提高浒苔多糖生物活性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于化学化工技术领域，涉及一种通过对降解浒苔多糖进行异羟肟酸化修 饰从而增强其生物活性的方法。
【背景技术】
[0002] 浒苔是我国东南沿海的一种大型经济性绿藻，资源丰富，本身可以食用，并含有多 种活性物质，如浒苔多糖，脂类色素，酸类等。据文献报道，讲苔多糖具有提高哺乳动物免疫 力、降血脂、消炎抗菌以及抗氧化等生理功能。因此将浒苔开发成功能食品有很好的前景。 浒苔水提多糖主要为水溶性的硫酸多糖，分子量大，生物活性相对较低。如果将其降解成分 子量相对较小的产物，则由于游离出更多的活性基团，则可能会使其生物活性得到提高。另 外，通过化学修饰在多糖分子中引入一些功能基也能使多糖的生物得到提高。已有文献报 道了浒苔多糖的硫酸化、磷酸化和乙酰化修饰，经修饰之后的浒苔多糖的抗氧化活性显著 提高；也有报道浒苔多糖经硒化后提高抗菌活性，但尚未有同时提高浒苔多糖抗菌和抗氧 化活性的方法报道。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是一种能提高浒苔多糖的抗氧化、抗菌等生物活性的方 法。
[0004] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种将降解的浒苔多糖进行异羟肟酸化修饰 的方法;包括以下步骤：
[0005] (1)将浒苔粗多糖(EP)通过氧化氢-维生素 C联合法进行降解。通过研究反应温度、 维生素 C以及过氧化氢浓度和反应时间对降解产物的总抗氧化能力的影响，得到最佳的降 解反应条件。将水解液经浓缩、醇沉、离心、透析、冷冻干燥，得到粉末状的降解浒苔多糖 (DEP) 0
[0006] (2)以氯乙酸为羧甲基化试剂，与降解浒苔多糖反应制备羧甲基化浒苔多糖 (CDEP)。研究反应温度、氯乙酸浓度和反应时间对产物的羧甲基取代度的影响，并通过响应 面试验进一步优化反应条件。在经优化后的反应条件下得到羧甲基化浒苔多糖(CDEP)用于 下一步反应。
[0007] (3)在1-乙基-3-(3_二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)存在下，CDEP与羟胺偶联，得到 异羟肟酸化降解浒苔多糖(HCDEP)。
[0008] 本发明的方案具体如下，一种提高浒苔多糖生物活性的方法，包括以下步骤：
[0009] 1)、降解：
[0010]将浒苔粗多糖(EP)溶于蒸馏水配成浓度为1~20mg/mL的浒苔粗多糖溶液，升温至 30~50°C后分别加入过氧化氢和维生素 C，直至过氧化氢和维生素 C的终浓度均为6~ 12mmol/L(例如为9mmol/L);然后保温搅拌进行降解反应2~4h，从而实现对浒苔粗多糖进 行降解；
[0011] 将所得的反应液浓缩至为原体积的1/2~1/4(约1/3)，得浓缩液；用4倍浓缩液体 积的体积浓度为95%乙醇沉淀，于3~5°C静置10~12h(4°C、过夜），离心(8000rpm，20min)， 取沉淀用水进行复溶，所述沉淀与水的用量比为18~22mg/ml (例如约为20mg/ml)，用截留 分子量为3500Da的透析袋透析46~50h(例如48h)，将所得的透析液冷冻干燥，得到降解浒 苔多糖(DEP，为粉末状）；
[0012] 备注说明：降解浒苔多糖(DEP)不具备抗菌活性；
[0013] 2)、羧甲基化：
[0014] 将0.3g的降解浒苔多糖(DEP，为粉末状)溶于12.5ml二甲基亚砜(DMSO)中，室温下 搅拌1.5~2.5h;然后加入质量浓度20 %氢氧化钠溶液5ml，于35~45°C搅拌2.5~3.5h，得 反应液I;
[0015] 将氯乙酸溶于12.5ml二甲基亚砜(DMSO)和质量浓度20%氢氧化钠溶液5ml中，配 制得浓度为2~6moI/L(较佳浓度为4moI/L)的氯乙酸溶液，作为反应液Π ;将反应液Π 与上 述反应液I等体积混合（注：从而使得到的反应液中氯乙酸终浓度为1~3mol/L，较佳为 2mol/L)，然后于45~65°C反应2~6小时(较佳为55°C反应4小时）；
[0016] 将所得的反应液冷却至室温，调节pH至中性（可用0.5mol/L的HCl进行调节pH，中 性，即，pH=7.0)，加水稀释(水与反应液的体积比约为1:1)，然后用3500Da的透析袋透析46 ~50h(例如48h)，将透析液浓缩至原体积的1/2~1/4(例如1/3)，冷冻干燥，得到即羧甲基 化降解浒苔多糖(⑶EP，即，白色粉末状的羧甲基化衍生物）；
[0017] 3)、与羟胺偶联：
[0018]将羧甲基化降解浒苔多糖(CDEP)溶于蒸馏水中配制成浓度为1~3g/100ml(例如 为2g/100ml)的羧甲基化降解浒苔多糖(CDEP)溶液，调节pH至4.0~4.5(用I.ON HCl溶液调 节），然后加入EDC · HCl，搅拌1.5~2.5h(例如2h)，再加入盐酸羟胺和4-二甲氨基吡啶 (DMAP)，继续搅拌1 ·5~2· 5h(例如2h)，调节pH至5 ·8~6 · 2(例如为6·0，用1 ·ON NaOH溶液调 节），室温搅拌1.5~2.5h(例如2h)，再调节pH至8.8~9.2(例如为9.0,用1.0 N的NaOH溶液）， 继续室温搅拌22~26h(例如24h) ;EDC · HCl与羧甲基化降解浒苔多糖(CDEP)中羧甲基的摩 尔比为l~4:3(较佳为l~1.2:3)，盐酸羟胺与EDC·HCl的摩尔比为5.5~6 :l，4-二甲氨基 吡啶(DMAP)的摩尔量为EDC · HCl的5~15.5% ;
[0019] EDC · HCl代表1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；
[0020] 备注说明：CDEP中羧甲基的摩尔数由其羧甲基取代度(DS)计算得到；
[0021] 将所得的反应液旋蒸浓缩至为原体积的1/2~1/4(例如1/3)，得浓缩液；用4倍浓 缩液体积的体积浓度95 %乙醇沉淀，于3~5°C静置10~12h (4°C、过夜），离心（8000rpm， 20min)取沉淀，用乙醇洗涤沉淀（洗3~5次），用水复溶，所述沉淀与水的用量比为18~ 22mg/ml(例如20mg/ml)，用截留分子量为3500Da透析袋透析46~50h(例如48h)，将透析液 浓缩至原体积的1/2~1/4(例如1/3,可利用旋转蒸发仪浓缩），冷冻干燥，得到异羟肟酸化 降解浒苔多糖(HCDEP)。
[0022] 该异羟肟酸化降解浒苔多糖(HCDEP)为降解浒苔多糖的异羟肟酸化衍生物。
[0023] 作为本发明的提高浒苔多糖生物活性的方法的改进：异羟肟酸化降解浒苔多糖 (HCDEP)具有较低分子量(30~13kDa)，其铁螯合容量为0.2~1.2mmol/g。
[0024] 作为本发明的提高浒苔多糖生物活性的方法的进一步改进：
[0025] 所述步骤1)、2)、3)中的冷冻干燥均是：于-45~-55°C冷冻干燥22~26小时（例如 为于-50°C冷冻干燥24小时）。
[0026]在本发明中，室温一般是指10~30°C。
[0027]备注说明：本发明浒苔粗多糖按文献文献报道方法制备(Jie Xu，Li_Li Xu，Qin-Wei Zhou，Shu-Xian Hao,Tao Zhou,Hu-Jun Xie.Enhanced in vitro antioxidant activity of polysaccharides from Enteromorpha Pro I if era by enzymatic degradation.Journal of Food Biochemistry.doi: 10.1111/jfbc. 12218)。讲苔粗多糖 (EP)中总糖、糖醛酸、蛋白质、硫酸根的含量分别为49.2%、15.7%、0.8%和12.3% ;用高效 凝胶渗透层析法测得其多糖分子量为1480kDa。本发明的降解浒苔多糖(DEP)中总糖、糖醛 酸、蛋白质、硫酸根的含量分别为51.9%、15.5%、0.65 %和13.9%;多糖分子量为44kDa。组 成分析表明DEP与EP相比，除分子量降低外，基本组成没有明显变化。
[0028] 多糖的羧甲基的取代度:指每个单糖结构单元上连接的羧甲基的平均数。
[0029] 本发明具有如下技术效果：
[0030] 1.与未降解的浒苔粗糖(EP)和降解浒苔多糖(DEP)相比，本发明得到的异羟肟酸 化降解浒苔多糖(HCDEP)的体外抗氧化活性显著提高。
[0031] 2.未降解的浒苔粗糖(EP)和降解浒苔多糖(DEP)没有显示出抗菌活性，本发明得 到的HCDEP则对几种革兰氏阳性菌和阴性菌都显示出明显的抑制作用。
【附图说明】
[0032]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0033]图1是由本发明实施例1-1得到的异羟肟酸化降解浒苔多糖(HCDEP)与降解浒苔多 糖(DEP)以及未降解多糖(EP)的DPPH自由基清除能力的测定结果。
[0034]图2是由本发明实施例1-1得到的异羟肟酸化降解浒苔多糖(HCDEP)与降解浒苔多 糖(DEP)以及未降解多糖(EP)的超氧阴离子自由基清除能力的测定结果。
[0035]图3是由本发明实施例1-1得到的异羟肟酸化降解浒苔多糖(HCDEP)与降解浒苔多 糖(DEP)以及未降解多糖(EP)的羟基自由基清除能力的测定结果。
[0036] 图4是本发明实施例1-1得到的异羟肟酸化降解浒苔多糖(HCDEP)与降解浒苔多糖 (DEP)以及未降解多糖(EP)的总抗氧化能力的测定结果。
【具体实施方式】
[0037] 实施例1-1、异羟肟酸化降解浒苔多糖的制备：
[0038] (1)称取Ig浒苔粗多糖(EP)溶解于IOOmL蒸馏水中，30°C水浴加热，依次加入维生 素 C和过氧化氢，使得二者的终浓度均为9mmo 1/L，保温搅拌反应2h，将反应液浓缩(于60~ 70°C进行减压浓缩）至为原体积的1/3，用4倍浓缩液体积95 %乙醇沉淀，4°C过夜，离心 (8000rpm，20min)，取沉淀用水复溶(所述沉淀与水的用量比约为20mg/ml)，用截留分子量 为3500Da的透析袋透析48h，将透析液冷冻干燥(于-50°C冷冻干燥24小时），得到粉末状的 降解浒苔多糖(DEP)。
[0039] (2)取0.3g的降解浒苔多糖(DEP)溶于12.5mL的DMSO中，室温搅拌2h，加入质量浓 度20%的氢氧化钠溶液5mL，加热至40°C搅拌3h。取6.62g(0.07mol)的氯乙酸加入5mL的 NaOH溶液（质量浓度20 % )和12.5mL的DMSO中，溶解后加入到上述反应体系中，使得氯乙酸 终浓度为2. Omol/L，在55°C反应4h，将反应液冷却至室温，用0.5mol/L的HCl调节pH至中性 (即，pH=7)，加水稀释(水与反应液的体积比约为1:1)，然后用3500Da的透析袋透析48h，将 透析液浓缩（于60~70°C进行减压浓缩）至为原体积的1/3,冻干（于-50°C冷冻干燥24小 时），得到羧甲基化降解浒苔多糖(CDEP)，羧甲基的取代度为0.774。降解浒苔多糖的羧甲基 化的成功用红外光谱和核磁共振碳谱得到确证。
[0040] (3)称取0 · 3g(含1 · 42mo 1羧甲基）羧甲基化衍生物（CDEP)溶于15mL蒸馏水中，用 1.0N HCl溶液调节pH至4.3,加入0.1g(0.52mmol)EDC · 'HCl使羧基活化，搅拌2h，再加入 0.2g(2.89mmol)盐酸羟胺，同时加入0.01g(0.08mmol)4-二甲氨基吡啶(DMP)作为催化剂， 继续搅拌2h，用1.0 N NaOH溶液调节pH至6.0，室温搅拌2h，再用1.0 N的NaOH溶液调节pH至 9.0，继续室温搅拌24h，将反应液旋蒸浓缩为原体积的1/3，得浓缩液；用4倍浓缩液体积的 浓度为95%乙醇沉淀，4°C静置过夜，离心(8000rpm，20min)取沉淀，用乙醇洗涤沉淀4次(每 次洗涤时，用量约为5ml)，用水复溶(所述沉淀与水的用量比约为20mg/ml)，于3500Da透析 48h，将透析液于旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/3，-50°C冷冻干燥24h，得到异羟肟酸化降解 浒苔多糖(HCDEP)0.23g，测得其分子量为55.4kDa。异羟肟酸化降解浒苔多糖的结构用傅立 叶红外光谱和核磁共振碳谱进行了确证；并用光谱滴定法测定了其铁螯合容量为 0.417mmol/g(测定方法见实验1)。
[0041 ]实验 1、
[0042] 铁螯合容量的测定:取HCDEP 150mg，溶解于IOmL 50mM的NH4HCO3缓冲液中，得到样 品浓度为15mg/mL;取11份1.0 mL的样品溶液