一种利用牦牛血制备无水氯化血红素的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种无水氯化血红素的制备方法，特别是一种利用牦牛血液制备无水氯化血红素的方法。
【背景技术】
[0002]牦牛是中国的主要牛种之一，是青藏高原牧区的优势种家畜和当家畜种，具有顽强的生命力。我国是世界牦牛的发源地，全世界90%的牦牛生活在我国青藏高原及毗邻的6个省区。牦牛肉蛋白质高达21%，脂肪低，氨基酸品种全，品质佳，风味好。牦牛奶浓稠，干物质含量18%左右、脂肪含量7%左右、蛋白质含量5%左右。毛皮有特色，开发价值大。据测算，对牦牛肉、乳、毛、皮、骨、血等进行综合开发，可获得高出原料5倍的经济增加值，仅牦牛业可实现几百亿的产值。目前，对于牦牛肉、乳的利用比较充分，而牦牛血液因为有较大的血腥味而利用率不高。但是牦牛血液中血红蛋白含量较高(73.34?99.48g/L)，明显高于其他动物，因而它是制备氯化血红素很好的原料。
血红素是一种铁卟啉化合物，它是血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素、过氧化氢酶和过氧化物酶的辅基。主要存在于动物血液和肌肉中，是动物血液中的天然色素，在医药、食品、化工、保健品、建筑及化妆品行业中有广泛应用。血红素除了可以用作食品中的色素添加剂夕卜，还是目前治疗缺铁性贫血(IDA)疗效较好的一种补铁剂，具有生物利用度高、无体内铁蓄积中毒及胃肠刺激等不良反应等优点，同时还是抗贫血和抗肿瘤药物的重要原料，我国于1998年正式批准以血红素为基本原料的血卩卜啉为抗肿瘤新药。美国FDA已于1983年7月正式批准雅培公司的氯化血红素作为药品使用。
[0003]目前，关于氯化血红素的制备方法有很多，但是基本上都要用到大量的化学试剂，这样既造成了试剂的浪费和环境的污染同时也使生产成本很高。本发明旨在以牦牛血液为原料，不用加抗凝剂的血液通过酶解法制备氯化血红素，既降低了生产成本又便于工业化生产。
【发明内容】
[0004]鉴于上述牦牛血液利用率低，现有制备氯化血红素的方法浪费试剂、污染环境、生产成本高的缺陷，本发明的目的是提供一种使用化学试剂少、成本较低、环境污染较低的利用牦牛血液制备无水氯化血红素的方法。
[0005]本发明的目的是按下面技术方案实现的，一种利用牦牛血液制备无水氯化血红素的方法，其特征在于按照红细胞的收集、红细胞的破碎、血红蛋白的酶解与氯化血红素的提取步骤进行，具体如下所述:
1.红细胞的收集
用50 ml试管收集新鲜的牦牛血液20ml，用纱布进行过滤，除去较大杂质，收集过滤液，静置I小时后待血液凝固分层后，吸去上层淡黄色的液体，得到下层红细胞凝固物12ml。
[0006]2.红细胞的破碎在红细胞凝固物中添加0.5?1.25倍的去离子水，放入超声波中进行破碎15min，同时用玻璃棒进行搅拌，使固体凝固物充分分散，同时使红细胞破碎，释放血红蛋白；将溶液快速的倒入六个小试管中，在60°C避光条件下加热30 min，之后用3000 r/ min离心机离心1min，将六个小试管中的上层液体倒入到20ml锥形瓶中，去除下层变性的杂蛋白，得到血红蛋白溶液。
[0007]3.血红蛋白的酶解
将血红蛋白溶液的用HCl0.lmol/L标准溶液调节PH=6.8?7.0，放于50°C恒温水浴锅中加热20 min，加入酶活力为4000u/g中性蛋白酶0.3g，温度45°C;水解5小时后加入酶活力为2000u/g风味酶0.5g，调节至pH=6.8?7.0，温度53°C ；水解反应完成后，加热煮沸灭酶。
[0008]4.氯化血红素的提取
血红蛋白经酶解后，肽链被断开，水解液中有血红素，血红素肽及肽片段，用HCl0.lmol/L溶液调pH=4.5后，加入质量浓度lg/100mL的乙酸钠溶液，以3000 r/ min转速离心I Omin析出沉淀，收集沉淀，依次用离子水、体积分数50%的乙酸液、体积分数95%乙醇溶液洗涤一次，再用乙醚洗涤两次，在零下20°C冷冻干燥8小时，得到氯化血红素。
[0009]本发明利用牦牛血液制备无水氯化血红素，使动物血液资源得到了充分有价的利用。制备无水氯化血红素的方法简单，易于操作，所用化学试剂少、成本较低、环境污染较低，便于工业化生产。
【具体实施方式】
[0010]实施例1;
1.红细胞的收集:用50 ml试管收集新鲜的牦牛血液20ml，用纱布进行过滤，除去较大杂质，收集过滤液，静置I小时后待血液凝固分层后，吸去上层淡黄色的液体，得到下层红细胞凝固物12ml。
[0011 ] 2.红细胞的破碎:在红细胞凝固物中添加6ml的去离子水，放入超声波中进行破碎15min，同时用玻璃棒进行搅拌，使固体凝固物充分分散，同时使红细胞破碎，释放血红蛋白。将溶液快速的倒入六个小试管中，在60°C避光条件下加热30 min，之后用3000 r/ min离心机离心1min，将六个小试管中的上层液体倒入到20ml锥形瓶中，去除下层变性的杂蛋白，得到血红蛋白溶液。
[0012]3.血红蛋白的酶解:将收集得到的血红蛋白溶液的用HCl0.lmol/L标准溶液调节PH=6.8，放于50 0C恒温水浴锅中加热20 min，加入酶活力为4000u/g中性蛋白酶0.3g，温度45°C ;水解5小时后加入酶活力为2000u/g风味酶0.5g，调节至pH=6.9，温度53°C ;水解反应完成后，加热煮沸灭酶。
[0013]4.氯化血红素的提取:血红蛋白经酶解后，肽链被断开，水解液中有血红素，血红素肽及肽片段，用HCl0.lmoVL溶液调pH=4.5后，加入质量浓度lg/100mL的乙酸钠溶液，以3000 r/ min转速离心1min析出沉淀，收集沉淀，依次用离子水、体积分数50%的乙酸液、体积分数95%乙醇溶液洗涤一次，再用乙醚洗涤两次，在零下20°C冷冻干燥6小时，得到氯化血红素。
[0014]实施例2;
I.红细胞的收集:同实施例1。
[0015]2.红细胞的破碎:在红细胞凝固物中添加12ml的去离子水，余同实施例1。
[0016]3血红蛋白的酶解:将收集得到的血红蛋白溶液的用HCl0.lmol/L标准溶液调节PH=7.0，放于500C恒温水浴锅中加热20 min，加入酶活力为4000u/g中性蛋白酶0.3g，温度450C ；水解5小时后加入酶活力为2000u/g风味酶0.5g，调节至pH=6.9，余同实施例1。
[0017]4.氯化血红素的提取:同实施例1。
[0018]实施例3;
I.红细胞的收集:同实施例1。
[0019]2.红细胞的破碎:在红细胞凝固物中添加15ml的去离子水，余同实施例1。
[0020]3血红蛋白的酶解:将收集得到的血红蛋白溶液的用HCl0.lmol/L标准溶液调节PH=7.0，放于500C恒温水浴锅中加热20 min，加入酶活力为4000u/g中性蛋白酶0.3g，温度450C ；水解5小时后加入酶活力为2000u/g风味酶0.5g，调节至pH=7.0，余同实施例1。
[0021]4.氯化血红素的提取:同实施例1。
[0022]实施例4;
I.红细胞的收集:同实施例1。
[0023]2.红细胞的破碎:在红细胞凝固物中添加1ml的去离子水，余同实施例1。
[0024]3血红蛋白的酶解:将收集得到的血红蛋白溶液的用HCl0.lmol/L标准溶液调节PH=6.8，放于500C恒温水浴锅中加热20 min，加入酶活力为4000u/g中性蛋白酶0.3g，温度450C ；水解5小时后加入酶活力为2000u/g风味酶0.5g，调节至pH=7.0，余同实施例1。
[0025]4.氯化血红素的提取:同实施例1。
【主权项】
1.一种利用牦牛血液制备无水氯化血红素的方法，其特征在于按照红细胞的收集、红细胞的破碎、血红蛋白的酶解与氯化血红素的提取步骤进行;具体如下所述: (1)红细胞的收集 用50 ml试管收集新鲜的牦牛血液20ml，用纱布进行过滤，除去较大杂质，收集过滤液，静置I小时后待血液凝固分层后，吸去上层淡黄色的液体，得到下层红细胞凝固物12ml; (2)红细胞的破碎 在红细胞凝固物中添加0.5?1.25倍的去离子水，放入超声波中进行破碎15min，同时用玻璃棒进行搅拌，使固体凝固物充分分散，同时使红细胞破碎，释放血红蛋白；将溶液快速的倒入六个小试管中，在60°C避光条件下加热30 min，之后用3000 r/ min离心机离心1min，将六个小试管中的上层液体倒入到20ml锥形瓶中，去除下层变性的杂蛋白，得到血红蛋白溶液； (3)血红蛋白的酶解 将血红蛋白溶液的用HCl0.lmol/L标准溶液调节PH=6.8?7.0，放于50°C恒温水浴锅中加热20 min，加入酶活力为4000u/g中性蛋白酶0.3g，温度45°C;水解5小时后加入酶活力为2000u/g风味酶0.5g，调节至pH=6.8?7.0，温度53°C ；水解反应完成后，加热煮沸灭酶； (4)氯化血红素的提取 血红蛋白经酶解后，肽链被断开，水解液中有血红素，血红素肽及肽片段，用HCl0.lmol/L溶液调pH=4.5后，加入质量浓度lg/100mL的乙酸钠溶液，以3000 r/ min转速离心I Omin析出沉淀，收集沉淀，依次用离子水、体积分数50%的乙酸液、体积分数95%乙醇溶液洗涤一次，再用乙醚洗涤两次，在零下20°C冷冻干燥6小时，得到氯化血红素。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，涉及一种利用牦牛血液制备无水氯化血红素的方法；其特征在于按照红细胞的收集、红细胞的破碎、血红蛋白的酶解与氯化血红素的提取步骤进行。本发明利用牦牛血液制备无水氯化血红素，使动物血液资源得到了充分有价的利用。制备无水氯化血红素的方法简单，易于操作，所用化学试剂少、成本较低、环境污染较低，便于工业化生产。
【IPC分类】C12P17/18
【公开号】CN105567759
【申请号】CN201610117183
【发明人】高维东, 谢小冬, 弥超, 魏美玲, 朱明
【申请人】兰州天和生物催化技术有限公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年3月2日