一种利用硫酸寡糖组鉴别北极刺参的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种鉴别北极刺参的方法。
【背景技术】
[0002] 海参富含硫酸多糖、蛋白质，皂苷、矿物质，且不含胆固醇，故享有"营养宝库"之美 誉。目前市场上海参种类繁多，良莠不齐，不同海参因其营养价值、口感不同而价格相差巨 大。目前鉴别海参种类的方法只是传统的外观和骨片观察，误差比较大，缺乏技术水平的支 持。在海参牛奶、海参饮液中，缺少分析海参的种类的方法，导致不少不良商人以次充好、以 假充真欺骗消费者。而且目前市面上出现了使用海藻粉或魔芋粉制成的假海参，没有海参 特有的营养成分。因此需要一种高效准确的鉴定海参品种的分析方法。
[0003] 海参中含有两种独特的硫酸多糖，主要为具有岩藻糖支链的硫酸软骨素和直链岩 藻聚糖硫酸酯，占海参干重的4%左右，对人体有免疫调节剂、抗凝血、控制血糖和降血脂等 功效。这两种硫酸多糖结构复杂，因海参的种类和生长海域不同而有差别，可以作为鉴别海 参种类的目标化合物。
[0004] 采用化学方法分析海参硫酸多糖的结构，传统的方法主要采用NMR分析，但是要求 硫酸多糖的纯度高、样品量大。海参硫酸多糖的分析需要进行离子交换色谱纯化、降解、凝 胶柱纯化和脱盐等多步复杂的分离纯化步骤，一个样品总共需要近20天的时间才能完成。 而且这些硫酸多糖分子量大、组成复杂，所以NMR吸收峰重叠，无法鉴别不同海参来源的硫 酸多糖细微的结构区别。因此迫切需要一种更加快速简便、分辨率高的检测海参硫酸多糖 的分析方法。
【发明内容】
[0005] 本发明对北极刺参的硫酸寡糖进行了研究，建立了从硫酸寡糖水平对北极刺参进 行鉴别的技术，从而弥补了现有技术的不足。
[0006] 本发明首先提供一种用于检测北极刺参的硫酸寡糖组合，所述的寡糖组合，其中 第一组合为(GalNAcMFucMS〇4)n，其中n = l-4;第二组合为
[0007] (GalNAc)i(Hex)i(S〇4)n(n = 2_3)、（GalNAc)i(GlcA)i(Hex)i(S〇4)n(n= 1-4)、 (GalNAc)2(GlcA)i(Hex)i(S〇4)n(n = 4_6)、（GalNAc)3(GlcA)i(Hex)i(S〇4)n(n = 4_7)、 (GalNAc)3(GlcA)i(Hex)i(S〇4)n(n = 5-7)。
[0008] 本发明还提供一种检测北极刺参的方法，所述方法包括以下步骤：
[0009] 1)对待侧样本进行液相色谱-质谱前处理，获得待测硫酸寡糖溶液；
[0010] 2)通过液相色谱-质谱联用法检验待测样本的硫酸寡糖成分，分析样本中的北极 刺参成分。
[0011] 所述的液相色谱-质谱前处理步骤如下：
[0012] 1)固体干海参粉碎成粉末状态，加入〇 · lm〇l/L的磷酸缓冲溶液(pH 8 · 0，15mmol/L EDTA-Na2、5mmol/L半胱氨酸）、碱性蛋白酶和胰蛋白酶，50 °C酶解24h;将反应物沸水浴5min 灭酶活后离心，取上清液；
[0013] 2)取氯化十六烷基吡啶水溶液加入上述上清液中，室温静置，离心，收集沉淀；
[0014] 3)将步骤2)收集的沉淀用添加了NaCl的乙醇溶液(3mol/L NaCl，86 %乙醇）溶解 后，加入95 %乙醇，4°C下放置24h，离心后，收集沉淀，完成海参硫酸多糖的提取；
[0015] 4)将海参硫酸多糖溶于0.5mol/L Na2HP〇4溶液中，加入醋酸铜溶液和H2〇2,60°C水 浴降解3h;然后用NaOH调节溶液至pH 9.0，离心后，取上清液；
[0016] 5)采用lkDa的滤膜4000Xg超滤lOmin，收集上层的滤液，完成海参硫酸寡糖溶液 的制备，待上机检测。
[0017] 所述的液相色谱-质谱联用法检测，色谱条件如下:色谱柱:Luna HILIC柱(2.0 X 150mm，5μπι)，流动相A: 5mM醋酸铵水溶液，流动相B:乙腈，进样量为4yL，流动相A的洗脱梯度 是10 %-35 %，0-40min洗脱，流速150yL/min;质谱的条件:负离子模式，电喷雾源，质量分析 器为Orbitrap-傅里叶转换，负离子电力模式，毛细管电压-40V，套管透镜补偿电压-50V，毛 细管温度设为275°层流量为30,辅助气体的流量6,扫描分子量300-1000u，Xcalibur质谱软 件中处理。
[0018] 所述的分析样本中的北极海参成分，是将待测样品的质谱结果对比上述组合的寡 糖的质谱谱图，同时出现上述寡糖组合的各条特异性的硫酸寡糖的质谱检测谱图时，可以 判断该组织样品为北极刺参样本。
[0019] 本发明的方法利用海参中对照硫酸寡糖的检测，来鉴别北极刺参，特异性好，分析 准确可靠。检测方法具有简便快速，灵敏度高，分辨率高的特点。采用液相色谱-质谱联用技 术，可以一步完成海参硫酸寡糖混合物的分离和分析，质谱能够准确分辨来源于岩藻糖基 硫酸软骨素和岩藻聚糖的混合硫酸寡糖，节省了硫酸寡糖的离子交换柱纯化、凝胶色谱柱 分离和脱盐等步骤，大大缩短了检测时间。本方法灵敏度高，需要的样品量仅为5yg。质谱还 能够检测到寡糖混合物中所有微量的寡糖，得到北极刺参的硫酸寡糖的全指纹谱图，通过 对照硫酸寡糖的分析可以准确的鉴别北极海参。
【附图说明】
[0020] 图 1，（GalNAc)i(Fuc)i(S〇4)n(n = 1-4)在Thermo Q-E质谱上的质谱图、
[0021] 图2，（GalNAc)i(Hex)i(S〇4)n(n = 2-3)在Thermo Q-E质谱上的质谱图、
[0022] 图3，（GalNAc)i(GlcA)i(Hex)i(S〇4)n(n= 1-4)在Thermo Q-E质谱上的质谱图、
[0023] 图4,6&1嫩(3)2(61〇厶)1(]^叉)1(3〇4)11(11 = 2-6)在1'1161'1]1〇(>^质谱上的质谱图、
[0024] 图5,（GalNAc)3(GlcA)i(Hex)i(S〇4)n(n = 4-7)在Thermo Q-E质谱上的质谱图、
[0025] 图6,北极刺参寡糖的液相色谱-质谱联用分析的总离子流图、
[0026] 图7,目标寡糖在北极刺参中的质谱图、
[0027]图8，（GalNAc)i(Fuc)i(S〇4)n(n = l-4)在液相色谱-质谱联用分析的提取质谱图、 [0028]图KGalNAcMHexMSOAMnrS-S)在液相色谱-质谱联用分析图、
[0029] 图HUGalNAcMGlcAMHexMSOjnUzl-O在液相色谱-质谱联用分析图、
[0030] 图lUGalNAcMGlcAMHexMSCkMnzS-e)液相色谱-质谱联用分析图、
[0031] 图^(GalNAcMGlcAMHexMSOOr^r^f?)在液相色谱-质谱联用分析图。
【具体实施方式】
[0032] 本发明利用液相色谱-质谱联用技术检测北极刺参的硫酸寡糖的全指纹图谱，对 比仿刺参、海地瓜、美国肉参、墨西哥参来源的硫酸寡糖，鉴别出两组硫酸寡糖为北极刺参 特有的。下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0033] 实施例1，北极刺参来源特异的硫酸寡糖的结构和对比信息
[0034] 1.北极刺参独有的岩藻糖支链硫酸软骨素寡糖
[0035] 北极刺参独有的寡糖(GalNA^KFu^KSOdnUiH)，来自北极刺参的硫酸软骨 素糖链，为乙酰氨基半乳糖(GalNAc)与岩藻糖(Fuc)组成的二糖，分别含有1-4个硫酸根。这 证明北极刺参的硫酸软骨素糖链中，部分岩藻糖支链连接在乙酰氨基半乳糖上。而美国肉 参、海棒槌中的岩藻糖硫酸软骨素，其岩藻糖支链只连接在糖醛酸上。经过对比证明， (GalNAcMFucMSOjr^nzl-O是北极刺参中特有的二糖。
[0036] 采用Thermo Scientific Q Exactive?质谱（Thermo Q-E)检测目标寡糖的质谱 图。
[0037] 图 1是(GalNAc)i(Fuc)i(S〇4)n(n = l_4)在Thermo Q-E质谱上的质谱图。
[0038] 其母离子、电荷和糖链组成如表1所示。
[0039] 表UGalNAcMFucMSOAMnzI-O的母离子、电荷数和糖链组成
[0040]
[0041]
[0042] 备注:GalNAc-乙酰氨基半乳糖，Fuc-岩藻糖，GlcA-葡萄糖醛酸，S〇4_硫酸根，数字 代表单糖和硫酸根的个数。
[0043] 2.北极刺参独有的己糖硫酸寡糖
[0044] 北极刺参独有的己糖硫酸寡糖(GalNAchmexhUOjr^nzS-S)，来自北极刺参中 的硫酸软骨素，是由乙酰氨基半乳糖(GalNAc)和己糖(Hex:半乳糖、葡萄糖或甘露糖)组成 的二糖，分别有2-3个硫酸根，说明己糖(半乳糖、葡萄糖或甘露糖)主要连接在乙酰氨基半 乳糖上，而且己糖上也有硫酸根取代。虽然在细胞的N-糖链中存在这种二糖，比较刺参、海 地瓜、美国肉参、墨西哥参的硫酸寡糖，确定(GalNA^KHexhUOOnUiS-S)为北极刺参中 独有的寡糖。
[0045]己糖三糖(GalNAc)i(GlcA)i(Hex)i(S〇4)n(n=l_4)、四糖(GalNAc)2(GlcA)i(Hex)i (S〇4)n(n = 2-6)、五糖(GalNAc)3(GlcA)i(Hex)i(S〇4)n(n = 4-7)，来自北极刺参中的硫酸软 骨素，是由乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、葡萄糖醛酸(GlcA)和己糖(Hex:半乳糖、葡萄糖或甘 露糖)组成的寡糖，说明在硫酸软骨素的糖链上，有己糖(半乳糖、葡萄糖或甘露糖)构成的 支链。而刺参、海地瓜、美国肉参、墨西哥参的硫酸软骨素中只有岩藻糖支链，未发现己糖 (半乳糖、葡萄糖或甘露糖)支链。对比刺参、海地瓜、美国肉参、墨西哥参，这些寡糖是北极 刺参中特有的硫酸寡糖。
[0046] 采用Thermo Scientific Q Exactive?(Thermo Q-E)质谱仪法检测目标寡糖的质 谱图
[0047] 图2是(GalNAc)i(Hex)i(S〇4)n(n = 2_3)在Thermo Q-E质谱上的质谱图
[0048] 图3是(GalNAc)i(GlcA)i(Hex)i(S〇4)n(n= 1-4)在Thermo Q-E质谱上的质谱图，
[0049] 图4是(