以空载质粒表达菌的菌液作为对照,10% SDS-PAGE初 步分析重组质粒的表达。10% SDS-PAGE电泳分离后，采用电转移装置，恒流300 mA，90min，将电泳后凝胶上的蛋白成分转移到硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶封 闭，HRP标记的抗His抗体处理，DAB显色。结果显显示条带在34kD大小的位 置。
表达NP30单特异性双链抗体的纯化
材料和方法
1. 主要试剂
Imidazole为Promega公司的产品。其他试剂为国产或进口分析纯试剂。
2. 表达NP30单特异性双链抗体的超声裂解 将培养的表达NP30单特异性双链抗体的工程菌离心(8000rpm,15min,4°C)， 弃上清,菌体重悬于原培养液1/10体积的裂解液(50mmol/L磷酸盐缓冲液， 0.5mol/L NaCl，20mmol/L Imidazole,PH 7.4)内，冰浴超声破菌10min,离心
(12000rpm，15min，4。C)，收集超声上清。
3. H is-T rap镍亲合层析柱纯化
将His-Tmp镍亲合层析柱连接至常压层析系统，先用水冲洗，再用平衡缓冲 液(50mmol/L磷酸盐缓冲液，0.5mol/L NaCl，20mmol/L Imidazole，PH 7.4)冲洗平 衡，然后将上步获得的超声上清直接上样，上样流速为lml/min，上样后用平衡 缓冲液冲洗，然后依次用含有50、 100、 200、 300、 400、 500 mmol/L Imidazole 的磷酸盐缓冲液洗脱，收集各个浓度的洗脱峰蛋白。用10%的SDS-PAGE检测 各洗脱峰蛋白，确定哪个组分含有目的蛋白。 结果
H is-T mp镍亲合层析柱纯化血吸虫NP30单特异性双链抗体
将各个浓度Imidazole洗脱的各峰蛋白进行SDS-PAGE分析显示，血吸虫 NP30单特异性双链抗体主要存在300mmol/L Imidazole洗脱峰内，有很高的纯度； 在IOO、 200mmol/LImidazole洗脱峰内也有蛋白，但是有其它杂蛋白。
纯化血吸虫NP30单特异性双链抗体的鉴定及应用 将纯化的血吸虫NP30单特异性双链抗体用做抗体，双抗体夹心法检测血吸 虫病人血清及正常人血清，以鉴定该双链抗体的敏感性和特异性。实验结果显示， 该双链抗体有较好的敏感性和特异性。
材料和方法
1. 血吸虫病人血清由无锡江苏省血吸虫防治所等单位提供。
2. 酶联反应材料酶联板为南京产96孔板，辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠 源NP30单抗为本实验室自己制备。其它材料为酶联反应的常规材料。
ELISA试验采用双抗体夹心法检测纯化的NP30单特异性双链抗体。基本 步骤为用50 mmol/L的碳酸盐(PH9.6)倍比稀释纯化蛋白包被酶联板，每 孔100ul， 4'C过夜。次日5。/。脱脂牛奶PBST缓冲液封闭，200ul/孔，37。C孵 育2h。将血吸虫病人血清用PBST1: 100稀释依次加入待检孔，空白对照 (10mmol/L磷酸盐缓冲液、pH7. 4)及阴性对照(正常人血清血吸虫病人血清 PBST1: 100稀释)加至对应孔中，每孔100 y 1，室温孵育2h。 0. 05%的PBST 液用洗板机洗5遍后加500 p g/ml的辣根过氧化物酶标记的鼠源NP30抗体， 100ul/孔，室温反应lh， PBST洗5遍，加底物TMB溶液100u 1，室温避光 显色10min，加50ul 2M硫酸混匀终止反应，用Multiskan Spectrum Micr叩late酶标仪测定A柳值。
结果
双抗体夹心法ELISA实验结果显示，纯化的双链抗体能与血吸虫病人血 清呈阳性反应，而与正常人血清不反应。
纯化双链抗体的ELISA实验结果(A450)
ABCDEFGH
0. 001 -O. 0010. 003 0. 0250. 679 0. 6240.415 0. 4020. 304 0. 3150. 234 0. 2150. 148 0. 1330.018 0. 014
A:空白对照B:阴性对照C H: 1: 2倍稀释的双链抗体
日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体蛋白序列表 <110〉南京医科大学
<120>日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体及其制备方法、 应用
<160〉 2 <210〉 1 <211〉 228 <212> PRT <213〉人工序列 〈220〉
〈223〉日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体，即两个scFv分 子互相形成Vh和V^配对，以非共价键结合而形成的二聚体，由228个氨基酸组成.
<400〉 1 Gln Val Gln 1
Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro
5
10
Gly 15
Glu Thr Val Arg lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30
Thr Ala Gly Met Gln Trp Val Gln Lys Met Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Lys Trp lie Ala Glu Asp
Gly Phe
Trp 50 Lys 65
lie Gly
Asn Thr Arg Phe
His Ala
Ser 55 Phe 70
Gly Ser
Val Pro Leu Glu
Lys Thr
Tyr 60 Ser 75
Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln lie Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Arg Asp Tyr Ala Met Asp
95 100 105
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
110 115 120
Gly Ser Glu Asn Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala lie Met Ser Ala
125 130 135
Ser Pro Gly Glu Lys Val 140
Val Ser Tyr Val Tyr Trp 155
Arg Leu Leu lie Tyr Asp 170
Val Arg Phe Ser Gly Ser 185
lie Ser Arg Met Glu Ala 200
Gin Trp Thr Ser Tyr Pro 215
Glu Leu Lys 228
〈210〉 2 〈211〉 684 〈212〉腿 <213〉人工序列
〈220〉 〈221〉 CDS 〈222〉 (l)... (684)
<220>
<221> V一region 〈222〉 (1)…(351)
〈223〉日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体重链可变区基因 序列。
<220〉
<221〉 N一region 〈222〉 (352)...(366)
〈223〉日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体linker部分基 因序列。
〈220〉
〈221〉 V—region
Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser
145 150
Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro
160 165
Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
175 180
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr
190 195
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin
205 210
Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 220 225<222〉 (366). . (684)
〈223〉日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体轻链可变区基因 序列。
<400〉 2
CAG GTA CAG CTG GTG GAG TCT GGA CCT GAG CTG AAG AAG CCT GGA 45 Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15
GAG ACA GTC AGG ATC TCC TGC AAG GCT TCT GGG TAT ACC TTC ACA 90 Glu Thr Val Arg lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30
ACT GCT GGA ATG CAG TGG GTG CAA AAG ATG CCA GGA AAG GGT TTG 135 Thr Ala Gly Met Gin Trp Val Gin Lys Met Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
AAG TGG ATT GGC TGG ATA AAC ACC CAC TCT GGA GTG CCA AAA TAT 180 Lys Trp lie Gly Trp lie Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr 50 55 60
GCA GAA GAC TTC AAG GGA CGG TTT GCC TTC TCT TTG GAA ACC TCT 225 Ala Glu Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser 65 70 75
GCC AGC ACT GCA TAT TTA CAG ATA AGC AAC CTC AAA AAT GAG GAC 270 Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gin lie Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp 80 85 90
ACG GCT ACG TAT TTC TGT GCG AGA TCA AGG GAC TAT GCT ATG GAC 315 Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Arg Asp Tyr Ala Met Asp 95 100 105
TAC TGG GGT CAA GGA ACC ACA GTC ACT GTC TCC TCA GGT GGC GGT 360 Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 110 115 120
GGT TCT GAG AAT CTG CTC ACC CAG TCT CCA GCA ATC ATG TCT GCA 405 Gly Ser Glu Asn Leu Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Met Ser Ala 125 130 135
TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT 450 Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser 140 145 150
GTT AGT TAC GTT TAC TGG TAC CTG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC 495 Val Ser Tyr Val Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro 155 160 165
AGA CTC CTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT 540 Arg Leu Leu lie Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 170 175 180
GTT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA 585 Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr 185 190 195
ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG 630 lie Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin 200 205 210
CAG TGG ACT AGT TAC CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACC AAG CTG 675 Gin Trp Thr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 215 220 225
GAA CTG AAA 684 Glu Leu Lys 228
权利要求
1.日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体，即两个scFv分子互相形成VH和VL配对，以非共价键结合而形成的二聚体，由228个氨基酸组成，其氨基酸序列为Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Arg IleSer Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala Gly Met Gln Trp Val GlnLys MetPro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Ile Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys TyrAla Glu Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala TyrLeu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ser ArgAsp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly GlyGly Ser Glu Asn Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu LysVal Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Val Tyr Trp Tyr Leu Gln LysPro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val ProVal Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met GluAla Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe GlySer Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys。
2.权利要求1所述的日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗 体的制备方法，该抗体是利用基因工程技术制备，具体方法如下 NP30双链抗体的基因构建构建双链抗体基因VH-linker-VL(D)， Vh-Vl方向，采用OverlapPCR方法扩增。(1) PCR扩增vh-linker根据已知的NP30的Vh基因序列，设计上下游引物， Formed: 5， CGAGCTCGGATCCCAGGTACAGCTGGTGGAGTCTG 3,， Reservel: 5' CTCAGAACCACCGCCACCTGAGGAGACAGTGACTGTGG 3， ， linker长度为 5个氨基酸，上游引入SacI BamHI酶切位点。以pMD18-T-Vh为模板,反应体系 为25ul，扩增目的片段，具体条件为95。C 4min预变性，94°C 30 s, 56°C 30 s ，72 °C 30s共30个循环，72°C lOmin终末延伸。产物用琼脂糖凝胶电泳观察，用胶 回收试剂盒回收； (2) PCR扩增linker- VL根据已知的NP30的Vl基因序列，设计上下游引 物，Former2: 5'TCAGGTGGCGGTGGTTCTGAGAATCTGCTCACCCAGTCTCCReserve2:5，GGAATTCCAGGACCGCCTCCTGGTTTCAGTTCCAGCTTGGTCC 3'，下游引入EcoRI酶切位点。以pMD18-T-Vt为模板，扩增并回收目的片段， 方法同上；(3 ) Overlap PCR法扩增VH-linker-VL 将纯化后的VH-linker、 linker-VL等 物质的量混合，各以0.5，加入10X Buffer 5 ul ， 25 mmol/L M gCl2 3 ul, 2.5mmol/L dNTPs 4 ul, 5 U/ul Ex Taq 0.5 ul. ddH20 32.5 ul， 95 °C 4m in预变性，94 。C 30 s, 45 °C 30 s, 72°C 60 s ， 8个循环后，再加入Formed 、 Reserve2引物各2 ul,总 体积为50ul，94 °C 30 s, 56°C 30 s, 72 °C lmin，进行22个循环后72 °C 10 m in。产物以琼脂糖凝胶电泳观察，用胶回收试剂盒回收；(4)双链抗体基因的序列分析将回收的D基因与pMD18-T vector连接，转 化E. coli DH5a,蓝白斑挑选阳性克隆，经菌落PCR鉴定后测序。测序结果与 NP30已知序列完全匹配；GAG ACA GTC AGG ATC TCC TGC AAG GCT TCT GGG TAT ACC TTC ACAAAG TGG ATT GGC TGG ATA AAC ACC CAC TCT GGA GTG CCA AAA TAT GCA GAA GAC TTC AAG GGA CGG TTT GCC TTC TCT TTG GAA ACC TCT GCC AGC ACT GCA TAT TTA CAG ATA AGC AAC CTC AAA AAT GAG GAC ACG GCT ACG TAT TTC TGT GCG AGA TCA AGG GAC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC ACA GTC ACT GTC TCC TCA GGT GGC GGT GGT TCT GAG AAT CTG CTC ACC CAG TCT CCA GCA ATC ATG TCT GCAGTT AGT TAC GTT TAC TGG TAC CTG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GTT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG ACT AGT TAC CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACC AAG CTG GAA CTG AAApBAD/glll A -D重组表达质粒的构建 pMD18-T - D质粒，用Sacl、 EcoRI双酶 切后,将D基因片段与经过同样双酶切的pBAD/glIIA进行粘端连接，连接产物 转化E. coli TOP10F' ，SacI、 EcoRI双酶切鉴定pBAD/glll A-D重组质粒；NP30双链抗体的诱导表达和表达产物的纯化(1 ) NP30双链抗体的诱导表达和Westernblot鉴定将pBAD/glll A -D转化 菌株E. coli TOP10F'，挑取单克隆菌落在含终浓度100 mg/L氨苄青霉素的SB 培养基中37 'C培养过夜，按1 : 100转接于含相同浓度氨苄青霉素的培养液中 继续培养到A,nm" 1.0,加入终浓度为0.02%的左旋阿拉伯糖23。C诱导20h, 以空载质粒表达菌的菌液作为对照,10% SDS-PAGE初步分析重组质粒的表达。 10% SDS-PAGE电泳分离后，采用电转移装置，恒流300mA,90min,将电泳后凝 胶上的蛋白成分转移到硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶封闭，HRP标记的抗His 抗体处理,DAB显色。(2) NP30双链抗体纯化左旋阿拉伯糖诱导的培养液经离心回收菌体,用含 有20mmol/L咪唑的磷酸盐缓冲液重悬，超声碎菌.离心，超声上清用H is-T rap 镍亲合层析柱纯化，不同咪唑浓度的磷酸盐缓冲液梯度洗脱，300mmol/L咪唑 洗脱得到比较纯的NP30双链抗体，大小在34kD左右，即获得日本血吸虫单克 隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体。
3.权利要求1所述的日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链 抗体在制备检测急性血吸虫抗体、抗原制剂，血吸虫病免疫保护及免疫治疗药物 中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体及其制备方法、应用，属于基因工程技术和制备免疫治疗药物领域。本发明是利用基因工程技术制备日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体，应用overlap PCR法扩增双链抗体基因V<sub>H</sub>-linker-V<sub>L</sub>(Diabody，简称D)，linker长度选用5个氨基酸残基，序列为GGGGS，强迫两个scFv分子互相形成V<sub>H</sub>和V<sub>L</sub>配对，以非共价键结合而形成的二聚体，被称为双链抗体。该抗体可以用于急性血吸虫感染的治疗，以及血吸虫病的免疫保护。
文档编号A61P33/12GK101367876SQ20081015715
公开日2009年2月18日 申请日期2008年9月25日 优先权日2008年9月25日
发明者冯振卿, 奇 唐, 进 朱, 朱晓娟, 管晓虹, 静 许 申请人:南京医科大学