一种玉屏风药渣多糖合生元的制备及其在免疫调节中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及玉屏风药渣多糖合生元的制备及其在免疫调节中的应用，属于中药渣 资源化技术和微生态制剂领域。
【背景技术】
[0002] 中药因毒副作用小，被广泛用于预防和治疗各种疾病，在亚洲各国已有悠久的历 史。近年来，无论是商业需求还是学术研究，中药都获得广泛关注，中药的辨证理论也逐渐 深入人屯、。大量研究报道许多中药具有免疫调节功能，但对中药渣的研究较少。随着中医 药事业的快速发展，中药渣废弃量日益巨增，据报道，仅中国每年中药渣排放量就高达3000 万吨。如何有效利用中药渣是实现中药可持续化和现代化的一个亟待解决的问题。传统 上，中药渣被习惯性的直接废弃，造成严重的环境污染和大量自然资源的浪费，或经粗加工 后添加于动物饲料中，但因适口性差、气味重、有效成分低及加工工艺粗糖等导致其生物效 价低。因此，研究中药渣资源化具有广泛的应用价值。
[0003] 目前对中药渣资源化技术的研究较多，如有效成分的再提取、微生物发酵、酶解、 作为有机肥、饲料添加剂和真菌培养基质等，其中最为突出的是提取中药渣残留的有价次 生组分和益生菌中药合生元的研究。研究报道对玉屏风药渣进行再次醇沉，提高了活性成 分的含量；五味子药渣经蛹虫草菌发酵后显著提高仔猪免疫功能。因此，制备中药渣合生元 是中药渣资源化技术开发的主要方向。
[0004] 此外，少抱根霉发酵工艺日趋成熟，发酵产物药理活性强。研究发现，少抱根霉已 广泛被应用于乳酸、植酸酶、葡萄糖浆、乙酷氨基葡萄糖和葡萄糖胺的生产，并有研究报道， 少抱根霉发酵西谷挪子后显著提高了其营养价值尤其是氨基酸含量；发酵养麦后显著提高 了蛋白质和部分矿物质含量；发酵刀豆后显著提高了其生物活性物质含量及抗氧化活性。
[0005] 玉屏风是中国扶正固表的经典复方，W黄巧为君药，白术为臣药，防风为佐药，有 益气固本防汗之功，具有强大的免疫调节功能。临床上广泛用于治疗呼吸道疾病，如感冒、 哮喘、过敏性鼻炎、肺纤维化等，并在2003年预防和治疗SARS中起重要作用。现代药理研 究表明，玉屏风多糖是其主要活性成分，对体液免疫、细胞免疫W及单核巨隧系统有广泛的 影响。研究发现，玉屏风能促进免疫器官的发育、免疫细胞的增殖分化成熟、增强巨隧细胞 吞隧活性、调控免疫球蛋白及细胞因子、趋化因子等的表达。同时也有研究报道，在LI^S或 ConA诱导的慢性炎症细胞中，玉屏风能通过NF-KB信号途径括抗LPS或ConA的诱导活性， 表现出抗炎活性。此外，有研究表明玉屏风生物转化液也具有较强免疫调节作用。
[0006] 随着人们保健意识的提高，中药W其天然无毒副作用和无污染等特点受到人们的 青睐。近年来，中药合生元在预防、治疗疾病中起着重要作用，尤其是中药多糖合生元。研究 认为中药多糖合生元能提高机体生长性能，促进免疫器官发育、增强巨隧细胞吞隧功能等。 但鲜见中药渣多糖合生元的报道，也未见其相关产品。本发明人研究了玉屏风药渣多糖合 生元的制备及对免疫细胞增殖活性、吞隧活性及细胞因子表达的影响，探讨玉屏风药渣多 糖合生元的免疫调节活性。因此，将Yro经少抱根霉菌甜发酵生产合生元，不仅充分利用 了玉屏风药渣，还获得了优质的微生态制剂，运不论是从自然资源的利用上，还是社会经济 效益上均具有深远意义。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足而提供一种玉屏风药渣多糖 合生元在免疫调节中的应用，该合生元可W作为药品、保健品或动物饲料添加剂。
[0008] 本发明所述的YTO是从玉屏风药渣中经一定工艺再提取获得；少抱根霉菌 烟lizopusoligosporus)甜是从食品（丹贝）中分离获得，经驯化后，能够适应YPD，于 2015年6月7日由湖北省武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中屯、（CCTCC)保藏，保藏号 为CCTCCNO:M2015360。
[0009] 本发明参考合生元可用于生产实践中预防和辅助治疗动物疾病的思维，从丹贝中 分离的少抱根霉菌甜发酵YTO获得玉屏风药渣多糖合生元，然后探讨合生元在免疫调节中 的应用，表明经合生元处理后，提高了小鼠淋己细胞和腹腔巨隧细胞的体外免疫活性，并在 LI^S诱导的慢性炎症模型中，表现出抗炎活性，即展现了其双向免疫调节作用。
[0010] 本发明的技术方案： W11] 将YPD粉末配制成终浓度为0.Ig/血的溶液，经流通蒸汽灭菌60min，待冷却至 50°C左右，按3%接种已经纯化和驯化的少抱根霉菌甜，28°C、150巧m恒溫发酵2-3天。发 酵后经真空冷冻干燥，制片，获得合生元。
[0012] 本发明也提供合生元在体外免疫调节中的应用。本发明探讨不同浓度的YTO和 合生元（终浓度：〇.〇〇〇、〇. 025、0. 050、0. 100、0. 200、0. 400、0. 800、1. 600、3. 200mg/mL)对 4周龄昆明种小鼠脾淋己细胞、胸腺淋己细胞和腹腔巨隧细胞的增殖活性、吞隧活性和合成 NO量及细胞内比-6、TNF-a、IFN- 丫、NF-KB、化R-4和iNOS的表达，探讨合生元是否具有 免疫增强作用；并利用LI^S诱导的慢性炎症模型，探讨合生元是否具有抗炎活性。
【附图说明】 阳01引图1为少抱根霉菌甜基因组总DNA的电泳图。
[0014] 图2为少抱根霉菌甜基因组口S1-5. 8S-口S2区PCR产物的电泳图。
[0015] 图3为少抱根霉菌甜基因组口S1-5. 8S-口S2区的进化树。
[0016] 图4为YPD的GC-MS测定结果图谱，其中保留时间11. 04对应果糖，保留时间30. 24 对应化喃葡萄糖巧。
[0017] 图5为玉屏风药渣多糖合生元的GC-MS测定结果图谱，其中保留时间11. 04对应 果糖，保留时间30. 24对应化喃葡萄糖巧。
[0018] 图6为本发明玉屏风药渣多糖合生元对小鼠淋己细胞和巨隧细胞的细胞因子表 达量的影响。图6A是合生元对细胞IL-6表达量的影响；图6B是合生元对细胞TNF-a表 达量的影响；图6C是合生元对细胞IFN-r表达量的影响；图6D是合生元对细胞iNOS表达 量的影响；图6E是合生元对细胞化R-4表达量的影响；图6F是合生元对细胞NF-KB表达 量的影响；（注：*表示与对照组相比较，#表示与LPS组相比较，&表示与YDP组相比较，*、 # 和 & 表示P< 0. 05,林、## 和 && 表示P< 0. 01)。
【具体实施方式】
[0019]W下结合实施例和试验数据对本发明发的技术特征和优点作详细的说明。
[0020] 实施例1少抱根霉菌甜的鉴定 将霉菌甜的基因组总DNA按照狂huH，1993.NucleicAcidsResearch，21 (22): 5279)的改良氯化节法提取，用2%琼脂糖凝胶检测总DM(图1)。霉菌甜基因组总DM的 ITS1-5.8S-ITS2区按照（刘小莉.2009.现代食品科技，25 (5) =2578-2585)的方法扩增， PCR产物用1. 0%的琼脂糖凝胶检测（图2)。纯化后的PCR产物送北京华大基因测序，测得 霉菌甜口S1-5. 8S-口S2区序列长为65化P(序列表1)。在Genbank中进行Blast比对后， 与少抱根霉菌亲缘性最高，同源性达100%，并建立进化树（图3)。因此，本发明将其鉴定 为少抱根霉菌巧hizopusoligospo;rus)SH。
[0021] 实施例2少抱根霉菌甜的驯化 将少抱根霉菌甜接种于含5%YPD的PDA中，28°C培养2地，连续传5代，然后依次接 种到含10%、20%、40%、80%、100%YPD的PDA培养液中培养2地，每个浓度连续传3代， 获得适应YPD的少抱根霉菌甜，保存备用。
[0022] 实施例3玉屏风药渣多糖合生元的制备 用蒸馈水溶解YPD(终浓度：0.Ig/mL)，经流通蒸汽灭菌60min，冷却，按照3%接种量接 种已经纯化和驯化的少抱根霉菌甜，150rpm，28°C恒溫发酵2-3天，真空冷冻干燥为粉末即 为合生元。取合生元制成终浓度为Ig/mL的溶液，经0. 22ym的针头过滤器除菌，4°C保存 备用。
[0023] 实施例4合生元蛋白含量的检测 采用凯氏定氮法检测合生元蛋白含量，显示合生元中蛋白含量增加，增长率为9. 3%。
[0024] 实施例5合生元单糖组成测定 准确称取lOmg冷冻干燥后的YTO和合生元，加入2血无水化晚，75°C水浴30min，然后 加入0. 6血硅烷化试剂（六-甲基二娃胺烧、S甲基氯硅烷W2 : 1混合，v/v)摇匀，60°C 反应10min，1000Xg离屯、lOmin，取上清进行GC-MS测定。GC-MS测定成条件为：高纯度成， 流速1.2血/min进样量1化；分流比50 : 1，进样口溫度250°C，初始100°CWl〇°C/min升 至180°C，再W30°C/min升至240°C，保持5min。结果表明，YTO发酵后单糖组成发生较大 变化，其中果糖显著下降、化喃葡萄糖巧显著上升（表1、图4、5)。
[00巧]表1YTO发酵前后单糖组成分析表
注：同行字母肩标相同表示差异不显著（P> 0. 05)，不同表示差异显著（P< 0. 05)，/ 表示没有检测出。 阳0%] 实施例6玉屏风药渣多糖合生元对细胞增殖活性的影响 取96孔细胞培养板，每孔加入细胞液100 y 1(1X10シ孔），不同浓度（终浓度：0.000、0. 025、0. 050、0. 100、0. 200、0. 400、0. 800、1. 600、3. 200mg/mL)的YPD或合生元10 y L完全 培养液补足200yL。置5% C〇2培养箱37°C培养44h后；或培养化后，各孔加入LPS(终浓 度：1 yg/mL)10yL，继续培养2