硫酸化白芨多糖的新用途及一种治疗眼表损伤的制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及医药领域，尤其设及硫酸化白巧多糖的新用途及一种治疗眼表损伤的 制剂。
【背景技术】
[0002] 严重眼表损伤是眼科最常见、治疗最棘手的一类疾病，发病率高，患病人群广，而 在运些严重的眼表致角膜盲的疾病中，化学伤、热烧伤和机械外伤引起者占了 60%W上。目 前临床多采用异体角膜移植和人工角膜移植手段治疗眼表损伤。但是，异体角膜移植面临 移植排斥、供体不足等问题；而人工角膜构建材料具有的异物性不支持角膜上皮细胞的生 长，同时其透明性，可塑性W及拉伸力等等因素依然是限制其发展的重要因素。
[0003] 为此，近年来大量临床研究开始尝试采用种子细胞配合细胞生长基质来实现眼角 膜上皮重建。其中细胞生长基质多采用特殊手段处理过的羊膜基质，从目前临床研究结果 来看，具有一定的修复角膜上皮的效果。但是此疗法是采用组织块联合种子细胞的手段，仍 不能很好解决累及角膜深层基质助损伤和烧伤后角膜癒痕和血管化的问题，且可操作性相 对较弱。
[0004] 白巧度letillastriata)为兰科白巧属多年生草本植物，W干燥的块茎入药。白 巧多糖具有的良好吸湿性和亲水性，能促进氧气、营养物质和其它水溶性代谢产物的通透 作用，同时还能加强上皮和基质细胞的粘附性。但目前未见将其用于治疗眼角膜损伤的报 道。
[0005] 厮带间充质干细胞化UC-MSCs)为厮带组织来源间充质干细胞，具有自我更新和 多向分化的能力，可作为种子细胞促进组织损伤的修复和再生，因此，hUC-MSCs能够具有修 复角膜上皮修复的功能。但是，现有的研究结果却表明，hUC-MSCs在体外的存活能力较差， 将其直接用于角膜上皮的修复效果并不理想。将hUC-MSCs应用于角膜上皮的修复仍是目 前亟待解决的问题。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供硫酸化白巧多糖的新用途及一种治 疗眼表损伤的制剂。本发明通过实验证实硫酸化白巧多糖具有修复
[0007] 硫酸化白巧多糖在制备治疗眼表损伤的药物中的应用。
[0008] 在本发明的实施例中，硫酸化白巧多糖所能治疗的眼表损伤为眼角膜损伤。
[0009] 在本发明的实施例中，硫酸化白巧多糖的分子量为30000D~50000D。
[0010] 在本发明的实施例中，硫酸化白巧多糖的制备方法为：将白巧粉碎后经水提醇沉， 所得沉淀W水重悬，W氯仿和下醇的混合物抽提后，经30000D~50000D透析，干燥、纯化、 硫酸化，制得硫酸化白巧多糖。
[0011] 在一些实施例中，水提醇沉具体为：将白巧粉W水浸提后，提取液与乙醇水溶液混 合，静置过夜制得沉淀。
[0012] 在一些实施例中，浸提的溫度为80°C，浸提的时间为4h。
[0013] 在一些实施例中，乙醇水溶液中乙醇的体积分数为95 %。
[0014] 在一些实施例中，乙醇水溶液与提取液的体积比为1:3。
[0015] 经过氯仿和下醇的混合液抽提后，提取物中的蛋白被去除。离屯、后取水相。
[0016] 在一些实施例中，氯仿和下醇的混合物中，氯仿和下醇的体积比为5:1。
[0017] 在一些实施例中，沉淀溶于水后溶液的体积是氯仿和下醇混合物的3倍。
[0018] 在一些实施例中，透析采用的透析液为蒸馈水。
[0019] 在一些实施例中，干燥为冻干。
[0020] 在一些实施例中，干燥后的白巧多糖还经过纯化。
[0021] 在一些实施例中，纯化为将冻干后的白巧多糖溶解后，过交联葡聚糖G-100柱。 [002引在本发明的实施例中，硫酸化的方法为氯横酸-化晚法。
[0023] 在一些实施例中，硫酸化的试剂为氯横酸与化晚。
[0024] 在一些实施例中，氯横酸与化晚的体积比为1:6。
[0025] 在本发明的实施例中，白巧多糖的硫酸化具体为：将白巧多糖溶于无水N，N-二甲 基甲酯胺，室溫揽拌30min后，加入硫酸化试剂，置于60°C水浴揽拌反应化。
[0026] 在一些实施例中，硫酸化试剂为氯横酸与化晚的混合物，其中氯横酸与化晚的体 积比为1:6。
[0027] 在一些实施例中，经硫酸化后，调整抑值为7. 5,减压浓缩后W蒸馈水为透析液透 析3d，透析液浓缩后经冷冻干燥得到硫酸化多糖。
[0028] 本发明制得硫酸化白巧多糖的分子量为30000D~50000D。
[0029] 本发明应用体外细胞划痕法建立上皮细胞损伤模型，人角膜上皮细胞W硫酸化白 巧多糖处理24小时后倒置显微镜下照相记录计算迁移率。结果表明硫酸化白巧多糖与能 促进角膜上皮细胞的迁移，说明其能够起到修复角膜损伤的作用。
[0030] 本发明还提供了一种多糖-干细胞制剂，包括厮带间充质干细胞和硫酸化白巧多 糖。
[0031] 在本发明的实施例中，厮带间充质干细胞的数量为1X105个/mL~5X105个/mL。
[0032] 在一些实施例中，厮带间充质干细胞的密度为IX105个/mL~3X10 5个/mL。
[0033] 在一些实施例中，厮带间充质干细胞的密度为1.OX105个/mL。
[0034] 在本发明的实施例中，硫酸化白巧多糖的质量分数为50yg/mL~300yg/mL。
[0035] 在一些实施例中，硫酸化白巧多糖的质量分数为200yg/mL。
[0036] 在本发明的实施例中，厮带间充质干细胞为P3代~P5代的厮带间充质干细胞。
[0037] 在本发明的实施例中，厮带间充质干细胞的分离方法为组织块培养法。
[0038] 具体的，hUC-MSCs的原代分离方法包括W下步骤：
[0039] 步骤1:将厮带用含有lOOU/mL青霉素和lOOU/mL链霉素的PBS缓冲液漂洗2次， W体积分数为75%的乙醇水溶液浸泡Imin~2min后，去除厮带外膜和血管；
[0040] 步骤2:W人干细胞无血清培养液培养，培养条件为5%C02、37°C、湿度95%;第 5~7天半量换培养基，继续培养12~14天后全量换液去掉组织块，收集细胞传代培养。
[0041] 本发明将厮带间充质干细胞与硫酸化白巧多糖复配，所得制剂经试验证明能够显 著促进角膜上皮细胞的增殖，其效果显著优于单独使用硫酸化白巧多糖或厮带间充质干细 胞。细胞迁移试验表明，本发明提供的制剂能够显著促进角膜上皮细胞的迁移，其效果显著 优于单独使用硫酸化白巧多糖或厮带间充质干细胞。说明本发明提供的制剂能够具有修复 角膜损伤的作用。
[0042] 本发明提供的厮带间充质干细胞制剂作为作为治疗眼表损伤的药物中的应用。
[0043] 在本发明的实施例中，眼表损伤为眼角膜损伤。
[0044] 本发明提供的厮带间充质干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括W下步骤：将 厮带间充质干细胞W生理盐水重悬后，与〇°C~4°C预冷的硫酸化白巧多糖溶液混合。
[0045] 在本发明的实施例中，白巧多糖溶液为硫酸化白巧多糖的PBS溶液。
[0046] 在本发明的实施例中，生理盐水的体积为硫酸化白巧多糖溶液体积的1/20。
[0047] 本发明提供了硫酸化白巧多糖在制备治疗眼表损伤的制剂中的应用，并提供了包 括硫酸化白巧多糖和厮带间充质干细胞的制剂及其在治疗眼表损伤中的应用。本发明将厮 带间充质干细胞与硫酸化白巧多糖复配，所得制剂经试验证明能够显著促进角膜上皮细胞 的增殖，其效果显著优于单独使用硫酸化白巧多糖或厮带间充质干细胞。细胞迁移试验表 明，本发明提供的制剂、硫酸化白巧多糖皆能够显著促进角膜上皮细胞的迁移，但本发明提 供制剂的效果显著优于单独使用硫酸化白巧多糖或厮带间充质干细胞。说明，本发明提供 的制剂能够具有修复角膜损伤的作用。
【具体实施方式】
[0048] 本发明提供了一种厮带间充质干细胞制剂及其制备方法与应用，本领域技术人员 可W借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对 本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已 经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本 文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0049] 本发明采用的试剂和仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0050] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[00川 实施例1
[0052] 白巧饮片研成粉末在80°C蒸馈水中分散溶解4h后过滤，滤去杂质。
[0053] 滤液经由3倍体积的95%乙醇浸泡过夜，沉淀物用蒸馈水重悬。
[0054] 加入1/3体积的氯仿和下醇的混合液（体积比5:1。）混均离屯、抽提蛋白成分，提 取水相层的液体。
[00巧]经30000D-50000D透析柱透析（透析液为蒸馈水），制成冻干粉，得到白巧多糖粗 品。将白巧多糖粗品溶解后经交联葡聚糖G-100进一步纯化制得白巧多糖。
[0056] 将白巧多糖氯横酸-化晚法进行硫酸化修饰。具体步骤为：
[0057] 将0. 2g多糖粉末溶于35ml无水N，N-二甲基甲酯胺中，室溫揽拌30min后，加入 17. 5ml硫酸化试剂（氯横酸与化晚的体积比为1:6)，置于60°C水浴揽拌反应化。反应结 束后冷却至室溫，反应液加入100ml冰水，用Imol/L化0H中和至抑7. 5,减压浓缩至一定浓 度，用蒸馈水透析3d，透析液浓缩后经冷冻干燥得到硫酸化多糖。
[00则 实施例2
[0059]将厮带（乙肝、丙肝、HIV、支原体、梅毒等血清学检查均为阴性）置于含有lOOU/mL 青霉素和lOOU/mL链霉素的PBS中漂洗2次，加入预冷的75%酒精，浸泡l-2min，期间不停 翻动厮带；加入PBS漂洗2次洗去酒精。用组织剪将厮带剪成2mm左右的小段，每段用眼科 剪纵向开，用血管错去除厮带内=根血管（两条动脉，一条静脉），同时去除厮带外膜；将分 离好的厮带用眼科剪剪成约1皿3大小的组织块，取适量放入直径为10cm的无菌培养皿中， 覆盖70%培养皿的底面积。加入L0NZA人干细胞无血清培养液化onza叫traCULTURE?)， 5%C02、37°C、湿度为95%的C〇2培养箱中培养。第5天~7天半量换培养基，继续培养12 天~14天左右全量换液去掉组织块同时收集细胞传代培养。
[0060] 经传递3~5代的hUC-MSCs细胞