一种北沙参多糖中单糖组成的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种北沙参多糖中单糖组成的测定方法，属于中药技术领域。
【背景技术】
[0002] 北沙参Radix Glehniae来源于伞形科植物珊瑚菜67eAwiaJiiioraJisFr. Schmidt ex Miq.的根，是山东道地药材之一，多糖是其主要成分，总糖含量达70%以上，多 糖具有抗肿瘤、抗氧化、提高免疫力，抗衰老等多种生物活性。多糖的生物活性与其结构密 切相关，多糖中单糖的连接顺序，连接位置，糖苷键的类型以及单糖的种类，都会影响其生 物活性，多糖中的单糖组成测定对于其生物活性的研究十分必要。目前北沙参多糖中单糖 组成的研究较少，任浩娜等采用柱前衍生化HPLC法测定了北沙参中粗多糖的单糖组成，北 沙参中均一多糖的单糖组成研究未见相关报道。
[0003] 在多糖的组成分析中，目前多采用水解后，直接使用液相色谱蒸发光散射检测器 测定，或者衍生化后使用液相色谱紫外检测器、气相色谱氢火焰检测器和气相色谱质谱联 用总离子流测定，这些方法信噪比较低，选择性较差，目标峰易受到杂质干扰，影响分析结 果的准确性。
【发明内容】
[0004] 针对上述现有技术，为准确测定北沙参多糖中的单糖组成，本发明拟采用GC-MS/ S頂法对北沙参粗多糖和均一多糖中的单糖组成进行测定。GC-MS/S頂法采用目标化合物 的特征碎片离子进行检测，排除了杂质干扰，即使目标化合物与杂质未达到完全色谱分离 也可进行检测，大大提高了检测的选择性、灵敏度和信噪比。 本发明是通过以下技术方案实现的： 气质联用仪条件 色谱条件：色谱柱为岛津Rxi_5MS石英毛细管柱（30 mX0.25 umX0.25 mm);进样口 温度250°(：，分流比：99:1，程序升温：初始温度160°(：，1°〇1^11 1以后升到195°(：，保持15 111；[11，5°0111；[111升到 230<€，保持10111；[11。氦气作载气，流速11]11^.111；[111，进样量141^吹 扫流量6 mL · min S 质谱条件：EI源，电子轰击能量70 ev ;检测器增益：0. 7kv，离子源温度：200°C;辅助接 口温度：280°C ;扫描方式：选择离子监测（SM); 供试品溶液制备 精密称取多糖样品l0mg，加入2mol/L的三氟乙酸6 mL，充氮气后密封，100°C水解4h， 氮气吹干，加入甲醇lmL，氮气吹干，重复5次，即得多糖水解产物；将水解样品用P2O5真空 干燥12h，加入10 mg盐酸轻胺、0. 6 mL吡啶及4 mg肌醇，90°C水浴反应lh，取出后放冷至 室温，加入I. 6 mL醋酸酐，90°C继续反应lh，吡啶定容至5. OmL，即得； 对照品储备液的制备 精密称取对应各单糖对照品10 mg，P2O5真空干燥12h，加入10 mg盐酸羟胺、0.6 mL吡 啶及4 mg肌醇，90°C水浴反应lh，取出后放冷至室温，加入I. 6 mL醋酸酐，90°C继续反应 lh，吡啶定容至5. OmL，即得； 测定法 取供试品和对照品溶液各I yL，注入气质联用仪，从标准曲线上计算出供试品溶液中 各个单糖的量，除以摩尔质量计算得到物质的量。
[0005] 本发明建立了北沙参多糖中单糖组成及含量的GC-MS/S頂分析方法，本方法灵敏 度高，信噪比高，选择性好，结果准确可靠。本发明采用S頂模式选择其目标化合物的特征 离子作为监测离子，选择丰度较大，特征性较强的离子作为其定量离子，排除了杂质峰的干 扰，更具有专属性；S頂模式下基线噪音明显低于SCAN模式，信噪比更高；由于S頂模式仅 检测选定的特征离子，因此在同样检测速度下，灵敏度优于SCAN模式。
【附图说明】
[0006] 图1为均一多糖样品总离子流图； 图2为均一多糖样品S頂离子流图； 图3为对照品S頂离子流图。
【具体实施方式】
[0007] 下面结合实施例对本发明进一步的说明。
[0008] 实施例1 气质联用仪器条件 色谱条件：色谱柱为岛津Rxi_5MS石英毛细管柱（30 mX0.25 umX0.25 mm);进样口 温度250°(：，分流比：99:1，程序升温：初始温度160°(：，1°〇1^11 1以后升到195°(：，保持15 111；[11，5°0111；[111升到 230<€，保持10111；[11。氦气作载气，流速11]11^.111；[111，进样量141^吹 扫流量6 mL · min、
[0009] 质谱条件：EI源，电子轰击能量70 ev ;检测器增益：0. 7kv，离子源温度：200°C;辅 助接口温度：280°C ;扫描方式：选择离子监测（S頂)。
供试品溶液制备 精密称取多糖样品l〇mg，加入2mol/L的三氟乙酸6 mL，充氮气后密封，100°C水解4h， 氮气吹干，加入甲醇lmL，氮气吹干，重复5次，即得多糖水解产物。将水解样品用P2O5真空 干燥12h，加入10 mg盐酸轻胺、0. 6 mL吡啶及4 mg肌醇，90°C水浴反应lh，取出后放冷至 室温，加入I. 6 mL醋酸酐，90°C继续反应lh，吡啶定容至5. OmL，即得。
[0011] 对照品储备液的制备 精密称取各单糖对照品10 mg，P2O5真空干燥12h，加入10 mg盐酸羟胺、0.6 mL吡啶及 4 mg肌醇，90°C水浴反应lh，取出后放冷至室温，加入I. 6 mL醋酸酐，90°C继续反应lh，吡 啶定容至5. OmL，即得。
[0012] 测定法 取供试品和对照品溶液各1 μ L，依法进样测定，从标准曲线上计算出供试品溶液中各 个单糖的量，除以摩尔质量计算得到物质的量。
[0013] 多糖样品测定 分别取北沙参均一多糖，30%、70%、95%乙醇醇沉粗多糖供试品溶液，按照仪器条件 进行测定，根据北沙参多糖样品测定结果计算得出各样品的单糖组成，结果如下：30%醇 沉粗多糖主要由木糖组成，7 0 %醇沉粗多糖主要由木糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖组成， 摩尔比为18. 6 : 2. 07 : 1.00 : 0. 0142,95%醇沉粗多糖主要由木糖、半乳糖、葡萄 糖、甘露糖、阿拉伯糖组成，摩尔比为7.79 : 3.05 : 1.00 : 0.0977 : 0.334,实验 室分离制得的均一多糖主要由木糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖组成，摩尔比为 0. 823 ： 1. 32 ： 1. 00 ： 0. 0919 ： 0. 761〇
[0014] 北沙参粗多糖的提取方法如下： 取北沙参饮片100.0 g，置1 〇〇〇 mL圆底烧瓶中，95%乙醇回流3次，每次乙醇加入量 均为600 mL，回流时间分别为2.0、1.5、1.0 h，以去除单糖等小分子化合物[5]。过滤，药 渣晾干。药渣用水加热回流提取3次，每次蒸馏水加入量分别为800、600、600 mL，回流 时间分别为2. 0、1.5、1 .Oh。3次提取液合并后减压浓缩至150 mL，离心（4 000 r/min， 15 min)取上清液，分别进行30%、70%和95%醇沉，醇沉多糖依次以无水乙醇、丙酮、无水乙 醚洗涤，溶剂挥干后分别得北沙参30%、70%、95%醇沉粗多糖。
[0015] 均一多糖的制备方法如下： 取北沙参饮片l〇〇g，95%乙醇回流3次，除去药材中的单糖、低聚糖、及苷类，每次乙醇 加入量均为600 mL，回流时间分别为2 .0、1. 5、1.0 h，弃去乙醇层，药渣晾干，沸水提取3 次，蒸馏水加入量依次为800、600、600 mL，时间分别为2 .0、1.5、1.0 h，提取液浓缩并 离心4000 r/min，15 min，上清液加入乙醇调节乙醇浓度为30%，过夜，离心，4000 r/min，15 min，上清液加入乙醇调节乙醇浓度为70%，过夜，离心4000 r/min，15 min，沉淀无水乙醇、 丙酮、无水乙醚各洗涤3次，蒸干得70%醇沉多糖。70%醇沉多糖I. 5 g蒸馏水溶解，用0. 45 微孔滤膜滤过，DEAE-纤维素色谱柱（1.6 cmX50 cm)上样，先以去离子水洗脱150 min， 得中性糖部分，流速为1.5 mL/min;再以0.4 mol/LNaCl水溶液，洗脱180 min (大约一个 半柱体积)，流速为2 mL/min，得酸性糖。取所得酸性糖取40 mg溶解于500 uL蒸馏水中， 0.45 微孔滤膜滤过，上样于Sephacryls 300凝胶色谱柱。以去离子水洗脱200 min，流 速为0. 5 mL/min，以示差折光检测器检测，得酸性均一多糖。
[0016] 本发明建立了北沙参多糖中单糖组成及含量的GC-MS/S頂分析方法，本方法灵敏 度高，信噪比高，选择性好，结果准确可靠。附图中图1为北沙参均一多糖样品SCAN模式总 离子流TIC图；图2为北沙参均一多糖SIM模式离子流图；图3为甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、 阿拉伯糖、木糖、半乳糖、肌醇、果糖（2个峰)混标S頂模式离子流图。图1中可以看出，SCAN 模式下甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖与杂质并未完全分离，影响了检测的准确性，图2中可以 看出，SIM模式下选择各单糖化合物的特征离子作为监测离子，选择丰度较大，特征性较强 的离子作为其定量离子，排除了杂质峰的干扰，更具有专属性；图3中可以看出，S頂模式下 各单糖对照品的质谱峰达到了完全分离，组分间无干扰。从图1-3的对比可以看出，S頂模 式下基线噪音明显低于SCAN模式，信噪比更高；由于S頂模式仅检测目标峰选定的特征离 子，因此不受杂质干扰；由于只检测少量特征离子，因此在同样检测速度下，S頂模式灵敏 度优于SCAN模式。
【主权项】
1. 一种北沙参多糖中单糖组成的测定方法，其特征在于，具体方法如下： 气质联用仪条件 色谱条件：色谱柱为30mX0.25umX0.25mm岛津Rxi-5MS石英毛细管柱；进样口 温度250°C，分流比：99:1，程序升温：初始温度160°C，1°C?min1以后升到195°C，保持15 min，5°C.min1升到230°C，保持10min;氦气作载气，流速ImL^min\进样量IML，吹扫 流量 6mL?minS 质谱条件：EI源，电子轰击能量70ev;检测器增益：0. 7kv，离子源温度：200°C;辅助接 口温度：280°C;扫描方式：选择S頂离子监测； 供试品溶液制备 精密称取多糖样品l〇mg，加入2mol/L的三氟乙酸6mL，充氮气后密封，100°C水解4h， 氮气吹干，加入甲醇lmL，氮气吹干，重复5次，即得多糖水解产物；将水解样品用P2O5真空 干燥12h，加入10mg盐酸轻胺、0. 6mL吡啶及4mg肌醇，90°C水浴反应lh，取出后放冷至 室温，加入I. 6mL醋酸酐，90°C继续反应lh，吡啶定容至5.OmL，即得； 对照品储备液的制备 精密称取对应各单糖对照品10mg，P2O5真空干燥12h，加入10mg盐酸羟胺、0.6mL吡 啶及4mg肌醇，90°C水浴反应lh，取出后放冷至室温，加入I. 6mL醋酸酐，90°C继续反应 lh，吡啶定容至5.OmL，即得； 测定法 取供试品和对照品溶液各IyL，注入气质联用仪，从标准曲线上计算出供试品溶液中 各个单糖的量，除以摩尔质量计算得到物质的量。
【专利摘要】本发明提供了一种北沙参多糖中单糖组成的测定方法，本发明采用GC-MS/SIM法对北沙参粗多糖和均一多糖中的单糖组成进行测定，对目标化合物的特征碎片离子进行检测，排除了杂质干扰，即使目标化合物与杂质未达到完全色谱分离也可进行检测，大大提高了检测的选择性、灵敏度和信噪比。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105181826
【申请号】CN201510448851
【发明人】王亮, 于宗渊, 崔宁, 郭威, 苏本正, 解盈盈, 周倩
【申请人】山东省中医药研究院
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年7月28日