专利名称：一种具杀线虫活性的木霉属真菌及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种杀线虫真菌及其制备方法与应用。
背景技术：
植物寄生线虫是一类重要的病原微生物，分布广、种类多，全世界已报道的植物线虫有200多属5000余种，给农林业生产造成严重为害(冯志新，2001)。据估计全球每年由植物寄生线虫所造成的作物损失达780亿美元(Barker et al，1998)。就现今危害最为严重的线虫种类——根结线虫而言，其有着广泛的寄主，且为世界性分布，每年可给全球作物总产量造成10%以上的损失(Whitehead，1998)。植物线虫具有隐蔽性、多寄主性、顽固性、易传播的特点，其种群增长迅速，给防治上带来了诸多的困难。自从20世纪40年代化学技术的革命后，化学杀虫剂被广泛用于农林业生产，并在害虫防治中占居重要地位，与此同时，由于人们长期过分依赖化学农药，且缺乏生态意识，造成了严重的环境污染。杀线虫剂多为高毒力高残留化学农药，这些药物对人畜不安全，对环境污染严重，并易使线虫产生抗药性，对有益生物杀伤力强。随着人们环保意识的增强，对健康食品要求的日益增高，以往用于植物线虫防治的高毒农药多以法律的形式给予了禁用，人们将研究重点转向了生物防治。生物防治具有对人畜安全，对环境友好等优点，因此，生物防治方法在植物线虫病害的防治地位尤显重要。目前木霉是多种植物病害包括根结线虫病的重要生防菌，绿木霉是重要的生防木霉之一，研究开发绿木霉对防治植物寄生线虫具有重要意义。目前关于绿木霉的相关技术报道有限，市场上无来源于木霉菌尤其是绿木霉菌的用于防治线虫的商品生防制剂，尚属技术空白。
发明内容
本发明的目的是弥补现有技术的不足，提供一株新的具有杀线虫功能的绿木霉真菌。本发明的另一个目的是提供所述绿木霉的分离方法。本发明的另一个目的是提供所述绿木霉的制备方法。本发明还有一个目的是提供所述绿木霉的应用。本发明的目的通过以下技术方案予以实现本发明提供一株具杀线虫活性的绿木霉，本申请人从广东省深圳湾红树林根际土样中分离得到一株对线虫具有很好毒杀作用的绿木霉(Hypocrea virens H22，缩写为 H. virens H22)，菌株于2011年9月2日保存于中国湖北武汉市武昌珞珈山中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO =M 2011303。所述绿木霉菌株的分离方法为在CMA平板上撒l.Og 土样，接入约1000条南方根结线虫二龄幼虫，25°C培养3天(d)后，镜检并用针挑取死虫体上及其周围单个的真菌分生孢子于含硫酸链霉素50ppm的CMA平板上，纯化获得真菌；所述CMA培养基为20g玉米粉， 15g琼脂粉，IOOOml水。所述绿木霉(H. virens H22)的菌株形态特征为在PDA上初期为白色，中期颜色逐渐变为浅绿色，有发达的气生菌丝，后期产生大量的分数孢子梗及分生孢子，分生孢子梗对生或互生分枝，分枝上可再分枝，分枝顶端为小梗，瓶状，由小梗生出分生孢子，分生孢子近球形，多个分生孢子粘聚成球形的孢子头。本发明进一步对绿木霉进行分子鉴定，扩增靶标序列为ITS区，ITS序列如表SEQ ID NO 1 所示。本发明同时提供了所述绿木霉(Hypocrea virens H22)的制备方法，包括固体培
养基培养或液体培养基培养方法。所述固体培养基配方为马铃薯琼脂培养基(PDA) :200g马铃薯，20g葡萄糖，20g 琼脂粉，IOOOml水；培养方法为将绿木霉(H. virens H22)菌丝体接种到PDA培养基上，用封口膜封口后于25 下培养2 3天。所述液体培养基配方为CMA培养液，配方为玉米粉20g，蒸馏水1000mL。培养方法为在每个500mL三角瓶装200mL CMA培养液，121 °C下湿热灭菌20min，冷却后每瓶接入5片活化后的绿木霉菌圆片，在180rmp27°C下暗培养8d后，在4°C条件下12000rmp离心IOmin
得上清液。上清液可保存于4°C冰箱中待用。本发明提供了所述绿木霉(H. virens H22)的应用，根据其对线虫的显著活性，提供其在杀灭植物寄生线虫方面的应用，并具体提供了杀线虫药剂试验结果。根据所述应用，本发明进一步提供了所述绿木霉(H. virens H22)在制备植物寄生线虫生防制剂方面的应用。优选地，利用绿木霉(H. virensH22)的幼嫩孢子；优选的剂量范围是3X107 3X109个孢子/kg 土壤。本发明的有益效果是本发明提供了一株新的绿木霉(H. virens H22)菌株，具有良好的杀线虫活性，可应用于制备杀线虫活性制剂，填补了本技术领域的技术不足，并进一步提供了所述绿木霉 (H. virens H22)的分离和培养方法及应用，为生物防治线虫提供重要的技术基础。
图1固体培养基培养绿木霉(H. virens H22)对全齿复活线虫的作用；图2固体培养基培养绿木霉(H. virens H22)对松材线虫的作用；图3固体培养基培养绿木霉(H. virens H22)对爪哇根结线虫的作用；图4固体培养基培养绿木霉(H. virens H22)对南方根结线虫的作用；图5绿木霉(H. virens H22)对南方根结线虫卵孵化的抑制率；图6绿木霉(H. virens H22)液体培养液对南方根结线虫的作用；图7绿木霉(H. virens H22)对南方根结线虫的效果的情况(防治效果)；图8绿木霉(H. virens H22)不同的施菌量对番茄伸长生长的影响情况；图9绿木霉(H. virens H22)不同的施菌量对番茄生物量的影响情况。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂原料均为常规市购产品。实施例1绿木霉(H. virens H22)的分离和鉴定培养基配方为CMA培养基20g玉米粉，15g琼脂粉，IOOOml水。在培养基上撒1. Og 土样(取自广东省深圳湾红树林根际)，接入约1000条南方根结线虫二龄幼虫(J2)，25°C培养3d后，镜检并用针挑取死虫体上及其周围单个的真菌分生孢子于含硫酸链霉素50ppm的CMA平板上，纯化获得真菌。所述绿木霉(Hypocrea virens H22)的菌株形态特征为在PDA上初期为白色，中期颜色逐渐变为浅绿色，有发达的气生菌丝，后期产生大量的分数孢子梗及分生孢子，分生孢子梗对生或互生分枝，分枝上可再分枝，分枝顶端为小梗，瓶状，由小梗生出分生孢子，分生孢子近球形，多个分生孢子粘聚成球形的孢子头。本发明进一步对绿木霉进行了分子鉴定，扩增靶标序列为ITS区，通过以下实验步骤获得ITS序列如表SEQ ID NO 1所示。(1)基因组DNA的提取(a)用解剖刀刮取PDA平板上27°C培养3d的菌丝在液氮中研磨成粉状；将菌丝粉迅速放入1. 5mL的液氮预冷离心管中，每管0. 3g ；(b)用 500 μ L DNA抽提缓冲液(IOOmM Tris-HCl, 750mM NaCl, 40Mm EDTA)悬浮步骤(a)离心管中的菌丝粉，并加入50μ L 20%十二烷基硫酸钠(SDQ轻轻混合，37°C处理 Ihr ；(c)加入 75 μ L 的 5Μ NaCl 禾口 65 μ L CTAB 溶液(0. 75Μ NaCl 含 10% CTAB)，65°C 水浴20min ；(d)加入步骤(c)管中液体等体积的酚-氯仿-异戊醇05 24 1，体积比) 抽提，5000g离心lOmin，取上清；(e)重复步骤d ；(f)加 2 μ L RNase (10mg/mL) 37°C处理 30min ；(g)加入与步骤(f)管中液体等体积的异丙醇混勻，5000g，离心IOmin沉淀DNA ；(h)用0. 5mL体积比浓度为70%的酒精洗涤沉淀，离心2min，倒掉酒精，风干；(i)加入 30 μ L TEdOmM Tris-HCl, IMm EDTA, ρΗ8· 0)重新悬浮 DNA ；(j)每个管中的样取ZyLJarkerfOOO (Takara，日本)取5yL，用的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度。(2) ITS 区的 PCR 扩增以菌株的基因组DNA为模板，用真菌通用引物ITSl和ITS4扩增ITS区的片段。所述ITSl和ITS4的核苷酸序列如下ITSl 5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3‘；ITS4 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3‘；反应体系模板1 μ L ;10X 缓冲液2. 5 μ L ；4XdNTP 0. 5 μ L ；引物 ITSll μ L ；引物 ITS41 μ L ；酶0. 25 μ L ；水18. 75 μ L。以不加模板为阴性对照。反应程序94°C5min ；94°C 30sec — 55°C 30sec — 72°C lmin，35 个循环；72°C2min ；4°C 00。PCR产物切胶回收，连接到PMD-18T载体，然后转化克隆，送交上海博尚生物技术有限公司测序。(3)序列分析序列分析的结果通过国际互联网进行序列同源性检索，检索主程序采用BLASTN， 即核酸序列对核酸序列数据库的检索，序列分析采用DNAMar软件进行。比对结果发现与该菌同源性最高的均为绿木霉(HQ608079，JF439516，⑶111539， HQ229950和HQ229948)真菌，同源性均超过99%，进一步表明本发明所述菌为绿木霉菌。实施例2绿木霉(H. virens H22)的固体培养培养基配方为马铃薯琼脂培养基(PDA培养基)200g马铃薯，20g葡萄糖，20g琼脂粉，IOOOmL水；在每个90mm的培养皿中倒入约占培养皿高度1/3厚的PDA培养基，将绿木霉 (H. virens H22)菌丝体接种到PDA培养基上，用封口膜封口后于25 下培养2 3 天。将菌种保存于4°C冰箱中待用，或直接配备孢子培养液使用。实施例3绿木霉(H. virens H22)的液体培养培养基配方为CMA培养液玉米粉20g，蒸馏水1000mL。每个500mL三角瓶装200mL CMA培养液，121°C下湿热灭菌20min，冷却后每瓶接入5片活化后的绿木霉菌圆片，在180rmp 27°C下暗培养8d后，在4°C条件下12000rmp离心IOmin得上清液，上清液保存于4°C冰箱中待用。实施例4绿木霉(H. virens H22)杀线虫活性试验1、制备试验用线虫(1)制备全齿复活线虫(Panagrellus redivivus)将全齿复活线虫(来自中国科学院微生物研究所，也可以采用本领域实验室使用的同类线虫)接种于燕麦片培养基(组成10g燕麦片，30ml水)上，25°C下培养6天左右， 置于4°C冰箱备用。使用前将所需线虫用贝曼漏斗法洗出，置于5ml离心管内加入无菌水， 瞬时离心，弃上清，重复3次得到洁净供试线虫。(2)制备丰公材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)在倒入1/3厚PDA培养基的培养皿中接入拟盘多毛孢(Pestalotiopsissp.)(华南农业大学植物线虫研究室保存，也可以采用本领域实验室使用的同类线虫)，25°C培养 4 7天。待菌丝铺满培养皿后，接种松材线虫，25°C培养5 8天。用无菌水将线虫冲洗， 制成含量为2条/ μ 1的线虫悬浮液。(3)制备爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)卵及二龄幼虫取爪哇根结线虫(本实施例采用的爪哇根结线虫采自云南昆明，单卵块纯化后保存于华南农业大学植物线虫研究室，也可以采用本领域实验室使用的同类线虫)的单卵块接种至预先在消毒土壤中培育2周的感病番茄或马铃薯植株上，约45d后，将根拔起用自来水洗净，于解剖镜下挑取根上卵块，其中卵块放入带盖的IOmL离心管中，加入5mL 0. 5% NaClO,用力振荡3min，迅速通过双层筛，上层筛孔径为250 μ m,下层筛孔径为38 μ m， 然后用无菌水收集冲洗下层筛中的卵粒；剩余1/2的卵块置于双层网筛(铁丝网和滤纸) 上，网筛浸于加有灭菌水的灭菌培养皿内，25°C孵化3天收集已孵化的二龄幼虫。
(4)制备南方根结线虫(Meloidogyne incognita)卵及二龄幼虫南方根结线虫采自广东广州，单卵块纯化后保存于华南农业大学植物线虫研究室，卵及二龄幼虫的获得方法同爪哇根结线虫(Meloidogynejavanica)卵及二龄幼虫的制备方法。2、试验方法(1)固体培养基培养绿木霉(H. virens H22)对全齿复活线虫(Pnanagrellus redivivus)的生测试验参照实施例2，将绿木霉(H. virens H22)用PDA平板活化生长3d后，用直径为5mm 的打孔器在菌落边缘打取生长一致的菌丝块，接种到直径为90mm含约20ml PDA培养基的培养皿中央，27. 5°C下，12h光照-1 黑暗交替培养2d，在每皿菌落边缘加入无菌水配制的全齿复活线虫液10 μ 1 (约200条虫)，然后在27. 5°C的恒温箱中培养，分别于接虫后Mh、 48h和7 在倒置显微镜下观察记录死亡线虫数和线虫总数。在PDA培养基平板上接入相当数量的线虫做为对照。每个处理3个重复。根据以下公式计算线虫的死亡率和校正死亡率，三个重复求平均
死亡率(％) =χ·
Y Μ观察的线虫总数
校正死亡率(%)=处理组线虫死亡率—对照组线虫死亡率χ· 1乂 7 牛1—对照组线虫死亡率虫液密度的确定收集活跃的全齿复活线虫(P. redivivus)，用0. 次氯酸钠溶液消毒3min，用无菌水漂洗3次GOOOrpm/min离心3min，吸走上清液，再加入无菌水漂洗)，然后再4000rpm/min离心^iin收集线虫于玻璃广口瓶中，吸取IOul显微镜下观察，计数三次。计算虫的实际数量密度后，测量实际总体积数，再用灭菌水进行稀释至20000条/
mLo(2)固体培养基培养绿木霉(H. virens H22)对松材线虫的生测试验生测试验方法同固体培养基培养绿木霉(H. virens H22)对全齿复活线虫 (Pnanagrellus redivivus)白勺生IlJi式验。(3)固体培养基培养绿木霉(H. virens H22)对爪哇根结线虫的生测试验生测试验方法同固体培养基培养绿木霉(H. virens H22)对全齿复活线虫 (Pnanagrellus redivivus)白勺生IlJi式验。(4)固体培养基培养绿木霉(H. virens H22)对南方根结线虫的生测试验生测试验方法同固体培养基培养绿木霉(H. virens H22)对全齿复活线虫 (Pnanagrellus redivivus)白勺生IlJi式验。(5)绿木霉(H. virens H22)对南方根结线虫卵孵化的抑制试验参照实施例3，在直径为9cm的玉米粉培养基平板上接入Iml绿木霉(H. virens H22)液体培养上清液，均勻涂布于平板上，再接入约200粒南方根结线虫卵粒，放于25°C培养箱种培养5 7d后，检查卵的孵化率。对照平板中加入Iml无菌水和卵粒。每个处理3 次重复。根据以下公式计算线虫卵孵化的抑制率和校正抑制率，三个重复求平均
[008
权利要求
1.一种具杀线虫活性的木霉属真菌绿木霉(Hypocrea virens H22)，于2011年9月2 日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO :M 2011303。
2.根据权利要求1所述具杀线虫活性的木霉属真菌绿木霉H22菌株，其特征在于具有如表SEQ ID NO 1所示ITS序列。
3.—种权利要求1具杀线虫活性的木霉属真菌绿木霉的制备方法，其特征在于是将所述真菌的菌丝体接种到PDA培养基斜面上培养得到；所述PDA培养基组成为200g马铃薯、 20g葡萄糖、20g琼脂粉和IOOOml水。
4.一种权利要求1所述具杀线虫活性的木霉属真菌绿木霉的制备方法，其特征是在于将所述真菌的圆片接种于液体培养液培养暗培养后离心得上清液；所述液体培养液为CMA 培养液组成为玉米粉20g，蒸馏水1000mL。
5.一种权利要求1所述具杀线虫活性的木霉属真菌绿木霉的应用，其特征在于应用于防治植物寄生线虫。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于应用于杀灭固着性内寄生线虫或迁移性内寄生线虫。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于采用所述真菌的幼嫩孢子制备植物寄生线虫生防制剂。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于是所述植物寄生线虫生防制剂的剂量范围是3X107 3X109个孢子/kg 土壤。
全文摘要
本发明公开了一种具杀线虫活性的木霉属真菌及其制备方法与应用。所述具杀线虫活性的木霉属真菌为绿木霉(Hypocrea virens H22)，于2011年9月2日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2011303。本发明提供了所述食线虫真菌的制备方法，包括液体培养法或固体培养法。本发明菌株对线虫具有良好的杀线虫活性，可应用于制备植物寄生线虫生防制剂，具有较好的应用前景。
文档编号A01N63/04GK102399703SQ20111037661
公开日2012年4月4日 申请日期2011年11月23日 优先权日2011年11月8日
发明者卓侃, 唐照磊, 廖金铃 申请人:华南农业大学