一种三元复合体系检测探针的构建方法
【专利摘要】本发明一种三元复合体系检测探针的构建方法，属于生物传感领域。利用建立的方法设计出能够对待测分子，如赭曲霉毒素A进行灵敏检测的检测探针。特点在于利用核酸碱基互配和核酸链连续互补原理，对检测信号放大，属于生物传感领域。首先用待测分子与核酸链H1作用后，引发其构型改变，使其能与核酸链H2的碱基互补配对，使H2构型改变，改变后的H2又能与H1的碱基互补配对，实现单一检测分子引发核酸链式反应的目的。最后，在氯化血红素存在时，H2上的过氧化物酶模拟序列能够催化过氧化氢氧化四甲基联苯胺，在盐酸溶液存在时产生有色溶液。根据溶液在一定波长处吸光度与待测分子浓度之间的关系，可以得到其检测曲线。
【专利说明】一种三元复合体系检测探针的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明专利涉及一种构建三元复合体系检测探针的技术，可用于对赭曲霉毒素A进行灵敏检测。特点在于利用适配体、核酸碱基互配和核酸链连续互补，对检测信号放大，属于生物传感领域。
【背景技术】
[0002]赭曲霉毒素A是一种常见的霉菌毒素，广泛存在于霉变的水果和谷物中。其毒性主要是肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性、致畸毒性和致癌性。
[0003]目前，赭曲霉毒素A在食品中的检测手段多为生物鉴定法、化学分析法以及仪器分析法。其中生物鉴定法主要用于定性判断真菌毒素的存在与否，其缺点在于灵敏度不高。化学分析法对操作人员技术要求不高，但结果重现性差。目前常用的仪器分析法包括高效液相色谱法和质谱法，具有灵敏度高、重现性好的优点，但所用仪器昂贵，对操作人员技术要求高，且用到大量有机溶剂，因此不利于推广使用。近年来，抗体技术在构建大分子探针，如蛋白质的检测方面有许多应用，但一些小分子，如赭曲霉毒素A，相应的抗体难以制备，且亲和力弱，因此不利于灵敏度高的检测探针的制备。发展简便、灵敏、快速、高效的小分子检测探针对于食品安全的保障具有重要意义。
[0004]核酸适配体的使用能够在一定程度上解决这一难题。适配体是一段能与待检测分子通过构型互补，改变三维结构、实现对待测分子高亲和性、高特异性结合的一段寡核苷酸序列。与抗体相比，其具有以下优势:(1)靶分子的分子量更广，包括大分子量的蛋白质，核酸，小分子量的无机、有机化合物；(2)能够通过核酸构象的改变，实现对靶分子的高亲和性结合；(3)适配体可以人工合成，且性质稳定，因此适配体在小分子检测探针的构建中具有非常好的应用前景。尽管目前有利用适配体构建检测探针的报道，但构建三元体系，利用三元体系中适配体对小分子的识别作用，过氧化物酶模拟单元实现对检测信号的免标测定，并结合核酸链式反应对信号的放大效应进行检测探针的构建，用于小分子的检测尚未见报道。
[0005]本项目中，我们利用了核酸适配体和核酸链式反应原理，设计了两条核酸序列^和4，在不含有待测目标分子时，二者初始构象为首尾相连的“发夹”结构，氏不能与1结合，而当目标分子存在时，包含适配体的探针分子Hi “发夹”结构能够打开，暴露出与4碱基互补的DNA片段，进而通过与H2的结合，使Η 2的“发夹”结构打开，Η 2包含能够在氯化血红素存在时催化过氧化氢氧化四甲基联苯胺，产生有色物质的DNA片段(过氧化物酶模拟片段)。发夹”结构打开后的仏又可以与Η 3减基互补，进而引发新的H i片段“发夹”结构打开，通过多轮循环反应，可以实现检测信号的放大。基于此，构建了包含适配体，过氧化物酶模拟片段和核酸链式反应单元的三元复合体系检测探针，能够用于小分子，如赭曲霉毒素A的检测。
【发明内容】
[0006]技术问题:本发明提供一种基于适配体，过氧化物酶模拟片段和核酸链式反应三元体系的构建方法，能实现操作简单、灵敏快速，无需使用信号分子标记，对检测信号多级放大的目的，并对小分子，如赭曲霉毒素A进行灵敏检测。首先，设计出DNA片段氏(?含有可识别待测分子(本项目以赭曲霉毒素A为例)的适配体)和DNA片段H2，(H2含有能在氯化血红素存在时催化H202氧化四甲基联苯胺产生有色物质的片段(过氧化物酶模拟片段))，二者初始结构为首尾相连的“发夹”结构。在没有加入赭曲霉毒素A前，氏由于内部碱基互补，产生“发夹”结构，首尾相连，不能与DNA片段H2作用，当赭曲霉毒素A加入后，由于适配体与赭曲霉毒素A作用后，空间结构改变，使“发夹”结构打开，能够与DNA片段4的一端互补，诱导原来为“发夹”结构的4打开，进而再与I作用，经过循环反应后，能够形成含有大量过氧化物酶模拟片段的长链DNA，通过加入含有H202的四甲基联苯胺溶液，使检测信号放大。
[0007]技术方案:一种基于适配体，过氧化物酶模拟片段和DNA杂交链式反应原理,构建三元复合体系检测探针的方法。首先设计出特殊的DNA片段氏，使氏中含有能识别小分子(如赭曲霉毒素A)的适配体，初始构象为首尾相连的“发夹”结构，通过加入检测分子使氏的结构被破坏，暴露出能与DNA片段H2反应的碱基；进而加入特殊设计的DNA片段Η 2，!12初始结构也为首尾相连的“发夹”结构，并且含有能在氯化血红素存在时催化Η202氧化四甲基联苯胺产生有色物质的片段(过氧化物酶模拟片段)。结构改变后的氏与!12反应，使1的碱基互补链打开，“发夹”结构被破坏，暴露出能与氏作用的碱基序列，同时过氧化物酶模拟片段也暴露出。经过多轮循环后，许多组故与Η 2将形成长的DNA链，每个链上含有大量过氧化物酶模拟片段。最后，加入Η202和四甲基联苯胺，经过信号放大后，测定溶液吸光度，得到相应的检测信号，建立检测信号与赭曲霉毒素Α浓度间的联系，获取检测曲线。
[0008]具体来讲，一种三元复合体系检测探针的构建方法，按照下述步骤进行:
[0009](1)首先选取能与小分子赭曲霉毒素A作用的DNA片段(适配体)，根据适配体碱基序列，设计能与其形成分子内杂交互补的片段，连接到适配体的3 ’末端，形成三元复合体系中的探针Η:。
[0010](2)根据氏3’端的碱基序列，设计能够与其杂交互补的片段a，同时寻找能与a形成分子内杂交互补的片段b，连接到其5’末端，再选取能模拟过氧化物酶的碱基片段c，将以上三个片段依从3’端到5’端分别为a-c-b的顺序排列，形成三元复合体系中的探针H2。
[0011](3)小分子赭曲霉毒素A与氏的反应:取一定量含有赭曲霉毒素A的待测溶液，在其中加入氏水溶液，使Η #冬浓度为1-ΙΟΟηΜ，然后加入10 μ L CaCl 2水溶液和10 μ L KC1水溶液，使CaCljS浓度为10mM，KC1终浓度为20mM，最后加入10 μ L氯化血红素水溶液，使氯化血红素终浓度为150ηΜ，混合均匀，反应10分钟。
[0012](4)加入Η2后的链增长:在前述⑶的溶液中接着加入Η 2水溶液，使Η 2终浓度为1-ΙΟΟηΜ,充分混合均匀后，反应60分钟。
[0013](5)显色过程:在前述⑷的溶液中加入80 μ L含有H202的四甲基联苯胺溶液，使最终H202和四甲基联苯胺的浓度分别为0.03%和0.2μ g/mL。最后反应60分钟后，加入50 μ L 1Μ的盐酸，5分钟后测定波长为450纳米处的吸光度。绘制吸光度与待测溶液中赭曲霉毒素Α的浓度关系曲线。
[0014](6)赭曲霉毒素A的检测:取可能含有赭曲霉毒素A的食品(如面粉)1克，加入甲醇10mL，搅拌5分钟后，将溶液离心，吸取上部溶液5 μ L，再加入45 μ L 7Κ，作为实际样品(待测溶液)。重复上述(3) (4)步骤，以及(5)步骤中除去绘制绘吸光度与待测溶液中赭曲霉毒素A的浓度关系曲线的其余步骤。将得到的吸光度值与(5)中得到的浓度关系曲线进行对比，得到对应的赭曲霉毒素A的浓度，实现样品中赭曲霉毒素A的检测，从而实现一种三元复合体系检测探针方法的构建。
[0015]其中所述的^包含可以在CaCl2存在时与赭曲霉毒素A相互作用并改变构型的适配体，即:5’-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA CGC CAC，所述的!12包含能在氯化血红素存在时催化H202氧化四甲基联苯胺产生有色物质的片段(过氧化物酶模拟片段)，即:CT GGG AGG GAG GGA GGG，该片段能够在KC1存在时形成四联体的空间结构，氏的5’端可以与赭曲霉毒素A发生特异性相互作用，且可以与!12的3’端互补，!12的5’端可以与氏的3’端互补，在没有与赭曲霉毒素A作用前，1的3’端可以与其5’端的7-18位碱基互补，4的3’可以与其5’端的28-35位碱基互补形成首尾相连的“发夹”结构。
[0016]所绘制的浓度曲线是指不同浓度的赭曲霉毒素A与故反应后，再加入Η 2，最后加入含Η202的四甲基联苯胺显色后，根据不同浓度赭曲霉毒素Α对应的溶液在波长为450纳米处的吸光度对赭曲霉毒素A浓度绘制的曲线。
[0017]本发明的有益效果是:利用核酸链式反应原理，将适配体和过氧化物酶模拟片段分别设计到两条能互补杂交配对的DNA中，构建出三元复合体系的DNA检测探针。通过赭曲霉毒素A与DNA链氏作用后Η #连构型的改变，使H i “发夹”结构的打开，引发链式反应的进行，通过与4碱基互补使链长增长，利用化链上的过氧化物酶模拟片段，催化H202氧化四甲基联苯胺产生有色物质，实现检测信号的放大。相比以往小分子的检测方法，该发明具有以下优点:
[0018](1)无需对DNA进行巯基、氨基等修饰，降低了实验材料的成本。
[0019](2)通过DNA序列的设计和小分子待测物引发的核酸链式反应，实现了一个小分子待测物产生多个检测分子的结果，与以往方法中一个检测分子对应产生一个信号分子相t匕，检测信号得到放大，检测灵敏度得到提高。
[0020](3)通过H2链中过氧化物酶模拟片段的引入，使待测小分子的浓度与Η 202氧化四甲基联苯胺产生的有色物质的量成比例，简化了信号获得的过程，同时避免了对DNA进行分子标记。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为三元复合体系DNA的设计图以及赭曲霉毒素Α检测的示意图。
[0022]图2为溶液中赭曲霉毒素A的检测曲线。
【具体实施方式】
[0023]实施例1:
[0024]在50μ L—定浓度的赭曲霉毒素A溶液中加入10μ L的DNA H1； (H^DNA序列为 GATCGGGTGT GGGTGGCGTA AAGGGAGCAT CGGACACGCC ACCCACAC)水溶液，使氏的终浓度为InM,再加入10 μ L CaCl2溶液和10 μ L KC1溶液，使CaCl 2终浓度为10mM，KCl终浓度为20mM,再加入10 μ L氯化血红素溶液，使氯化血红素浓度为150ηΜ，混合均匀，反应10分钟。再加入 10 μ L 的另一种 DNA，即 H2 (H2的 DNA 序列为 CCACACCCGA TCCTGGGAGG GAGGGAGGGGTGTGGGTGGC G)水溶液，使112终浓度为InM，混合均匀，反应1小时。再加入80 μ L含有Η202的四甲基联苯胺溶液，(加入后溶液中Η202浓度为:0.03%，四甲基联苯胺浓度为:0.2 μ g/mL)混合均匀，反应1小时，再加入50 μ L 1Μ的盐酸，5分钟后测定溶液在波长为450纳米处的吸光度。绘制吸光度与赭曲霉毒素Α浓度的曲线。
[0025]取可能含有赭曲霉毒素A的食品(如面粉)1克，加入甲醇10mL，搅拌5分钟后，将溶液离心，吸取上部溶液5 μ L，再加入45 μ L水，作为实际样品(待测溶液)。重复上述步骤，将得到的吸光度值上述得到的浓度关系曲线进行对比，就得到了对应的赭曲霉毒素A的浓度。
[0026]实施例2:
[0027]在50μ L—定浓度的赭曲霉毒素A溶液中加入10μ L的DNA H1； (H^DNA序列为 GATCGGGTGT GGGTGGCGTA AAGGGAGCAT CGGACACGCC ACCCACAC)水溶液，使氏的终浓度为50nM，再加入10 μ L CaCl2溶液和10 μ L KC1溶液，使CaCl 2终浓度为10mM，KC1终浓度为20mM,再加入10 μ L氯化血红素溶液，使氯化血红素浓度为150ηΜ，混合均匀，反应10分钟。再加入 10 μ L 的另一种 DNA，即 Η2 (Η2的 DNA 序列为 CCACACCCGA TCCTGGGAGG GAGGGAGGGGTGTGGGTGGC G)水溶液，使112终浓度为50nM，混合均匀，反应1小时。再加入80 μ L含有H202的四甲基联苯胺溶液，(加入后溶液中H202浓度为:0.03%，四甲基联苯胺浓度为:0.2 μ g/mL)混合均匀，反应1小时，再加入50 μ L 1Μ的盐酸，5分钟后测定溶液在波长为450纳米处的吸光度。绘制吸光度与赭曲霉毒素Α浓度的曲线，如图2所示。
[0028]取可能含有赭曲霉毒素A的食品(如面粉)1克，加入甲醇10mL，搅拌5分钟后，将溶液离心，吸取上部溶液5 μ L，再加入45 μ L水，作为实际样品(待测溶液)。重复上述步骤，将得到的吸光度值上述得到的浓度关系曲线进行对比，就得到了对应的赭曲霉毒素A的浓度。
[0029]实施例3:
[0030]在50μ L—定浓度的赭曲霉毒素A溶液中加入10μ L的DNA H1； (H^DNA序列为 GATCGGGTGT GGGTGGCGTA AAGGGAGCAT CGGACACGCC ACCCACAC)水溶液，使氏的终浓度为ΙΟΟηΜ，再加入10 μ L CaCl2溶液和10 μ L KC1溶液，使CaCl 2终浓度为10mM, KC1终浓度为20mM,再加入10 μ L氯化血红素溶液，使氯化血红素浓度为150ηΜ，混合均匀，反应10分钟。再加入 10 μ L 的另一种 DNA，即 Η2 (Η2的 DNA 序列为 CCACACCCGA TCCTGGGAGG GAGGGAGGGGTGTGGGTGGC G)水溶液，使112终浓度为100nM，混合均匀，反应1小时。再加入80 μ L含有Η202的四甲基联苯胺溶液，(加入后溶液中Η202浓度为:0.03%，四甲基联苯胺浓度为:0.2 μ g/mL)混合均匀，反应1小时，再加入50 μ L 1Μ的盐酸，5分钟后测定溶液在波长为450纳米处的吸光度。绘制吸光度与赭曲霉毒素Α浓度的曲线。
[0031]取可能含有赭曲霉毒素A的食品(如面粉)1克，加入甲醇10mL，搅拌5分钟后，将溶液离心，吸取上部溶液5 μ L，再加入45 μ L水，作为实际样品(待测溶液)。重复上述步骤，将得到的吸光度值上述得到的浓度关系曲线进行对比，就得到了对应的赭曲霉毒素A的浓度。
[0032]SEQUENCE LISTING
[0033]<110>江苏大学
[0034]〈120〉一种三元复合体系检测探针的构建方法
[0035]〈160〉1
[0036]<170> Patent In vers1n 3.3
[0037]〈210〉1
[0038]〈211〉48
[0039]〈212〉DNA
[0040]〈213〉人工序列
[0041]〈400〉 1
[0042]1 GATCGGGTGT GGGTGGCGTA AAGGGAGCAT CGGACACGCC ACCCACAC 48
[0043]<110>江苏大学
[0044]〈120〉一种三元复合体系检测探针的构建方法
[0045]〈160〉2
[0046]<170> Patent In vers1n 3.3
[0047]〈210〉2
[0048]〈211〉41
[0049]〈212〉DNA
[0050]〈213〉人工序列
[0051]〈400〉2
[0052]1 CCACACCCGA TCCTGGGAGG GAGGGAGGGG TGTGGGTGGC G 41
【权利要求】
1.一种构建三元复合体系检测探针的方法，三元复合体系包含适配体，过氧化物酶模拟片段和核酸链式反应单元； 该方法能实现操作简单、灵敏快速，无需使用信号分子标记，对检测信号多级放大的目的，并对小分子，如赭曲霉毒素A进行灵敏检测； 其特征是:待测分子首先与核酸链氏反应，使H1的空间结构改变，由首尾相连的“发夹”结构变为直链结构，再加入核酸链H2,由于直链结构的氏序列中含有能与核酸链H 2反应的碱基序列，碱基互补配对后使核酸链H2空间结构由“发夹”结构变为直链结构，能够再与核酸链H1反应,经循环反应后,形成长链的H ^H2互补双链DNA结构； 再加入含过氧化氢的四甲基联苯胺溶液进行显色，由于每个核酸链4包含过氧化物酶模拟片段，在氯化血红素存在时，能够催化过氧化氢氧化四甲基联苯胺，产生有色物质，根据溶液吸光度与待测分子浓度间关系，可以得到其检测曲线。
2.根据权利要求1所述一种构建三元复合体系检测探针的方法，其特征在于按照下述步骤进行: (1)首先选取能与小分子赭曲霉毒素A作用的DNA片段(适配体)，根据适配体碱基序列，设计能与其形成分子内杂交互补的片段，连接到适配体的3’末端，形成三元复合体系中的探针H1; (2)根据H13’端的碱基序列，设计能够与其杂交互补的片段a，同时寻找能与a形成分子内杂交互补的片段b，连接到其5’末端，再选取能模拟过氧化物酶的碱基片段C，将以上三个片段依从3’端到5’端分别为a-c-b的顺序排列，形成三元复合体系中的探针H2; (3)小分子赭曲霉毒素A与H1的反应:取一定量含有赭曲霉毒素A的待测溶液,在其中加入氏水溶液，使H #冬浓度为1-100 nM，然后加入10微升CaCl 2水溶液和10微升KCl水溶液，使CaCljS浓度为10 mM, KCl终浓度为20禮，最后加入10微升氯化血红素水溶液，使氯化血红素终浓度为150 nM，混合均匀，反应10分钟； (4)加入H2后的链增长:在前述(3)的溶液中接着加入H2水溶液，使!12终浓度为1-100nM,充分混合均匀后，反应60分钟； (5)显色过程:在前述(4)的溶液中加入80微升含有H2O2的四甲基联苯胺溶液，使最终H2O2和四甲基联苯胺的浓度分别为0.03%和0.2微g/mL ； 最后反应60分钟后，加入50微升I M的盐酸，5分钟后测定波长为450纳米处的吸光度；绘制吸光度与待测溶液中赭曲霉毒素A的浓度关系曲线； (6)赭曲霉毒素A的检测:取可能含有赭曲霉毒素A的食品(如面粉)I克，加入甲醇1mL,搅拌5分钟后，将溶液离心，吸取上部溶液5微升，再加入45微升水，作为实际样品(待测溶液); 重复上述(3) (4)步骤，以及(5)步骤中除去绘制绘吸光度与待测溶液中赭曲霉毒素A的浓度关系曲线的其余步骤； 将得到的吸光度值与(5)中得到的浓度关系曲线进行对比，得到对应的赭曲霉毒素A的浓度，实现样品中赭曲霉毒素A的检测，从而实现一种三元复合体系检测探针方法的构建。
3.根据权利要求2所述的一种构建三元复合体系检测探针的方法，其特征在于其中所述的DNA片段氏如SEQUENCE LISTING1所示。
4.根据权利要求2所述的一种构建三元复合体系检测探针的方法，其特征在于其中所述的DNA片段4为所述的H 2如SEQUENCE LISTING2所示。
5.根据权利要求2所述的一种构建三元复合体系检测探针的方法，其特征在于其中所述的三元复合体系检测探针在检测赭曲霉毒素A的应用。
【文档编号】G01N21/31GK104502294SQ201410851334
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月31日 优先权日:2014年12月31日
【发明者】王承克, 王坤, 董晓娅, 刘倩 申请人:江苏大学