一种具有辅助降血糖作用的浒苔寡糖及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体关于一种具有辅助降血糖作用的浒苔寡糖的制备 方法。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是由于胰岛素分泌缺陷及(或）其生物学作用障碍引起的以高血糖为特征 的全身代谢紊乱性疾病，其发病率逐年增加。浒苔多糖属于绿藻多糖，多为水溶性的硫酸多 糖，主要是葡萄糖醛酸-木糖-鼠李糖聚合物具有降低胆固醇、降血糖和调节血脂等方面的 作用。与多糖相比，寡糖具有易溶于水、无抗原性，以及在宿主体内具有较弱的积累效应等 优点。目前研究主要集中在浒苔多糖方面，尚未见浒苔寡糖降血糖及其制成辅助治疗2型糖 尿病保健品的报道。
[0003] 寡糖在规模化应用上受到很大的限制，主要原因是对寡糖制备技术的研究尚不够 深入。寡糖的酶法制备是利用特定的酶对多糖进行降解的方法，其反应条件温和，无其他副 反应，产品均一性好。微波具有强大的穿透能力，细胞经微波处理会吸收能量，细胞内部的 高温高压会使多糖内部糖苷键断裂，引起分子聚合度的改变，从而提高了糖类的产量。微波 辅助分步酶解法制备浒苔寡糖，具有操作方便、提取时间短、效率高、无污染的优点。在目前 所公开的海藻寡糖相关专利中，CN101891904B公开了海带寡糖在制备防治植物病害药物方 面的应用；CN102827899B公开了一种龙须菜琼胶寡糖及其制备方法与其在制备抗氧化、抗 紫外线保健品和化妆品中的应用;CN100508985C公开了一种低分子量褐藻胶寡糖，虽然提 到了其在糖尿病防治方面的应用，但该专利所述低分子量褐藻胶寡糖，是利用酸水解海藻 酸钠所得。本发明中所述浒苔寡糖为利用分步酶解的绿色制备方法制得，具有不会发生副 反应、条件温和、环境友好等优点。本发明中通过微波辅助分步酶解制备绿藻浒苔寡糖及其 降血糖活性均未见其它研究报道或专利。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种具有辅助降血糖作用的浒苔寡糖的制备方法。制备工艺 路线简单合理，降低了酶的消耗和生产成本，提高了制备产量，是一种绿色高效制备浒苔活 性寡糖的有效方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： (1) 将浒苔干燥后粉碎，向浒苔干粉中加入60-80%乙醇回流提取1-2小时，干粉重量与 乙醇体积比（g/mL)为1:20-30,回流结束后回收去除乙醇循环使用，烘干得到干燥脱脂的浒 苔粉末； (2) 向步骤（1)制得的脱脂浒苔粉末中加入蒸馏水，其中浒苔质量与蒸馏水体积比（g/ mL)为1: 25-30,60-70°C萃取温度下480-600 W微波辅助提取2-3 min，提取结束后，进行过 滤，将滤渣重复上述步骤进行2-3次提取，将获得的滤液混合后进行浓缩，加入3-4倍体积 95%乙醇，4-10°C静置沉淀8-12小时后，离心收集沉淀，真空冷冻干燥后粉碎，得粗浒苔硫酸 多糖； (3) 向步骤(2)所得粗浒苔硫酸多糖中加入蒸馏水，其中硫酸多糖粉末质量与蒸馏水体 积比为1:10_20，进彳丁揽摔复溶。用Sevag法、二氣二氣乙烧法、二氣乙酸法中一种或几种除 蛋白5-8次； (4) 将步骤(3)所得到的溶液，通过HPD-826大孔吸附树脂填充柱，洗脱液进一步经过非 极性吸附剂活性炭去除色素，活性炭使用量与洗脱液按重量体积比（g/mL)l:30-50,于摇 床中60-80 r/min振荡1-2h，6000-8000rpm离心20-30 min，收集上清液； (5) 利用截留分子量8000-14000以上规格透析袋，去除小分子、色素。截留液在50-60°C 及转速为40-60 r/min条件下旋转蒸发，浓缩至膏状，并进行真空冷冻干燥粉碎后，得到精 浒苔硫酸多糖粉末； (6) 将步骤(5)中所得精浒苔硫酸多糖粉末用蒸馏水溶解，质量体积比(mg/mL) 1:0.5-1.5，调节pH为6.5-8.0，加入多聚半乳糖醛酸酶后置于32-40°C，速度为65-90 r/min水浴摇 床中酶解0.5-1.5 h后取出，沸水加热5-10 min以灭酶活，冷却至室温，离心取上清液备用； (7) 将步骤(6)离心所得上清液调节pH为5 · 0-6 · 5，加入?-L-鼠李糖苷酶后置于35-50 °C，速度为65-90 r/min水浴摇床中酶解1-1.2 h后取出，沸水加热5-10 min以灭酶活，冷却 至室温，离心取上清液备用； (8) 将步骤(7)离心所得上清液调节pH为4.5-6.0,加入木聚糖酶后置于50-60 °C，速度 为65-90 r/min水浴摇床中酶解0.5-1 h后取出，沸水加热10-15 min以灭酶活，冷却至室 温，离心取上清液备用。至室温，离心取上清液备用； (9) 向步骤(8)中酶解后离心所得上清液加入体积比1:3-4的95%乙醇沉降除去反应液 中未降解多糖，4-10°C静置沉淀4-6 h后，离心收集上清，即为浒苔寡糖粗品溶液； (9 )向步骤(8 )中酶解后离心所得上清液加入等体积比95%乙醇，4-10 °C静置沉淀1.5-2.5 h后，沉降除去反应液中蛋白，离心收集上清备用； (10) 向步骤(9)中酶解后离心所得上清液加入体积比1:2-3的95%乙醇沉降除去反应液 中未降解多糖，4_10°C静置沉淀8-10 h后，离心收集上清，在37-40°C及转速为60-80 r/min 条件下旋转蒸发，浓缩至原体积的1/5-1/4;即为浒苔寡糖粗品溶液； (11) 将步骤（10)中浒苔寡糖粗品溶液，采用截留分子量2000D透析袋处理，收集透析 液； (12) 将步骤（11)中溶液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥，制备得 到浒苔活性寡糖。
[0006] (13 )所述多聚半乳糖醛酸酶、a-L-鼠李糖苷酶、木聚糖酶与步骤(6 )中精浒苔硫酸 多糖粉末的质量比分别为1:10-15、1:15-25、1:20-40。
[0007] 本发明的优点在于：目前研究主要集中在浒苔多糖，尚未见浒苔寡糖降血糖及其 制成辅助治疗2型糖尿病保健品的报道。本发明采用微波辅助，依次利用多聚半乳糖醛酸 酶、;i-L-鼠李糖苷酶、木聚糖酶分步酶解浒苔硫酸多糖，能较充分酶切浒苔多糖复杂键合结 构，大幅提高酶解效率并降低酶用量，具有操作方便、效率高、无污染的优点。
【具体实施方式】
[0008] 实施例1 (1) 将浒苔干燥后粉碎，向浒苔干粉中加入60%乙醇回流提取1小时，干粉重量与乙醇体 积比（g/mL)为1:20,回流结束后回收去除乙醇循环使用，烘干得到干燥脱脂的浒苔粉末； (2) 向步骤（1)制得的脱脂浒苔粉末中加入蒸馏水，其中浒苔质量与蒸馏水体积比（g/ mL)为1:25，60-70°C萃取温度下480W微波辅助提取2 min，提取结束后，进行过滤，将滤渣重 复上述步骤进行2次提取，将获得的滤液混合后进行浓缩，加入3倍体积95%乙醇，4°C静置沉 淀8小时后，离心收集沉淀，真空冷冻干燥后粉碎，得粗浒苔硫酸多糖。
[0009] (3)向步骤(2)所得粗浒苔硫酸多糖中加入蒸馏水，其中硫酸多糖粉末质量与蒸馏 水体积比(mg/mL)为1:0.8，进行搅拌复溶。用三氯乙酸法除蛋白5次。
[0010] (4)将步骤(3)所得到的溶液，通过HPD-826大孔吸附树脂填充柱，洗脱液经过非极 性吸附剂活性炭去除色素，活性炭使用量与洗脱液按重量体积比（g/mL)l:30,于摇床中60 r/min振荡1 h，6000rpm离心20min，收集上清液。
[0011] (5)利用截留分子量8000以上规格透析袋，去除小分子及色素。截留液在50°C及转 速为40r/min条件下旋转蒸发，浓缩至膏状，并进行真空冷冻干燥粉碎后，得到精浒苔硫酸 多糖粉末。
[0012] (6)将步骤(5)中所得精浒苔硫酸多糖粉末用蒸馏水溶解，质量体积比1:10,调节 口!1为6.5，加入多聚半乳糖醛酸酶后置于32<€，速度为651'/1]1；[11水浴摇床中酶解0.511后取出， 沸水加热5min以灭酶活，冷却至室温，离心取上清液备用。
[0013] (7)将步骤(6)离心所得上清液调节pH为5.0,加入?-L-鼠李糖苷酶后置于35°C，速 度为65 r/min水浴摇床中酶解lh后取出，沸水加热5min以灭酶活，冷却至室温，离心取上清 液备用。
[0014] (8)将步骤(7)离心所得上清液调节pH为4.5,加入木聚糖酶后置于50 °C，速度为65 r/min水浴摇床中酶解0.5h后取出，沸水加热lOmin以灭酶活，冷却至室温，离心取上清液备 用。至室温，离心取上清液备用。
[0015] (9 )向步骤(8 )中酶解后离心所得上清液加入等体积比95%乙醇，4 °C静置沉淀1.5h 后，沉降除去反应液中蛋白，离心收集上清备用。
[0016] (10 )向步骤(9 )中酶解后离心所得上清液加入体积比1:2的95%乙醇沉降除去反应 液中未降解多糖，4°C静置沉淀8 h后，离心收集上清，在37°C及转速为60 r/min条件下旋转 蒸发，浓缩至原体积的1 /5，即为浒苔寡糖粗品溶液。
[0017] (11)将步骤（10)中浒苔寡糖粗品溶液采用截留分子量2000D透析袋处理，收集透 析液。
[0018] (12)将步骤（11)中透析液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥， 制备得到浒苔活性寡糖。
[0019 ] (13 )所述多聚半乳糖醛酸酶、a-L-鼠李糖苷酶、木聚糖酶与步骤(6 )中精浒苔硫酸 多糖粉末的质量比分别为1: 1〇、1:15、1:20。
[0020] 实施例2 (1) 将浒苔干燥后粉碎，向浒苔干粉中加入80%乙醇回流提取2小时，干粉重量与乙醇体 积比(g/mL)为1: 30,回流结束后回收去除乙醇循环使用，烘干得到干燥脱脂的浒苔粉末； (2) 向步骤（1)制得的脱脂浒苔粉末中加入蒸馏水，其中浒苔质量与蒸馏水体积比（g/ mL)为1: 30, 70°C萃取温度下600 W微波辅助提取3min，提取结束后，进行过滤，将滤渣重 复上述步骤进行3次提取，将获得的滤液混合后进行浓缩，加入4倍体积95%乙醇，10°C静置 沉淀12小时后，离心收集沉淀，真空冷冻干燥后粉碎，得粗浒苔硫酸多糖。
[0021] (3)向步骤(2)所得粗浒苔硫酸多糖中加入蒸馏水，其中硫酸多糖粉末质量与蒸馏 水体积比(mg/mL)为1: 1，进行搅拌复溶。用三氟三氯乙烷法除蛋白8次。
[0022] (4)将步骤(3)所得到的溶液，通过HPD-826大孔吸附树脂填充柱，洗脱液经过非极 性吸附剂活性炭去除色素，活性炭使用量与洗脱液按重量体积比(g/mL)l: 50,于摇床中70 r/min振荡2h，7000rpm离心22 min，收集上清液。
[0023] (5)利用截留分子量14000以上规格透析袋，去除小分子及色素。截留液在60°C及 转速为50 r/min条件下旋转蒸发，浓缩至膏状，并进行真空冷冻干燥粉碎后，得到精浒苔硫 酸多糖粉末。
[0024] (6)将步骤(5)中所得精浒