专利名称：基于物理化学相结合的新型多糖硫酸化方法
技术领域：
本发明涉及多糖化学改性方面的工艺，具体的说是基于物理化学相结合的新型多糖硫酸化方法。
背景技术：
从药用真菌中提取的多糖具有多种生物活性，特别是免疫刺激和抗肿瘤的功能，使其成为当今研究的热点，广泛的应用于保健食品和医药领域。这种生物大分子不会对细胞产生直接毒害作用，而是通过作用于防御和免疫系统来发挥作用。通常有四个因素影响多糖的生物活性分别为水溶解性，分子量，分子链结构和取代基团。通过化学改性的手段可以使多糖获得新的生物学活性从而开发新的药用领域。多糖是由单糖残基通过糖苷键相连的聚合体，相对于其它生物大分子，其具有承载更多生物信息的能力。多糖的活性直接或间接地受其分子结构的影响，采取一定的方法对多糖分子结构进行修饰，可以提高或赋予多糖活性、降低其毒副作用。目前对多糖进行修饰的常见方法有硫酸化、磷酸化、乙酰化、烷基化、磺酰化、羧甲基化等。这些改性方法不仅改变了多糖的理化性质，还能改变其生理活性。直到二十世纪七十年代，多糖的硫酸化活性才被认识，然而在当今，硫酸化是改变多糖生物学活性最主要，也是最有效的手段。国外有研究表明硫酸化的香菇多糖对HIV病毒有抑制作用。多糖中的硫酸基慢慢的增加，免疫活性逐渐变小，当硫酸基的量增加到某一值时，免疫活性完全消失，转变为抗病毒活性。通常硫酸化改性方法，是使用一些硫酸化试剂，通过化学反应，在多糖的单元羟基上连上硫酸基团。常用的硫酸化体系有氯磺酸一吡啶，三氧化硫一三乙胺，浓硫酸。而反应是通过直接加热的手段来完成硫酸化的过程。一些研究表明，温度越高，硫酸化的取代度越高，然而过高的温度会影响分子的高级结构，导致生物学活性的丧失。因此只能在温和的温度下，通过延长反应的时间，来达到硫酸化高取代度的目的，现在一般的硫酸化反应都要经过8-10小时的反应时间，才能达到理想的硫酸化程度。微波可以对介质材料瞬时加热升温，能耗也很低。另一方面，微波的输出功率随时可调，介质温升可无惰性的随之改变，不存在“余热”现象，极有利于自动控制和连续化生产的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用化学物理结合的手段进行多糖硫酸化生产的工艺，这种工艺可以达到传统工艺的硫酸化程度，而且保持了较高的生物学活性，同时大大缩短了硫酸化的时间。本发明的技术方案是按以下步骤进行I、以香菇多糖作为参与反应的底物，香菇胞外多糖通过气升式发酵产生的发酵液中提取，纯化而获得的均一纯品多糖。
2、硫酸化试剂的制备采用取代率较高的硫酸化体系一氯磺酸-吡啶体系将氯磺酸缓慢滴加到装有吡啶的容器中，滴加过程应在冰盐浴中进行，并用磁力搅拌器搅拌，控制温度在O摄氏度至4摄氏度以防过热。3、微波辅助法将纯品多糖溶解在甲酰胺中，硫酸化试剂缓慢滴加，搅拌均匀。利用微波炉进行反应。反应结束后，混合液调节至pH中性，并用酒精沉淀，离心复溶于水，浓缩透析，冻干，获得硫酸化产品。4、红外检测KBr压片法傅立叶红外光谱仪检测，400-4000^^1观察硫酸取代的特殊峰。5、SD 检测
碳水化合物含量的检测采用苯酚硫酸法，硫酸根含量的检测采用氯化钡明胶法。6、体外抗氧化活性的检测。超氧根自由基清除能力模拟黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应体系产生超氧阴离子自由基，加入电子传递物质和griess显色剂，在550nm比色。测试管中加入不同浓度的样品，计算样品的超氧阴离子清除能力。氢氧根自由基清除能力利用fenton反应产生羟自由基，给与电子受体后，用griess显色，550nm比色，测试管中加入不同浓度的样品，计算样品的羟基阴离子清除能力。本发明的优点在于微波辅助法相对于传统方法,耗时更短。传统方法需要10小时左右，而新工艺只需要短短6分钟就完成反应。利用微波的特性，即达到加热的目的，采用间歇处理的手段防止过度加热导致的失活。同时由于微波的特点，使得分子在溶剂中充分舒展，更好的与硫酸化试剂接触。经过检测，新工艺获得的样品同样达到了硫酸化的结果，其取代率高，同时未失去生物活性。
图I为KBr压片法傅立叶红外光谱仪检测对比图。
具体实施例方式本发明结合具体例通过以下步骤进行I、以香菇多糖作为参与反应的底物，香菇胞外多糖通过气升式发酵产生的发酵液中提取，纯化而获得的均一纯品多糖。2、硫酸化试剂的制备采用取代率较高的硫酸化体系一氯磺酸-吡啶体系将5ml的氯磺酸缓慢滴加到装有25ml吡啶的三颈烧瓶中，滴加过程应在冰盐浴中进行，并用磁力搅拌器搅拌，控制温度在O摄氏度至4摄氏度以防过热。3、微波辅助法IOOmg纯品多糖溶解在20ml甲酰胺中，硫酸化试剂缓慢滴加，搅拌均匀。利用普通微波炉进行反应。将功率调制温和(约100W)，反应体系加热2分钟后停止，取出冷却。再重复两次，结束硫酸化反应。反应结束后，混合液调节至PH中性，并用酒精沉淀，离心复溶于水，浓缩透析，冻干，获得硫酸化样品sLNT-2。
4、产物的理化性质检验以下所述中sLNT_l为传统方法所得硫酸化样品、sLNT-2为本发明方法所得硫酸化样品。I)红外检测，KBr压片法傅立叶红外光谱仪检测，400-40000^1观察硫酸取代的特殊峰。如图I所示，为与传统方法产品的比较9770^1为β糖苷键，1650and 1415CHT1为羰基和羧基的伸缩振动，1132和IOeOcnT1S (C-O-C)和(C-OH)的伸缩振动，3361CHT1的(-0H)和2933cm—1的(C-H)是糖环的特征峰。在硫酸化产物上，1246/1225cm^处的S = O伸缩振动和855/854CHT1处的C-O-S伸缩振动表明硫酸化形成硫酸酯。2) SD检测，碳水化合物含量的检测采用苯酚硫酸法，硫酸根含量的检测采用氯化钡明胶法。以下为与传统方法产品的比较。
权利要求
1.基于物理化学相结合的新型多糖硫酸化方法，其特征在于按以下步骤进行 1)以香菇多糖作为參与反应的底物，香菇胞外多糖通过气升式发酵产生的发酵液中提取，纯化而获得的均一纯品多糖； 2)硫酸化试剂的制备采用取代率较高的硫酸化体系——氯磺酸-吡啶体系将氯磺酸缓慢滴加到装有吡啶的容器中，滴加过程应在冰盐浴中进行，并用磁力搅拌器搅拌，控制温度在O摄氏度至4摄氏度以防过热； 3)微波辅助法将纯品多糖溶解在甲酰胺中，硫酸化试剂缓慢滴加，搅拌均匀，利用微波炉进行反应，反应结束后，混合液调节至PH中性，并用酒精沉淀，离心复溶于水，浓缩透析，冻干，获得硫酸化产品； 4)红外检测KBr压片法傅立叶红外光谱仪检测，400-40000^1观察硫酸取代的特殊峰； 5)SD检测碳水化合物含量的检测采用苯酚硫酸法，硫酸根含量的检测采用氯化钡明胶法； 6)体外抗氧化活性的检测 超氧根自由基清除能力模拟黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应体系产生超氧阴离子自由基，加入电子传递物质和griess显色剂，在550nm比色，测试管中加入不同浓度的样品，计算样品的超氧阴离子清除能力； 氢氧根自由基清除能力利用fenton反应产生羟自由基，给与电子受体后，用griess显色，550nm比色，测试管中加入不同浓度的样品，计算样品的羟基阴离子清除能力。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种采用化学物理结合的手段进行多糖硫酸化生产的工艺，本发明实施的步骤是1、纯化而获得均一纯品多糖；2、硫酸化试剂的制备；3、微波辅助法；4、红外检测；5、SD检测；6、体外抗氧化活性的检测。这种工艺可以达到传统工艺的硫酸化程度，而且保持了较高的生物学活性，同时大大缩短了硫酸化的时间。
文档编号C08B37/00GK102659955SQ20121010525
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月5日 优先权日2012年4月5日
发明者李卫旗 申请人:浙江大学