一种壳聚糖基载药温敏水凝胶及其在用于制备动物疫苗和缓控释药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药工程技术领域，具体涉及一种壳聚糖基载药温敏水凝胶及其 在用于制备动物疫苗和缓控释药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 壳聚糖（chitosan，CS)是甲壳素的脱乙酞基产物，是一种天然可生物降解的聚阳 离子多糖。壳聚糖具有无毒、良好的生物相容性、可生物降解性等优点，在生物医学及制药 等方面的应用极其广泛。
[0003]CS分子内富含氨基和羟基，可形成氢键，因此CS不溶于水和有机溶剂，但可溶于 (稀）酸溶液中。GP为弱碱性化合物（pKa6. 34)，含羟基和磷酸根负离子，是对人体安全的 双官能团阴离子偶联剂，可使壳聚糖溶液凝胶化，形成三维凝胶网络。在CS/GPS体系中主 要存在着静电作用平衡、氢键作用平衡以及CS的疏水作用。这些相互作用力的平衡会随温 度的改变而改变，CS/GPS水凝胶体系从而表现出温度敏感性。但是壳聚糖和甘油磷酸钠二 者形成的温敏水凝胶机械性能较差，难以维持其有效形状，因此极大的影响了其应用。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种壳聚糖基载药温敏水凝胶及其在用于制备动物疫苗和缓控释 药物中的应用，本发明在壳聚糖/甘油磷酸盐的配方基础上加入了聚乙烯醇，可有效提高 温敏凝胶的机械强度，有助于温敏凝胶注射到皮下后可有效维持原有形状。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
[0006] -种壳聚糖基载药温敏水凝胶，它通过以下制备方法获得：
[0007] (1)配制母液：用乙酸溶解壳聚糖制得浓度为2% -6%的壳聚糖溶液，用水溶解 聚乙烯醇制得浓度为1% -4 %聚乙烯醇溶液，用水加热溶解β-甘油磷酸钠制得浓度为 50% -85%的β-甘油磷酸钠溶液，所述浓度均为质量体积比；
[0008] (2)在室温搅拌下将所述β-甘油磷酸钠溶液缓慢滴入所述聚乙烯醇溶液中；搅 拌均匀得到聚乙烯醇/β-甘油磷酸钠混合溶液；
[0009] (3)将所述聚乙烯醇/β-甘油磷酸钠混合溶液与所述壳聚糖溶液进行混合得到 所述壳聚糖基载药温敏水凝胶。
[0010] 进一步的：所述温敏水凝胶含有2.0%壳聚糖、1%聚乙烯醇和7.8%β-甘油磷酸 钠，浓度为质量体积比浓度。
[0011] 进一步的：所述步骤（1)中溶解β-甘油磷酸钠的加热温度为80-120°C。
[0012] 进一步的：所述步骤⑵中β_甘油磷酸钠与聚乙烯醇的质量比为5-10 :1。
[0013] 进一步的：所述步骤（3)中聚乙稀醇与壳聚糖的质量比为1 :2。
[0014] 进一步的：所述步骤（3)中使用双联管混合，一管为聚乙烯醇/β-甘油磷酸钠混 合溶液，另外一管为壳聚糖溶液，在临用前将二管溶液进行混合。
[0015] 本发明还提供了所述的壳聚糖基载药温敏水凝胶在用于制备动物疫苗中的应用。
[0016] 进一步的：所述动物疫苗包括鸡新城疫苗、鸡传染性法氏囊疫苗和猪瘟活细胞疫 苗。
[0017] 本发明还提供了所述的壳聚糖基载药温敏水凝胶在用于制备缓控释药物中的应 用。
[0018] 进一步的：所述缓控释药物包括醋酸氯己定和克霉唑。
[0019] 与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明所述壳聚糖基载药温敏水 凝胶包括壳聚糖、聚乙烯醇和β-甘油磷酸钠，此水凝胶体系具有温敏性，可用于药物控释 系统；本发明利用壳聚糖温敏凝胶的温敏性及药物控释性能，以及聚乙烯醇的加入可以有 效增强壳聚糖温敏凝胶的机械强度，保证注射到体内后可维持半固体的形态；而且可以使 温敏凝胶具有缓释功能，可将其应用于对动物疫苗的缓释方向上，使疫苗可在一定时间内 持续释放，达到更好的防疫效果。
[0020] 结合附图阅读本发明的【具体实施方式】后，本发明的其他特点和优点将变得更加清 楚。
【附图说明】
[0021] 图1是壳聚糖基温敏水凝胶膜片上人脐静脉血管内皮细胞生长状况显微镜观察 (100X)，Α、Β分别是在第3, 5天对照组人脐静脉血管内皮细胞的显微镜观察（100X)，C、D 分别是在第3,5天对实验组人脐静脉血管内皮细胞的显微镜观察（100Χ)。
[0022] 图2是壳聚糖基温敏水凝胶膜片上人脐静脉血管内皮细胞相容性的ΜΤΤ分析。
[0023] 图3是壳聚糖基温敏水凝胶膜片浸提液培养L929细胞显微镜观察（100X) ;Α、Β 分别是在第3, 5天对照组L929细胞的显微镜观察（100X) ;C、D分别是在第3, 5天对实验 组L929细胞的显微镜观察（100X)。
[0024] 图4是壳聚糖基温敏水凝胶膜片浸提液培养L929细胞MTT结果。
[0025] 图5是醋酸氯己定溶液的标准曲线。
[0026] 图6是克霉唑溶液的标准曲线。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
[0028] 实施例1 :壳聚糖基温敏水凝胶及其制备方法
[0029] 所述壳聚糖基温敏水凝胶的制备方法包括以下步骤（10ml体系）：
[0030] (1)取5ml0· 2M乙酸溶解0· 2g壳聚糖（质量体积比浓度为4% )，4ml超纯水溶 解聚0.lg乙烯醇（质量体积比浓度为2. 5% )，lml超纯水加热溶解0. 78gβ-甘油磷酸钠 (质量体积比浓度为78% );所述质量体积比中的质量单位为g，体积的单位为ml;
[0031] (2)在室温搅拌下将β-甘油磷酸钠（GP)溶液缓慢滴入聚乙烯醇（PGA)溶液中； 搅拌均匀得到聚乙烯醇/β-甘油磷酸钠混合溶液（PGA/GP溶液）；
[0032] (3)将所述聚乙烯醇/β-甘油磷酸钠混合溶液与所述壳聚糖溶液进行混合得到 所述壳聚糖基载药温敏水凝胶。可以使用双联管进行混合，一管为聚乙烯醇/β-甘油磷酸 钠混合溶液，另外一管为壳聚糖溶液，可在临用前将二管溶液进行混合；如不使用双联管， 则将聚乙烯醇/β-甘油磷酸钠混合液（PGA/GP混合溶液）在搅拌下缓慢滴入壳聚糖溶液 中，搅拌均匀得到CS/PGA/GP混合凝胶，低温（4-15°C)保存。
[0033] 最终制得的壳聚糖基温敏水凝胶含有以下成分：以质量体积比计，2. 0%的壳聚糖 +1 %聚乙烯醇+7.8%β-甘油磷酸钠。
[0034]制得的所述壳聚糖基载药温敏水凝胶在室温条件下流动性好并且具有热致成胶 性，在37°C环境下，溶胶很快转变成流动性能较差的凝胶，成胶时间可以控制在20s-5min 不等。
[0035] 实施例2 :壳聚糖基温敏水凝胶的细胞相容性实验
[0036] 首先壳聚糖基温敏水凝胶胶液铺膜。然后将壳聚糖基温敏水凝胶膜片切成直径为 1.lcm的圆形膜片。对圆形膜片依次进行25%、50%、75%酒精浸泡，每次2-3h。最后一次 用75%无菌酒精浸泡l-2d。然后再将膜片转移到无菌的D-Hanks缓冲液中浸泡，每次10h 左右，至少更换缓冲液4-5次。最后放在D-Hanks缓冲液中浸泡放置待用。
[0037] 向48孔细胞培养板中加入含10%胎牛血清（FBS)的100微升DMEM培养基，然后将 对应膜片放在预定培养孔中，每组每时间点5个平行样。膜片放置完成后，取细胞培养瓶， 对L929细胞进行清洗、换液、消化处理，使用血球计数板计算细胞密度，通过添加培养基， 将细胞密度控制在5X105左右。取200微升细胞悬液，加入到预定培养孔中。阴性对照为 同体积纯DMEM培养基。将培养板放在5%C02, 37°C细胞培养箱中恒温培养，在第3、5天时 分别对细胞状态进行观察、拍照。并在拍照之后，用0.25%胰蛋白酶对膜片上的血管内皮细 胞进行消化处理，将消化的细胞转移到96孔细胞培养板，静置12h待细胞贴壁后，每孔加入 5mg/ml的MTT20μL，常规孵育4h。吸弃培养液，加入二甲基亚砜150μL，37°C保温lOmin， 振荡器上混匀40s，用酶标仪（490nm波长处）测各孔的0D值。
[0038] 实验结果如图1所示，对照组和实验组人脐静脉血管内皮细胞均为鹅卵石形状。 实验组细胞与对照组没有显著差异，在培养第5天时形成致密单层。但是通过MTT结果（图 2)分析可看出，实验组血管内皮细胞数量略高于对照组，但没有显著性差异（P>〇. 05)。因 此可知壳聚糖基温敏水凝胶膜片和人脐静脉血管内皮细胞有较好的细胞相容性，可以在一 定程度上促进血管内皮细胞的生长。
[0039] 实施例3:壳聚糖基温敏水凝胶的细胞毒性实验
[0040] 取对数生长期的小鼠成纤维细胞L929, 0.25 %胰酶消化后调节细胞浓度成为 1X104/ml，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板，每孔加200μL细胞悬液。在C02培养箱 (37°C，5%C02)中预培养24h后，吸弃原培养液，换成已经浸提壳聚糖基温敏水凝胶膜片 超过24h的DMEM培养基，对照组加入正常的培养基，各组设立12个平行样，将培养板置于 37°C，5%C02培养箱中继续培养。分别于第3天和第5天取出培养板，显微镜下观察细胞状 态，每孔加入5mg/ml的MTT20μL，常规孵育4h。吸弃培养液，加入二甲基亚砜150μL，37°C 保温lOmin，振荡器上混匀40s，用酶标仪（490nm波长处）测各孔的0D值。
[0041] 按下式计算细胞的相对增值率（relativegrowthrate，RGH):
[0042]
[0043] 细胞毒性分级：0级：RGH兰100% ;1级：75%~95% ;2级：50%~74%;
[0044] 3 级：25%~49% ;4 级 1%~24% ;5 级：0%
[0045] 评价标准：
[0046] (1)实验结果级为合格；
[0047] (2)实验结果为2级，应结合细胞形态分析，综合评价；
[0048] (3)实验结果为3-5级为不合格。
[0049] 从图3可以看到实验组和对照组的L929细胞生长没有显著差异，细胞生长状况良 好，为典型的漩涡状排列，这和图2的MTT结果相吻合。从图4可以看出，实验组细胞0D值 略高于对照组，RGH> = 100%，因此判定温敏水凝胶细胞毒性为0级。
[0050] 实施例4:壳聚糖基载药温敏水凝胶对猪瘟细胞活疫苗效价的影响评价
[0051] 通过壳聚糖温敏凝胶的包载，可有效延长猪瘟细胞活疫苗的免疫时间，增强免疫 效果，且避免了繁琐的多次免疫。猪瘟细胞活疫苗中猪瘟病