一种方格星虫多糖硫酸化修饰方法
【专利摘要】本发明公开了一种方格星虫多糖的硫酸化修饰方法。方格星虫多糖具有抗菌、抗病毒、抗辐射、增强机体免疫力等功能。多糖的活性直接或间接地受到其分子结构的影响，对多糖分子结构进行适当修饰可以改变多糖的活性，提高其功效。本发明用氯磺酸-吡啶法对方格星虫多糖进行硫酸化修饰，通过方格星虫多糖的纯化，方格星虫多糖的硫酸化修饰等具体技术措施，得到方格星虫硫酸酯化多糖，采用纸片扩散法，以6种细菌为指示菌，对方格星虫多糖和最优修饰条件所得硫酸酯化多糖进行了抗菌活性测定。抗菌试验结果显示，本发明方法所得的方格星虫硫酸化分子修饰产物，能进一步提高方格星虫多糖的抗菌活性。
【专利说明】一种方格星虫多糖硫酸化修饰方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是一种方格星虫多糖硫酸化修饰方法，属于多糖的结构改造【技术领域】。
【背景技术】 [0002]多糖是生物体内除蛋白质和核酸外又一类重要的生物大分子物质，广泛存在于动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中，具有广泛的生物活性。多糖类物质具有免疫调节、抗肿瘤、抗辐射、抗菌、抗疲劳和抗衰老等作用。多糖的生物活性与其结构有着密切的关系，采取一定的方法对多糖分子结构进行适当修饰可以改变多糖活性，提高其功效。硫酸化修饰是多糖修饰中常见的方法之一，由于硫酸基的引入具有了聚阴离子特性，而聚阴离子特性是其生物学活性改变的主要因素，一些天然多糖经过硫酸化修饰后得到了用途更为广泛的多糖衍生物。
[0003]方格星虫，素有“海洋冬虫夏草”之称，是一种食疗兼优的药膳，具有显著的延缓衰老、抗氧化、抗疲劳、耐缺氧、耐高温、催乳以及滋阴降火、清肺化痰等功效，对心血管系统也有明显的保护作用。多糖作为方格星虫的主要有效成分，对其生物活性的研究日渐增多，根据文献报道和本 申请人:的前期工作证明，方格星虫多糖具有抗菌活性，但这种抗菌活性略显不足，因此，寻找一种提高方格星虫多糖抗菌活性的方法，更有利于提高方格星虫的利用价值。对方格星虫多糖进行结构修饰，是提高方格星虫多糖抗菌活性的途径之一，在这方面经过检索没发现有相关技术的披露。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种方格星虫多糖硫酸化修饰方法，针对方格星虫多糖抗菌活性低的问题，对方格星虫多糖结构进行硫酸化修饰，从而提高方格星虫多糖的抗菌活性。
[0005]为实现上述目的，本发明采取了下述技术方案，一种方格星虫多糖硫酸化修饰方法，具体技术步骤是:
(1)方格星虫多糖的纯化
1)纤维素柱层析:取方格星虫粗多糖进行纤维素柱层析，按常规柱层析操作方法，取方格星虫粗多糖0.5g溶于IOmL超纯水上样，用0.3-0.5moL/L NaCL洗脱，流速为lmL/min，得到洗脱液，用玻璃纸透析除去盐分，减压浓缩至温度30°C相对密度是0.9829 g/mL，进行冷冻干燥，得到含水量是1-5%的方格星虫多糖冻干品备用；
2)凝胶柱层析:取方格星虫多糖冻干品用超纯水溶解，0.45 μ m滤膜过滤，按常规方法进行凝胶柱层析，用超纯水以0.2 mL/min流速洗脱，得到洗脱液，减压浓缩至温度为28°C时测得相对密度是0.9856-0.9918 g/mL，进行冷冻干燥，得到含水量是1_5%的纯化的方格星虫多糖备用；
(2)方格星虫多糖的硫酸化修饰1)硫酸化试剂制备:将附有冷凝装置和磁力搅拌的三颈烧瓶置于冰盐浴中，加入10-15mL的吡唳,较为剧烈的搅拌5-10 min,按氯磺酸与吡唳是1:6-10的体积比，于40min内边搅拌边逐滴加氯磺酸至吡啶中，至出现大量淡黄色固体，反应结束，得酯化试剂备用；
2)硫酸化修饰操作:精确称取0.500g纯化的方格星虫多糖，混溶于35mLDMF中，以磁力搅拌器搅拌30min混成均匀的悬液，倒入酯化试剂中并搅拌在水浴中使其反应，水浴温度是45-70°C，反应时间是2-4小时，反应结束后冷却至室温，将反应液倒入预冷至0-4°C的IOOmL冰水中，用15%的NaOH中和至pH7.0-7.2，加入三倍体积的无水乙醇，静置24h，离心，热水溶解沉淀，流水透析48h，冷冻干燥至含水量为1_2%，得到方格星虫硫酸酯化多糖(sulfated SPS,sSPS)。
[0006]采取上述措施的本发明，其中硫酸酯化多糖中糖含量测定采用苯酚-硫酸法；硫酸基含量的测定采用BaCl2_明胶比浊法，按照标准曲线制作方法测定吸光度，由回归方程计算硫酸基浓度，按下式计算取代度DS:DS= (1.62XS%)/ (32_1.02XS%)。将本发明所得方格星虫硫酸酯化多糖进行抗菌活性比较，采用纸片扩散法，以6种细菌(大肠杆菌Escheri chi a co71、枯草芽抱杆菌 Baci Ilus sub i i7i5.、金黄色葡萄球菌 51 taphylococcusaares、藤黄八叠球菌5krci/?a hiea、副溶血弧菌Vibrio和獲弧菌Vibrio 为指示菌,对方格星虫多糖和最优修饰条件所得硫酸酯化多糖sSPS5进行了抗菌活性测定。结果如下表所示:
方格星虫多糖和硫酸酯化多糖对细菌的抑制作用(mm)
【权利要求】
1.一种方格星虫多糖硫酸化修饰方法，具体技术步骤是: (O方格星虫多糖的纯化 1)纤维素柱层析取方格星虫粗多糖进行纤维素柱层析，按常规柱层析操作方法，取方格星虫粗多糖0.5g溶于IOmL超纯水上样，用0.3-0.5moL/L NaCL洗脱，流速为lmL/min，得到洗脱液，用玻璃纸透析除去盐分，减压浓缩至温度30°C相对密度是0.9829 g/mL，进行冷冻干燥，得到含水量是1-5%的方格星虫多糖冻干品备用； 2)凝胶柱层析取方格星虫多糖冻干品用超纯水溶解，0.45 μ m滤膜过滤，按常规方法进行凝胶柱层析，用超纯水以0.2 mL/min流速洗脱，得到洗脱液，减压浓缩至温度为28°C时测得相对密度是0.9856-0.9918 g/mL，进行冷冻干燥，得到含水量是1_5%的纯化的方格星虫多糖备用； (2)方格星虫多糖的硫酸化修饰 1)硫酸化试剂制备将附有冷凝装置和磁力搅拌的三颈烧瓶置于冰盐浴中，加入10-15mL的吡唳,较为剧烈的搅拌5-10 min,按氯磺酸与吡唳是1:6-10的体积比，于40min内边搅拌边逐滴加氯磺酸至吡啶中，至出现大量淡黄色固体，反应结束，得酯化试剂备用； 2)硫酸化修饰操作精确称取0.500g纯化的方格星虫多糖，混溶于35mLDMF中，以磁力搅拌器搅拌30min混成均匀的悬液，倒入酯化试剂中并搅拌在水浴中使其反应，水浴温度是45-70°C，反应时间是2-4小时，反应结束后冷却至室温，将反应液倒入预冷至0-4°C的100mL冰水中，用15%的NaOH中和至pH7.0-7.2，加入三倍体积的无水乙醇，静置24h，离心，热水溶解沉淀，流水透析48h，冷冻干燥至含水量为1-2%，得到方格星虫硫酸酯化多糖(sulfated SPS, sSPS)
【文档编号】A61P31/04GK103613678SQ201310579582
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月19日 优先权日:2013年11月19日
【发明者】董兰芳, 张琴, 童潼, 许明珠, 童万平, 王志成 申请人:广西壮族自治区海洋研究所