一种具有抗病毒和增强免疫活性的侧柏叶多糖及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及多糖领域，具体涉及一种具有增强免疫活性和抗乙型肝炎病毒活性的侧柏叶多糖的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]侧说I PlatycIadus orien tails (L.) Franco),别名香柯树、香树、扁桧、香柏、黄柏，隶属于裸子植物门(Gymnospermae)^松柏纲(Coniferopsida)、松杉目(Ctwi/kraJes)、柏科(侧柏属6.)。下级分类有金塔柏、金黄球柏、千头柏、窄冠侧柏。据《中国植物志》记载，侧柏是常绿乔木，高达20 m ;小枝片竖直排列。叶鳞片状，长1~3 mm，先端微钝，对生，两面均为绿色。球果卵形，长1.5~2 cm，褐色，果鳞木质而厚，先端反曲；种子无翅。原产我国北部，现南北各地普遍栽培。侧柏是常见的园林、造林树种，枝叶药用，能收敛止血、利尿、健胃、解毒散瘀；种子可榨油，入药有滋补强壮、安神、润肠之效。
[0003]侧柏叶是传统的中药，也是符合我国卫生部规定的保健食品原料之一。具有凉血止血、清肺止咳、抑菌等功能，其所含的主要成分为黄酮类化合物、鞣质及挥发油类等。侧柏叶中含有多种黄酮类化合物，包括杨梅素、杨梅苷、槲皮素、槲皮苷、阿曼托黄素、新柳杉、双黄酮、扁柏双黄酮、芦丁、柏黄酮和穗花杉双黄酮，其中以槲皮苷的含量最高。侧柏叶还含有多糖、蛋白质等，而这些大分子活性物质的研究与开发尚处于空白阶段。
[0004]专利申请公开号为US 5773005的美国专利公开了 “一种从侧柏中提取纯化具有5 α -还原酶(5α -reductase)抑制活性的黄酮和二蔽的方法”，公开日期为1998-06-30，申请人为Takahashi, Hidehiko等。方法如下:取侧柏叶粉，按料液比1:5加入正己烧混合后加热回流，过滤后真空浓缩；滤饼用初始原料2倍体积的60%乙醇溶解后过滤，将滤液真空浓缩得到组分A。正己烷萃取后的滤饼，加入5倍体积的60%乙醇，加热回流然后过滤；取滤饼加入3倍体积的纯净水，加热回流然后过滤；真空浓缩滤饼即得组分B，滤液回收浓缩即得组分C。该专利重点研究提取物对5α-还原酶(5 a -reductase)的抑制活性，研究成分为黄酮和二萜。
[0005]专利申请公开号为US 20100112107的美国专利公开了“一种具有睡眠促进作用的侧柏提取物的制备方法”，公开日期为2010-05-06，申请人为Xie，Xueji等。该专利发明了一种具有缓解生理睡眠障的侧柏提取物及其组合物。该组合物还可以包括睡眠促进功效的酸枣仁提取物、远志提取物或它们的混合物的至少一个。活性的评价方法为小鼠动物实验，研究巴比妥钠催眠的睡眠时间诱发、对小鼠自由活动的副作用、牵引试验以及斜板爬坡试验。
[0006]专利申请公开号为CN200610026475.3的专利公开了 “一种具免疫活性的夏枯草多糖组合物及其制备方法和应用”，授权日期为2010-06-02，申请人为上海中医药大学。该专利公开的夏枯草多糖组合物是由夏枯草的干燥果穗经水煎煮提取、醇沉、透析截取分子量为大于3000 Da的组分，凝胶过滤柱层析纯化后获得。该多糖组合物多糖含量大于50%，多糖分子量均大于5000 0&，主要由组分六、8-1、8-2、(:、0组成。本发明夏枯草多糖组合物可明显促进淋巴细胞转化增殖，诱生IFN-Γ，可作为用于制备提高哺乳动物免疫力的药物。
[0007]专利申请公开号为CN201110165019.8的公开了 “一种具有免疫活性的锦灯笼茎多糖及其制备方法”，授权日期为2013-02-20，申请人为东北师范大学。该发明通过水浸法提取，对水浸液提取物进行沉淀，用酶法和Sevage法联合脱蛋白，干燥得粗多糖；以生理盐水进行洗脱，冷冻干燥后得多糖Q-WSP ;经HPLC进一步纯化得到WSP。上述方法获得的WSP经HPLC测定其分子量大约为7000 Da,其组分均一。经气相色谱分析得单糖组分为Rha、Ara、Gal、Glc 和 GalA0
[0008]综上所述，目前关于侧柏叶多糖研究的文献或者专利均无报道。本发明创新性地以侧柏叶为原料，分离提取其中的多糖成分，并系统研究其结构特征、抗病毒活性及免疫增强活性。本发明公开了一种具有抗病毒活性和增强免疫活性的侧柏叶多糖的制备方法和应用，为相关保健食品的开发提供了新思路，为侧柏叶的深加工和综合利用奠定理论基础和技术基础。
【发明内容】
[0009]本发明所要解决的技术问题在于对侧柏叶中的多糖进行有效提取和分离纯化，并对分离纯化后的侧柏叶多糖的抗病毒活性和免疫活性进行研究，提供一种具有抗病毒和增强免疫活性的侧柏叶多糖及其制备方法和应用。
[0010]本发明通过以下技术方案实现。
[0011]本发明公开一种具有抗病毒和增强免疫活性的侧柏叶多糖是以侧柏叶为原料，主要经过如下工艺制备:热水浸提、Savege法除蛋白、乙醇沉淀、离子交换柱层析分离纯化、透析、真空冷冻干燥。
[0012]进一步地，所述制备方法包括以下步骤:
(1)将侧柏叶于40~ 80 ° C下干燥2 ~ 8 h，然后用打粉机粉碎；
(2)热水浸提2~ 6 h，料液比为1: 20 ~ 1: 40 g/mL，热水温度为60 ~ 100 ° C，浸提次数为I ~ 3次；
(3)采用Sevage法对热水浸提物进行脱蛋白处理10~ 12次，收集上层多糖溶液然后进行浓缩和干燥；
(4)往脱除蛋白后的粗多糖溶液中加入乙醇溶液，于O~ 4 ° C下静置过夜；然后进行高速离心，收集沉淀物，真空冷冻干燥后得到侧柏叶粗多糖；
(5)采用离子交换柱层析对冻干后的侧柏叶粗多糖进行分离纯化，收集侧柏叶多糖洗脱峰浓缩后进行透析脱色，再进行真空冷冻干燥得到侧柏叶多糖样品。
[0013]进一步优化地，步骤(4)所述的乙醇是体积分数为65% ~ 95%的乙醇或者是无水乙醇，乙醇的加入量为粗多糖溶液体积的2 ~ 5倍。
[0014]进一步优化地，步骤(5 )中，采用离子交换柱层析分离纯化所用的填料为以下填料中的一种:DEAE Sepharose Fast Flow、DEAE_52、Sepharose XL、CM_52、Q Sepharose FastFlow、ANS Sepharose 4 Fast Flow、Q Sepharose Big Beads ;透析温度为 0 ~ 4 ° C，透析时间为48 ~ 60 ho
[0015]进一步优化地，步骤(5)所述纯化是采用去离子水和浓度为0.05mol/L -0.5 mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱。
[0016]细胞实验证明，所述侧柏叶多糖还可以抑制H印G 2.2.15细胞分泌HBeAg(乙型肝炎E抗原)和HBsAg (乙肝表面抗原)，表明其在体外具有抗乙型肝炎病毒的作用。该侧柏叶多糖可以通过激活小鼠巨噬细胞RAW264.7中的白介素-6 (IL-6)、白介素-12 (IL-12)、月中瘤坏死因子-α (TNF-α )和一氧化氮(NO)的分泌量，从而提高机体的免疫能力；
所述的侧柏叶多糖能应用于免疫缺陷类疾病或病毒感染类疾病的辅助治疗中；
所述的侧柏叶多糖能应用于制备抗乙肝病毒、提高免疫功能的保健食品中。
[0017]与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果:
本发明制备的侧柏叶多糖由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖和岩藻糖六种单糖组成，具有分子量均一、纯度高、热稳定性好的优点，并且还具有良好的抗病毒功效和免疫促进作用，可用于乙型病毒性肝炎及免疫缺陷类疾病的辅助治疗，也可用于抗病毒、提高免疫功能的保健食品。本发明的制备工艺简单合理、绿色环保，并且易于实现工业化大生产。
【附图说明】
[0018]图1为侧柏叶多糖离子交换柱层析洗脱曲线。
[0019]图2为侧柏叶多糖PPl的红外光谱图。
[0020]图3为侧柏叶多糖的热重分析(TG)和差示扫描量热分析(DSC)图。
[0021]图4为侧柏叶多糖PPl的单糖气相色谱图。
[0022]图5为不同浓度侧柏叶多糖PPl对IfepG2.2.15细胞毒性的MTT图。
[0023]图6为不同浓度侧柏叶多糖PPl对IfepG2.2.15细胞HBeAg分泌量的影响。
[0024]图7为不同浓度侧柏叶多糖PPl对IfepG2.2.15细胞HBsAg分泌量的影响。
[0025]图8为不同浓度侧柏叶多糖PPl对小鼠巨噬细胞毒性的MTT图。
[0026]图9为不同浓度侧柏叶多糖PPl对小鼠巨噬细胞IL-12分泌量的影响。
[0027]图10为不同浓度侧柏叶多糖PPl对小鼠巨噬细胞IL-6分泌量的影响。
[0028]图11为不同浓度侧柏叶多糖PPl对小鼠巨噬细胞TNF-