一种具有抗癌活性的黑根霉多糖及其应用的制作方法

一种具有抗癌活性的黑根霉多糖及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种具有抑制BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖及其应用，一株具有产抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖的黑根霉(Rhizopus?nigricans)RN-9，该菌株于2013年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC?NO.8436。本发明还提供黑根霉(Rhizopus?nigricans)RN-9在制备具有抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖中的应用。本发明所述黑根霉(Rhizopus?nigricans)RN-9具有产抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖的功能。
【专利说明】一种具有抗癌活性的黑根霉多糖及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种具有抑制BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖及其应用，属于生物医药【技术领域】。
【背景技术】
[0002]随着世界总人口持续增长和人口老龄化的加剧，以及逐年增多的患癌高危行为，使得全球癌症患者数量急剧增加。据美国癌症协会(ACS)统计数据显示，2008年全球约有760万癌症患者死亡，其中胃癌死亡病例达74万，中国每年约有23万人死于胃癌。不合理饮食和幽门螺旋杆菌感染是导致胃癌的重要原因。在我国山东省临朐县、辽宁省庄河县、福建省长乐县最具代表性的胃癌高发地区。
[0003]大部分胃癌患者在确诊时已处于晚期阶段并往往伴发多种疾病，使得胃癌的治愈尤为困难。手术合并化学疗法是胃癌治疗的主要手段，但是化疗药物会导致严重的副作用，迫切需要寻找高效、低毒的新型肿瘤治疗药物。
[0004]多糖是由10个以上的单糖通过糖苷键连接形成的含醛基或酮基的多羟基聚合物及其衍生物。天然功能性多糖作为一类重要的生物活性物质，具有抗肿瘤、免疫调节、抗病毒、抗氧化等多种功能。天然活性多糖的细胞毒性小、免疫原性极低、安全性高，是开发癌症治疗药物的重要来源。 目前，已有多种抗肿瘤辅助多糖药物作为辅助治疗肿瘤的药物在临床应用，如香菇多糖、云芝多糖等。
[0005]1969年Chiharals首次发表关于真菌多糖的抗肿瘤的研究结果后，多种具有免疫调节、抗肿瘤等活性的多糖被陆续发现。多糖是重要的生物效应调节剂(BiologicalResponse Modifier, BRM),主要通过激活机体的淋巴细胞,提高免疫系统响应能力，间接的发挥抗肿瘤作用。然而越来越多的研究发现，一些真菌多糖可以在体外直接抑制肿瘤细胞增殖，甚至杀死肿瘤细胞。这些多糖通过引起细胞应激，调控肿瘤细胞中信号分子的表达，改变细胞膜特性，诱导细胞凋亡、周期阻滞和自噬。
[0006]多糖对肿瘤细胞有广泛的影响，若干多糖通过改变肿瘤细胞膜的生化特性来杀死肿瘤细胞，此作用主要与唾液酸与磷脂转换有关。唾液酸主要位于细胞表面糖蛋白和糖脂的聚糖链末端。唾液酸增多可影响细胞表面电荷特性、抗原决定簇的暴露、膜的物质转运过程、膜表面受体功能等。茯苓多糖作用于S180和K562细胞后，可升高肿瘤细胞膜上的唾液酸含量，干扰细胞膜的肌醇磷脂代谢和磷脂酰肌醇转换，抑制细胞生长。虎奶菇菌核中分离出的水溶性羧甲基葡聚糖CMPTR可以降低乳腺癌MCF-7细胞中抗凋亡蛋白Bcl_2的表达，增高促凋亡蛋白Bax的表达,促进细胞凋亡。黄涛涛等研究发现，拟康氏木霉胞外多糖EPS体外处理白血病K562细胞后，诱导K562细胞染色质聚缩，磷脂酰丝氨酸的外翻，线粒体膜电位下降，细胞内活性氧及游离钙离子浓度的提高，表明EPS可能通过线粒体途径诱导K562细胞发生凋亡。真菌多糖的抗肿瘤作用是可靠的、普遍的，开发治疗或辅助治疗肿瘤的天然药物具有坚实的基础。
[0007]天然多糖几乎不可合成，而目前临床使用的或正在研究的多数多糖药物都受资源限制，开发成本高昂。真菌多糖优势在于活性高、生产周期短，不受季节、气温等条件限制，且产量高、纯化简单，所以真菌多糖具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景。保存在中国普通微生物菌种保藏管理中心菌种保藏号为CGMCC N0.8436的黑根霉(Rhizopusnigricans)是从秸杆中分离获得，属于真菌门接合菌亚门的根霉属，具有极强的生长势。黑根霉是目前发酵工业中常用的微生物菌种，被广泛应用于食品医药行业，如生物转化和有机酸的生产等。通过液体深层发酵技术，可以生产大量的黑根霉菌丝。黑根霉菌丝中含有丰富的多糖，可以从中分离具有潜在抗肿瘤作用的活性多糖，进行临床前研究。

【发明内容】

[0008]本发明针对现有技术的不足，提供一种具有抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖及其应用。
[0009]术语说明
[0010]seveage试剂:一种蛋白质变性剂,可以使蛋白质变性从溶液中析出。
[0011]本发明的技术方案如下:
[0012]一株具有产抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖的黑根霉(Rhizopus nigricans) RN-9,该菌株于2013年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中科院微生物研究所，保藏号 CGMCC N0.8436。
[0013]上述黑根霉(Rhizopus nigricans) RN-9在制备具有抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖中的应用。
[0014]上述应用，步骤如下:
[0015](I)将菌种保藏号为 CGMCC N0.8436 的黑根霉(Rhizopus nigricans) RN-9 接种于PDA (马铃薯蔗糖)培养基中活化24小时，制得活化菌丝；
[0016](2)将步骤(1)制得的活化菌丝转接于马铃薯蔗糖液体培养基中，培养温度为27~29°C，120rpm,培养10天，4层纱布过滤，制得液体发酵菌丝；
[0017](3)将步骤(2)制得的液体发酵菌丝在75°C下，经95%的乙醇回流脱脂8小时；
[0018](4)将步骤(3)制得的脱脂菌丝通过热水浸提获取热水提取液，60°C减压浓缩至原体积的20% -30%，然后向冷却至室温的浓缩液中加入三倍体积的体积百分比为95%的乙醇溶液，4°C过夜，离心，收集沉淀；
[0019](5)将步骤(4)收集的沉淀用去离子水溶解,然后加入1/3体积的seveage试剂，剧烈振荡脱去蛋白质，制得粗糖溶液；
[0020](6)将步骤(5)制得的粗糖溶液通过弱碱性阴离子交换树脂D-301R脱色后，采用DEAE-Fast Flow阴离子交换凝胶和S印hacryl S-500HR凝胶分离纯化，制得黑根霉菌丝多糖(RPS)溶液；
[0021](7)将步骤(6)制得的黑根霉菌丝多糖溶液经真空冷冻干燥后，制得黑根霉菌丝多糖。
[0022]所述步骤(1)中活化的时间为20~26h，活化温度为25°C~30°C。
[0023]所述步骤(3)中的脱脂温度为75°C，时间为8小时。
[0024]所述步骤(4)中的离心条件为:1000Orpm离心5min。[0025]所述步骤(5)的seveage试剂由氯仿与正丁醇按体积比4:1的比例混合。
[0026]上述黑根霉(Rhizopus nigricans) RN-9在制备具有抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的药物中的应用。
[0027]有益效果
[0028]1、本发明所述黑根霉(Rhizopus nigricans)RN-9具有产抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖的功能，该多糖可以在体外激活线粒体凋亡通路诱导BGC-823细胞发生凋亡，从而抑制BGC-823细胞生长；体内给药可以增加荷瘤小鼠体重，减小肿瘤体积和重量，抑制肿瘤生长，因而该多糖可应用于制备抗肿瘤药物或辅助药物。
[0029]2、本发明所述黑根霉(Rhizopus nigricans)RN-9具有较高的产黑根霉菌丝多糖的能力，按常规方式发酵培养，产率可达到50mg/L。
【专利附图】

【附图说明】
[0030]图1A黑根霉菌丝多糖高效凝胶渗透色谱分析；
[0031]图1B单糖标准品的高效液相色谱图；
[0032]图1C黑根霉菌丝多糖单糖组成分析；
[0033]图2黑根霉菌丝多糖体外给药对胃癌BGC-823细胞体外增殖活性影响的柱状图；
[0034]图3黑根霉菌丝多糖体外给药诱导胃癌BGC-823细胞发生凋亡的影响结果；
[0035]图4黑根霉菌丝多糖体外给药对胃癌BGC-823细胞线粒体膜电位的影响；
[0036]图5黑根霉菌丝多糖体外给药对胃癌BGC-823细胞Caspase-3和Caspase-9活力影响的柱状图；
[0037]图6A黑根霉菌丝多糖体外给药提高自噬性死亡的BGC-823细胞比例；
[0038]图6B黑根霉菌丝多糖体外给药提高BGC-823细胞内酸性囊泡数量；
[0039]其中:*表示t检验后，与对照组相比呈显著性差异(P ( 0.05)
[0040]**表示t检验后，与对照组相比呈极显著性差异(P≤0.01)
【具体实施方式】
[0041]下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
[0042]试剂说明
[0043]DEAE-Fast Flow阴离子交换凝胶、Sephadex G-100凝胶购自GE公司；
[0044]弱碱性阴尚子交换树脂D-301R购自天津南大树脂有限公司；
[0045]MTT (3- (4, 5-Dimethylthiazol-2-yl) _2，5-diphenyltetrazoIium bromide)、结晶紫、吖啶橙购自Sigma-Aldrich公司；Hoechst33258染色液、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒、活性氧检测试剂盒、韩离子检测试剂盒、Caspase-3,9活性检测试剂盒、细胞裂解液购自碧云天生物技术有限公司；
[0046]胃癌BGC-823细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；
[0047]其他试剂均为本领域常用市售试剂，分析纯。
[0048]实施例1
[0049]一株具有产抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖的黑根霉(Rhizopus nigricans) RN-9,该菌株于2013年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中科院微生物研究所，保藏号 CGMCC N0.8436。
[0050]菌株特征:匍匐菌丝，臌根发达，分枝多，褐色，两节间距离I~3毫米；孢子囊球形或椭圆形，褐色，直径65— 350微米，膜上有小结晶，易消融；囊轴球形、椭圆形、卵形或不规则，膜薄平滑，淡褐色，直径约70微米，高约90微米；中轴基存在，直径25~214微米；孢子形状不对称，近球形、卵形或多角形，表面有线纹，呈蜜枣状，褐色，5.5~13.5X7.5~8微米；接合孢子球形、卵形，外膜刚硬，黑色，有瘤状突起，直径160~220微米；无厚垣孢子
[0051]实施例2
[0052]实施例1所述黑根霉(Rhizopus nigricans) RN-9在制备具有抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖中的应用，步骤如下:
[0053](1)将菌种保藏号为 CGMCC N0.8436 的黑根霉(Rhizopus nigricans) RN-9 接种于PDA培养基中，在28°C条件下活化24h，制得活化菌丝；
[0054]所述PDA培养基，每升组分如下:马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂2g，自来水定容至1000mL,自然 pH;
[0055](2)将步骤 (1)制得的活化菌丝转接于PDB发酵培养基中，培养温度28±1°C，120rpm摇床培养10天,4层纱布过滤,制得液体发酵菌丝；
[0056]所述马铃薯蔗糖液体培养基，每升组分如下:马铃薯200g，蔗糖20g，自来水定容至 1000mL,自然 pH ;
[0057](3)将步骤⑵制得的菌丝，经95%乙醇(体积浓度)、75°C回流脱脂8小时，
[0058](4)将步骤(3)制得的脱脂菌丝通过100°C热水浸提，获取热水提取液，然后60°C减压浓缩至原体积的25%。向冷却至室温的浓缩液中加入三倍体积的95%乙醇(体积浓度)，4°C过夜，1000Orpm离心5min,收集沉淀；
[0059](5)将步骤(4)收集的沉淀用去离子水溶解,得溶解液,然后加入溶解液体积1/3的seveage试剂剧烈振荡脱去蛋白质，seveage试剂由氯仿与正丁醇按体积比4:1的比例混合制得，制得粗糖溶液；
[0060](6)将步骤(5)制得的粗糖溶液通过弱碱性阴离子交换树脂D-301R脱色后，采用DEAE-Fast Flow阴离子交换凝胶和S印hacryl S-500HR凝胶分离纯化，制得黑根霉菌丝多糖溶液；
[0061](7)将步骤(6)制得的黑根霉菌丝多糖溶液经真空冷冻干燥后，制得具有抑制BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖(RPS)。
[0062]经上述方法制得的RPS为白色固态，呈絮状；
[0063]经红外光谱检测，发现其有多糖的特征峰吸收，证明RPS为多糖；
[0064]碘-碘化钾反应、双缩脲反应、紫外吸收检测结果表明RPS中不含淀粉、蛋白质、核酸杂质；
[0065]高效凝胶渗透色谱分析检测其分子量为1.617X IO7Da,单糖组成为葡萄糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖、鼠李糖，摩尔比为92.2:5.1:1.3:1.6:2.3:1.0(如图1A，B, C所示)ο
[0066]实施例3
[0067]RPS体外给药对胃癌BGC-823细胞增殖活性的影响[0068]MTT 全称为 3-(4，5-Dimethylthiazol_2-yl)_2，5-diphenyltetrazoliumbromide，汉语化学名为3- (4，5- 二甲基噻唑-2) -2，5- 二苯基四氮唑溴盐。MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为:活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
[0069]实验方法
[0070]取对数生长期的胃癌BGC-823细胞，制成密度为2X104个/ml细胞悬液，接种于96孔板内，180 μ I/孔。培养24小时后，每孔加不同浓度的黑根霉菌丝多糖溶液20μ I(终浓度为0、50、100、200、400、600、800、1000μ g/ml)，每孔总液量为200 μ 1，每个药物浓度设6个复孔，并设空白对照(没有细胞，加入完全RPM1-1640培养液)和正常对照孔(不加药物，加等量完全RPM1-1640培养液)，37°C、5% CO2 (下述细胞培养条件同此)培养24、48、72小时。培养结束前4小时，每孔加入20 μ I MTT溶液(5mg/ml)，孵育4小时。培养结束后，弃去培养液，每孔加入150 μ I 二甲基亚砜，振荡5min，直至染料全部溶解，使用酶标仪在570nm处测定OD值并记录。
[0071 ] 细胞活力=(处理组OD值/对照孔OD值)X 100 %
[0072]实施例1制得的黑根霉菌丝多糖在体外对胃癌BGC-823细胞的增殖活性有抑制作用，实验结果见图2。黑根霉菌丝多糖显著抑制了胃癌BGC-823细胞的体外增殖，并具有时间和剂量依赖性。不同浓度黑根霉菌丝多糖处理24h、48h和72h，对胃癌BGC-823细胞的生长均产生了抑制作用，抑制率最高达到68%。 [0073]实施例4
[0074]RPS体外给药诱导胃癌BGC-823细胞发生凋亡
[0075]细胞膜上磷脂酰丝氨酸外翻是细胞早期凋亡的重要标志之一，Annexin V是一种对磷脂酰丝氨酸具有高亲和性的钙离子依赖性磷脂结合蛋白，可以作为检测翻转至细胞膜外表面的磷脂酰丝氨酸的特异性探针。
[0076]实验方法
[0077]取对数生长期胃癌BGC-823细胞，调整浓度为5X IO5个/ml，种于六孔板内。次日加入不同浓度黑根霉菌丝多糖溶液，处理12h后收获细胞。取5-10万细胞，加入195 μ IAnnexin V-FITC结合液，然后加入5 μ I Annexin V-FITC，室温避光孵育10分钟，1000g离心5分钟，弃上清，加入190 μ I Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，加入10 μ I碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置，随即采用流式细胞仪检测，FL-1检测Annexin V-FITC的绿色荧光，FL-2检测碘化丙啶的红色荧光。
[0078]实施例1制得的黑根霉菌丝多糖体外给药诱导胃癌BGC-823细胞发生凋亡，结果见图3。胃癌BGC-823细胞经黑根霉菌丝多糖处理12h后，相对于对照组，处理组胃癌BGC-823细胞的早期凋亡细胞(右下象限)比例从2.24%上升至24.93%、17.20%和20.14%，晚期凋亡和坏死细胞(右上象限)数目也相应提高，随浓度提高，凋亡细胞数目逐步增加。
[0079]实施例5[0080]RPS体外给药诱导胃癌BGC-823细胞线粒体膜电位下降
[0081]线粒体途径是细胞凋亡的经典信号途径。线粒体作为细胞内能量代谢中心，在细胞凋亡调控中发挥重要作用。线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的标志事件，为检测RPS诱导BGC-823细胞凋亡是否通过线粒体途径，我们采用一种阳离子染料JC-1检测细胞线粒体膜电位的变化。在线粒体膜电位正常时，JC-1以二聚体形式存在于线粒体基质中，发射出红色荧光；膜电位下降时，JC-1以单体形式分布于细胞质中，发射出绿色荧光。根据JC-1从红色荧光到绿色荧光的改变可以准确的判断线粒体膜电位的变化。
[0082]实验方法
[0083]取对数生长期胃癌BGC-823细胞，调整浓度为5X105个/ml，种于六孔板内。次日加入不同浓度黑根霉菌丝多糖溶液，处理12h后收获细胞，加入JC-1染料37度孵育30分钟，PBS(磷酸盐缓冲液，ph7.2-7.4)洗去残留染料后上机检测。
[0084]流式细胞术检测结果显示，实施例1制得的黑根霉菌丝多糖处理BGC-823细胞12h后，发出红色荧光的细胞数目减少，FL2/FL1比值显著降低，表明RPS诱导BGC-823细胞线粒体膜电位下降和线粒体功能失调(图4)。
[0085]实施例6黑根霉菌丝多糖体外给药对胃癌BGC-823细胞Caspase-3和Caspase-9活性的影响
[0086]Caspase是一种含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，在细胞质中以酶原状态存在，被激活后可以对细胞组组分选择性、限制性的酶切。凋亡相关的caspases可以分为两类:一类是起始者，如caspase-8、9、10等；一类是执行者,如caspase-3、6、7等。线粒体途径中，活化的Caspase-9可以激活 Caspase-3,导致细胞骨架蛋白和核纤层蛋白等的降解,引起一系列凋亡过程中细胞形态学变化。Caspase-3在染色质聚缩和细胞核碎裂过程中发挥关键作用。另外为确认caspase-3是否通过线粒体途径激活，我们同时检测了线粒体途径的顶端蛋白酶Caspase-9酶活力的变化。
[0087]实验方法
[0088]将处于对数长期的胃癌BGC-823细胞接种于六孔板，24小时后，加入黑根霉菌丝多糖母液，使其终浓度为0.2,0.6、lmg/ml，并设对照组。处理12h后收获细胞，加入细胞裂解液，冰上裂解15min，20000g离心10-15分钟，取上清立即测定caspase3的酶活性或-70°C保存样品。
[0089]结果如图5所示，实施例1制得的黑根霉菌丝多糖体外给药后，BGC-823细胞中caspase-3的酶活力显著提高,0.6mg/ml处理组的Caspase-9酶活力提高至对照组的1.72倍，说明黑根霉菌丝多糖诱导BGC-823细胞发生线粒体调控的细胞凋亡。
[0090]实施例7黑根霉菌丝多糖体外给药诱导胃癌BGC-823细胞发生酸性囊泡的积累和自噬性细胞死亡
[0091]自噬是细胞内一种自食(self-eating)的现象，自噬发生时，膜包裹部分胞质和细胞内需要降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。但是过量的自噬会导致细胞的死亡，自噬性细胞死亡和细胞凋亡拥有众多相同的刺激因素和调节蛋白。
[0092]实验方法
[0093]将处于对数长期的胃癌BGC-823细胞接种于六孔板，24小时后，加入黑根霉菌丝多糖母液，使其终浓度为0.6mg/ml，处理3h、6h、12h、24h、36h、48h后胰酶消化收集细胞，100 μ g/ml的AO (吖啶橙)染色15分钟，PBS重悬后上机检测。
[0094]结果如图6所示，实施例1制得的黑根霉菌丝多糖体外给药后，BGC-823细胞内酸性囊泡细胞器显著增加，表明细胞自噬活性的增强和自噬性死亡的发生。
[0095]实施例8 一种具有抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖体内给药对荷瘤小鼠体重、肿瘤体积和瘤重的影响
[0096]取对数生长期的胃癌BGC-823细胞，台盼蓝染色检查活细胞含量在95%以上，用PBS缓冲液调节细胞密度为1父108个/1111，右侧肩胛部皮下接种841^/(:-皿/1111品系的裸鼠50只，0.2ml/只。一周后选取成瘤小鼠，随机分为4组，对照组、黑根霉菌丝多糖25mg/kg.day组、50mg/kg.day组、lOOmg/kg.day组，每组10只，组间平均体重差异不超过I克。不同浓度的黑根霉菌丝多糖生理盐水溶液于每天固定时间灌胃给药，对照组给予等量生理盐水，连续给药15天。观察各组小鼠的生长情况，每5天称量小鼠体重。末次给药24后放血处死小鼠，剥取皮下实体瘤瘤块，去除脂肪和结缔组织后称重。
[0097]实施例1制得的黑根霉菌丝多糖体内给药可以抑制异体移植肿瘤的生长，促进荷瘤小鼠体重的增加，结果见表1、表2。表1所示黑根霉菌丝多糖灌胃给药对荷瘤小鼠体重的影响，对照组荷瘤小鼠体重增加缓慢，黑根霉菌丝多糖灌胃处理的荷瘤小鼠体重增加明显加快，其中100mg/kg.day组20天后小鼠平均体重比对照组高16.06%。表2所示黑根霉菌丝多糖灌胃给药对荷瘤小鼠肿瘤瘤重的影响，随给药剂量的增加，荷瘤小鼠瘤重下降，100mg/kg.day组的抑瘤率最高达到46.62%。上述结果说明黑根霉菌丝多糖体内给药可以增加荷瘤小鼠体重，抑制荷瘤小鼠肿瘤生长。
[0098]表1黑根霉菌丝 多糖体内给药对BGC-823荷瘤小鼠体重(克)的影响(η = 10，
X 土 SD )
[0099]
|0d(给药前)|5d[TodKEd
O(对照组) 19.5+1.6~ 20.5+1.9~ 23.8 + 2.1~24.2 + 1.8
25mg/kg.day~19.3+1.3~21.7+1.8~ 24.6 + 1.9~25.5 + 2.6
50mg/kg.day~19.7+1.8~22.5 + 2.0~ 25.9 + 2.3~26.5 + 2.1
100mg/kg.day 19.4+1.7~ 21.2 + 1.7~ 25.3 + 2.5~ 26.9 + 2.9
[0100]表2黑根霉菌丝多糖体内给药对BGC-823荷瘤小鼠肿瘤瘤重的影响(η = 10，
X 土SD )
[0101]
Mj瘤重(克) j抑瘤率(％ )
对照组1.72 + 0.22
【权利要求】
1.一株具有产抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖的黑根霉(Rhizopusnigricans) RN-9，该菌株于2013年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中科院微生物研究所，保藏号CGMCCN0.8436。
2.权利要求1所述黑根霉(Rhizopusnigricans) RN-9在制备具有抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤如下: (1)将菌种保藏号为CGMCCN0.8436的黑根霉(Rhizopus nigricans) RN-9接种于PDA培养基中活化24小时，制得活化菌丝； (2)将步骤(1)制得的活化菌丝转接于马铃薯蔗糖液体培养基中，培养温度为27~290C, 120rpm,培养10天,4层纱布过滤,制得液体发酵菌丝； (3)将步骤(2)制得的液体发酵菌丝在75°C下，经95%的乙醇回流脱脂8小时； (4)将步骤(3)制得的脱脂菌丝通过热水浸提获取热水提取液，60°C减压浓缩至原体积的20% -30%，然后向冷却至室温的浓缩液中加入三倍体积的体积百分比为95%的乙醇溶液，4°C过夜，离心，收集沉淀； (5)将步骤(4)收集的沉淀用去离子水溶解,然后加入1/3体积的seveage试剂,剧烈振荡脱去蛋白质， 制得粗糖溶液； (6)将步骤(5)制得的粗糖溶液通过弱碱性阴离子交换树脂D-301R脱色后，采用DEAE-Fast Flow阴离子交换凝胶和S印hacryl S-500HR凝胶分离纯化，制得黑根霉菌丝多糖(RPS)溶液； (7)将步骤(6)制得的黑根霉菌丝多糖溶液经真空冷冻干燥后，制得黑根霉菌丝多糖。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中活化的时间为20~26h，活化温度为25°C~30°C。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中的脱脂温度为75°C，时间为8小时。
6.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤(4)中的离心条件为:1000Orpm离心 5min。
7.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤(5)的seveage试剂由氯仿与正丁醇按体积比4:1的比例混合。
8.权利要求1所述黑根霉(Rhizopusnigricans) RN-9在制备具有抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的药物中的应用。
【文档编号】C12P19/04GK104017736SQ201410275718
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月19日 优先权日:2014年6月19日
【发明者】陈靠山, 陈国创, 张鹏英, 禹文茜 申请人:山东大学