专利名称：一种茶树菇活性多糖及其制备方法
技术领域：
本发明属于天然产物制备方法领域，更具体涉及一种茶树菇活性多糖及其制备方法。
背景技术：
目前对真菌多糖药用生理活性的基础研究、真菌多糖提取工艺条件的探讨虽有很多报道，但相关药用生理活性研究缺乏对供试材料制备条件与活性试验结果联系的探讨; 加工工艺的探讨仅限于以多糖得率为评价指标优化其提取工艺，以多糖保存率和蛋白脱除率为评价指标优化脱蛋白工艺。由于不同的提取和脱蛋白工艺对多糖生物活性的保持有很大的影响，使得目前市场上出现的真菌多糖产品普遍缺乏明确的活性质量指标，产品推广应用受到严重的制约。从真菌活性多糖产品质量明确、可控和经济、高效开发产品的角度， 建立科学合理的真菌活性多糖提取、加工工艺综合评价体系，成为促进真菌活性组分利用产品开发和广泛应用的关键因素。
发明内容
为改善目前茶树菇活性多糖产品开发加工工艺评价和选择缺乏合理科学的方法， 导致茶树菇多糖产品普遍缺乏明确的活性质量指标，产品推广应用受到严重制约的现状， 本发明提供一种具抗肝组织脂质过氧化作用和促进小鼠巨噬细胞吞噬作用的茶树菇活性多糖的制备方法，该制备方法的思路也可适用于其他多糖的制备。本发明是通过如下技术手段实施的
一种茶树菇活性多糖的制备方法包括茶树菇粗多糖超声提取、茶树菇粗多糖脱蛋白处理步骤，以多糖抗脂质过氧化活性为产品标示主要活性指标；对温度、时间、功率、PH进行单因素试验和正交试验，以提取物得率、生物活性检测值综合评分得分高的工艺条件，作为茶树菇活性多糖的优化微波提取条件；以多糖保存率、生物活性检测值、蛋白脱除率综合评分得分高的工艺条件，作为茶树菇活性粗多糖的优化脱蛋白条件；
所述提取物得率，生物活性检测值综合评分得分高，是指提取物得率权重系数设为 0. 4，多糖抗脂质过氧化活性权重系数设为0. 6，加权求和计算得分，得最高；
所述多糖保存率、生物活性检测值、蛋白脱除率综合评分得分高，是指多糖保存率的权重系数设为0. 3，多糖抗脂质过氧化活性的权重系数设为0. 3、蛋白脱除率的权重系数设为 0. 4，加权求和计算得分，得最高分。所述多糖抗脂质过氧化活性的检测方法包括对茶树菇粗多糖的抗小鼠肝组织脂质过氧化活性试验。所述的茶树菇活性多糖的主要活性成分是分子量为3X IO5的酸性多糖。本发明的优点为
1)本发明采用综合评分法评价和筛选确定既能很好保持茶树菇多糖生物活性，又具备较高茶树菇多糖得率的提取工艺，与现有技术以多糖得率为指标优选提取工艺并获得多糖后，将多糖样品进行活性认定试验的工艺研究方法相比较，本发明可以有效避免由于加工工艺评价不当，造成加工过程活性成分的丢失；
2)评价确法，脱蛋白处理工艺，可以保证活性多糖有较好的保存率、较高的蛋白脱除率，且脱蛋白茶树菇活性多糖的活性能够得到较好的保持，避免活性多糖组成的破坏，适应工业化生产脱蛋白茶树菇活性多糖的需要；
3)制备过程所采用的工艺条件温和，能够最大限度的保持活性多糖的抗肝组织脂质过氧化活性、促进小鼠巨噬细胞吞噬活性，且活性多糖得率高，茶树菇原料利用率高，加工经济效益好；
4)本发明提出的茶树菇活性多糖加工工艺优化方法和主要工作思路，不仅适用于本发明，而且同样适用于其他涉及茶树菇活性多糖加工工艺的探讨，不同形式的茶树菇活性多糖产品，如抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗突变、提高免疫力等茶树菇活性多糖产品，通过调整活性试验的方法，即可方便的完成相关工艺的优化、评价工作。
图1为L9 (34)正交试验设计表及结果；
图2为不同脱蛋白方法对多糖保存率、蛋白脱除率及抗脂质过氧化活性的影响，注1) 表中数据为3次重复的平均值；大小写字母分别表示经LSD检验在5%和1%水平上的显著性差异。
具体实施例方式通过单因素试验、正交试验，获得不同提取工艺条件下茶树菇多糖得率及提取多糖抗肝组织脂质过氧化抑制率，综合评分法评价和筛选确定既能很好保持茶树菇多糖生物活性，又具备较高茶树菇多糖得率的提取工艺，以该工艺条件(提取温度80 °C、pH值7. 5、 超声波处理30 min)制备茶树菇活性粗多糖。采用Sevag法、酶法与^^叫法联用、三氯乙酸法、三氯乙酸法与Sevag法联用、 等电点法等方法，对茶树菇活性粗多糖进行脱蛋白处理，以多糖保存率、蛋白脱除率、多糖脂质过氧化抑制率为指标，比较不同工艺脱蛋白效果及对茶树菇多糖活性保持的影响，确定适宜的脱蛋白工艺，以该工艺条件对茶树菇活性粗多糖进行脱蛋白处理，制备茶树菇脱蛋白活性多糖。为实现茶树菇活性多糖生产过程条件和产品质量可控，将茶树菇脱蛋白活性多糖样品经DEAE-52层析分离、活性跟踪、主要活性部位分子量测定，明确茶树菇抗肝组织脂质过氧化作用的主要活性成分多糖的分子量为3X105，该活性多糖对促进小鼠巨噬细胞吞噬作用也表现出较好的生物活性。在此基础上，提出分子量3X IO5多糖可以作为本发明茶树菇活性多糖产品的质量控制指标成分，并提出不同茶树菇活性提取物产品的质量控制方法。本发明制得的茶树菇活性多糖为浅茶色颗粒，略有特有的香味，溶于水，不溶于醇和油脂。茶树菇活性粗多糖主要质量控制指标分子量3X IO5酸性多糖的含量> 40% ；蛋白质含量< 5%。茶树菇脱蛋白活性多糖主要质量控制指标分子量3X IO5酸性多糖的含量> ；蛋白质含量< 2%。两产品可作为原料药或食品添加剂提供给制药与食品加工企业，生产不同药物或功能性食品。实施例1
1)、称取茶树菇干品500g，粉碎处理后，加1500mL水搅勻，依正交试验设计的因素和水平，分别以不同条件(PH5-10，冻融、超声、微波处理，50-100°C)浸提三次(正交试验结果见图1)，每次1. 5 h,5000 rpm离心15 min，弃沉淀留上清液，上清液浓缩至原体积的约1/4， 再加4倍于浓缩后体积的95%乙醇，醇析M h，5000rpm离心15 min,弃上清液，得各沉淀分离样，测定各沉淀分离样活性提取物得率和抗肝组织脂质过氧化活性，综合评价确定优化提取条件；以优化条件提取制备活性提取物，冷冻干燥即得茶树菇活性粗多糖；该茶树菇活性粗多糖其主要活性成分3 X IO5酸性多糖含量> 40. 0%，蛋白质含量< 5. 0%。提取物得率的权重系数设为0. 4，抑制率的权重系数设为0. 6，以综合分进行统计分析，结果见图1。综合评分Y=O. 4 X 100 / 0. 1456 + 0. 6 X 100 / 0. 1664 公式 1)； 直观分析表明，以综合评分为标准，在所选因素水平范围内，细胞破碎方式和溶液PH
对茶树菇粗多糖提取效果影响最大，温度影响最小。经方差分析，各因素没有显著性，故以直观分析选取最佳提取条件为A2B2C1，即温度80°C、pH7. 5、冻融3次。综上所述，高温及强碱不利于多糖生物活性的保持，冻融处理能显著提高多糖得率，且能很好的保持多糖生物活性，但不利于简化工艺、降低成本的工业生产要求。因此依据正交试验的结果，提取温度80 1、？!1值7.5、超声波处理30 min为最佳提取工艺组合。2)、取1)优化条件下所得茶树菇活性粗多糖提取液，分别以Sevag法、酶法与^^叫法联用、三氯乙酸法、三氯乙酸法与Sevag法联用、等电点法进行脱蛋白处理， 4000rpm离心15min后，测定各脱蛋白样多糖保存率、蛋白脱除率和抗肝组织脂质过氧化活性，综合评价确定优化脱蛋白工艺条件；以优化工艺条件对茶树菇活性粗多糖提取液进行脱蛋白处理将茶树菇活性粗多糖提取液减压浓缩至1/3体积，与氯仿-正丁醇混合液(氯仿正丁醇=4 1)等体积混合后，剧烈震荡5min，静置浊后，4000rpm离心15min，重复处理三次后，离心液加3倍体积95%乙醇，醇析Mh，4000rpm离心15min，丙酮洗涤沉淀，沉淀冷冻干燥即得茶树菇脱蛋白活性多糖。该茶树菇脱蛋白活性多糖其主要活性成分分子量 3X105酸性多糖的含量> 观.0% ；蛋白质含量< 2.0%。用不同脱蛋白方法处理粗多糖的试验结果见图2 综合评分参考公式1)；
三氯乙酸-Sevag法、酶-Sevag法和三氯乙酸法多糖保存率较高，分别达到85. 52%、 83. 43%,82. 88%，在LSD检验的5%水平上差异不显著。等电点法、Sevag法多糖保存率较低为72. 34%、73. 06%,就多糖保存率这个指标而言，三氯乙酸-Sevag法、酶-Sevag法和三氯乙酸法效果较好。酶-Sevag法蛋白脱除率最高，达到79. 50%，与其他方法相比，在LSD检验的1%水平上差异极显著，Sevag法次之，所以单从蛋白脱除率这个指标考虑，酶-Sevag法较好。没有脱蛋白的多糖对脂质过氧化的清除作用效果最好，与脱蛋白的多糖相比，在 LSD检验的1%水平上差异极显著(表3-1)，Sevag法和等电点法次之。生物体中的多糖可以多种形式存在，其中，聚糖与肽、蛋白结合可以形成糖肽或糖蛋白。茶树菇粗多糖生物活性成分可能是粗多糖中的聚糖，也可能是其中的游离蛋白，也可能是糖与蛋白的结合物，需要分类探讨。
酶法与Sevag法联用脱蛋白率比较高，并且能很好的保持多糖含量，该结果和大量文献资料报道的结论一致，酶法与Sevag法联用是最佳的脱蛋白方法，但采用该工艺脱蛋白却严重削弱了茶树菇粗多糖的抗脂质过氧化作用能力。组合应用酶解技术，可能破坏了结合蛋白复合多糖的共价结合，从而降低了茶树菇多粗糖的生物活性。Sevag法脱蛋白效率相对较高，由于反复重复操作，多糖损失很多，消耗了大量的有机溶剂，但是活性保持比较好。试验结果提示，Sevag法脱除的蛋白可能大多是游离蛋白， 脱蛋白过程没有破坏糖与蛋白的共价结合，
三氯乙酸法和三氯乙酸法与Sevag法联用这两种方法脱蛋白，脱除次数少、损耗有机溶剂少，对多糖的保存有利，脱蛋白效果也比较好，但由于三氯乙酸法条件剧烈，对多糖的活性破坏很严重，所以活性很差。未经脱蛋白工艺处理的茶树菇粗多糖对脂质过氧化作用的清除效果最好。该试验结果表明，蛋白存在形态以及其受损程度对茶树菇粗多糖活性的保持具有较大的影响。综上所述，茶树菇多糖的抗脂质过氧化活性是蛋白和多糖共同作用的结果，茶树菇粗多糖组成中，多糖与蛋白间可能存在共价结合，活性成分为复合多糖。因此为了更好的保持多糖的生物活性，茶树菇多糖主产品开发，最好不做脱蛋白处理。从增加产品种类，更好的适应产品市场的多种需求考虑，应根据市场需求的情况，开发生产一定量的脱蛋白茶树菇多糖产品，该类产品生产过程脱蛋白工艺以Sevag法为宜。以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
权利要求
1.一种茶树菇活性多糖的制备方法，其特征在于所述制备方法包括茶树菇粗多糖超声提取、茶树菇粗多糖脱蛋白处理步骤，以多糖抗脂质过氧化活性为产品标示主要活性指标；对温度、时间、功率、PH进行单因素试验和正交试验，以提取物得率、生物活性检测值综合评分得分高的工艺条件，作为茶树菇活性多糖的优化微波提取条件；以多糖保存率、生物活性检测值、蛋白脱除率综合评分得分高的工艺条件，作为茶树菇活性粗多糖的优化脱蛋白条件。
2.根据权利要求1所述的一种茶树菇活性多糖的制备方法，其特征在于所述提取物得率，生物活性检测值综合评分得分高，是指提取物得率权重系数为0. 4，多糖抗脂质过氧化活性权重系数为0. 6，加权求和计算得分，得最高得分。
3.根据权利要求1所述的一种茶树菇活性多糖的制备方法，其特征在于所述多糖保存率、生物活性检测值、蛋白脱除率综合评分得分高，是指多糖保存率的权重系数为0.3， 多糖抗脂质过氧化活性的权重系数为0. 3、蛋白脱除率的权重系数为0. 4，加权求和计算得分，得最高分。
4.根据权利要求1所述的一种茶树菇活性多糖的制备方法，其特征在于所述多糖抗脂质过氧化活性的检测方法包括对茶树菇粗多糖的抗小鼠肝组织脂质过氧化活性试验。
5.一种如权利要求1、2、3或4所述的制备方法制备的茶树菇活性多糖，其特征在于 所述的茶树菇活性多糖其主要活性成分是分子量为3X105的酸性多糖。
全文摘要
本发明涉及一种茶树菇活性多糖及其制备方法，该方法以茶树菇为基础材料，引入活性评价指标，经提取、脱蛋白条件试验，对多指标进行综合分析，评价和筛选既能很好保持茶树菇多糖生物活性，又具备较高茶树菇多糖得率的提取加工工艺，以优化的工艺条件制备茶树菇活性粗多糖和茶树菇脱蛋白活性多糖，通过茶树菇脱蛋白活性多糖样品柱层析分离、活性跟踪、主要活性部位分子量测定，明确茶树菇活性多糖抗肝组织脂质过氧化作用的主要活性成分是分子量为300000酸性多糖，该多糖对促进小鼠巨噬细胞吞噬作用也表现出较好的生物活性。该方法可以避免提取，分离多糖工艺评价选择的盲目性，通过以生物活性为指标制备的茶树菇活性多糖，具有良好的经济效益。
文档编号C08B37/00GK102276744SQ20111016378
公开日2011年12月14日 申请日期2011年6月17日 优先权日2011年6月17日
发明者俞白楠, 叶舟, 吕千, 吕杨兰, 康彦斌, 李会霞, 汪世华 申请人:福建农林大学