一种稳定的蛋白质载药微粒系统制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明公开一种稳定的蛋白质载药微粒系统制备方法，可用于体内递送药物至病 灶部位而发挥药效，属于生物制药技术领域。
【背景技术】
[0002] 蛋白质载药微粒系统用于递送药物是目前研究大热点，通过体内相容性好蛋白质 递送药物至病灶部位，靶向至病灶缓慢释放，可以延长药物半衰期和降低药物毒性，从而可 以提1?疗效，降低药物毒性。
[0003] 蛋白质微粒作为研究热点，有众多报道蛋白质微粒制备方法，包括热交联、化学交 联、乳化法等。这些制备方法中典型代表为乳化高压均质法，2005年上市紫杉醇白蛋白纳米 粒（abraxane)是成功的代表，开创蛋白质微粒系统临床治疗的先河。Abraxane采用乳化高 压均质法技术(美国专利US6749868, US5560933)，将白蛋白溶液、紫杉醇的乙醇溶液和三 氯甲烷混合形成乳液，然后使用高压均质机进行制粒，接着高温去除有机溶剂后再水化，即 可制备出紫杉醇白蛋白纳米粒。该制备方法复杂，使用高压均质和高温等条件，容易造成蛋 白质变性，失去生物活性，也增大了成本，其次使用到三氯甲烷等毒性大溶剂，这无疑影响 到产品安全性。
[0004] CN201010247885. 7公开一种制备用于体内递送药理活性物质的蛋白纳米粒的方 法，利用蛋白质在55-75°C左右打开蛋白质疏水性区域，而利用蛋白质二硫键打开再折叠自 组装方法将药物包埋蛋白纳米粒中。但该方法需要在高温55-75 °C左右反应，致使很多药理 活性物质无法耐受高温，比如紫杉醇在高温下其7-表紫杉醇杂质会线性增大，从而影响产 品的质量。
[0005] 在现行制备方法中，基本都是根据蛋白质变性原理，采用高温、高压、化学变性物 质固化蛋白，实现蛋白质微粒系统的制备。然而无论是高压、高温、化学变性剂都使得产品 质量存在未知不安全因素。要么对蛋白质活性有损失，要么影响药物和产品质量，均存在一 定缺陷。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种稳定的蛋白质载药微粒系统制备方法，解决上述蛋白质微粒制备 时高温、高压或化学变性剂等缺陷，可在低温、常压和无化学变性剂的条件下利用桥梁剂溶 液方法制备成蛋白质载药微粒系统，进一步保障蛋白质活性和蛋白质载药微粒系统的产品 质量。同时应用这种制剂系统递送药物至体内而发挥药效。本发明制备工艺简单，适合产 业化。
[0007] 本发明提供一种稳定的蛋白质载药微粒系统制备方法，其利用桥梁剂将含药物的 有机相和含蛋白质的水相溶液混合成均相溶液；来实现蛋白质载药微粒系统的制备，其具 体步骤如下： 1)用有机溶剂溶解药物，形成含药有机相； 2) 将蛋白质溶于水或缓冲体系中制备成l(T500mg/ml的蛋白质的水相溶液； 3) 在步骤1)中加入P/Γ饱和的桥梁剂溶液混匀，然后将2)中蛋白质水相溶液加入， 混匀成均相溶液； 4) 在(T80°C条件下，将步骤3)中形成均相溶液直接冷冻干燥制备成冻干粉针，采用5% 葡萄糖或生理盐水等配伍稀释，即形成稳定的蛋白质载药微粒系统； 或将步骤3)中均相溶液直接使用水或5%葡萄糖、生理盐水、缓冲盐体系进行稀释，形 成稳定的蛋白质载药微粒系统； 所述桥梁剂为盐酸盐，硫酸盐，磷酸盐，碳酸盐中任意一种。
[0008] 本发明所述的桥梁剂优选氯化钠，硫酸铵，氯化钾，硫酸钠，硫酸镁，磷酸钠，磷酸 钾，磷酸二氢钠，碳酸钠。
[0009] 本发明核心技术为通过桥梁剂将含药物有机相与蛋白质水相溶液混匀成均相溶 液来制备蛋白质载药微粒系统，其所述的桥梁剂为盐酸盐，硫酸盐，磷酸盐，碳酸盐。优选氯 化钠，硫酸铵，氯化钾，硫酸钠，硫酸镁，磷酸钠，磷酸钾，磷酸二氢钠，碳酸钠。更优选氯化 钠。
[0010] 本发明的制备方法中步骤1)所述有机溶剂为醇类，酮类，酰胺类或亚砜类，优选乙 醇、叔丁醇、丙酮、N，N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜。
[0011] 本技术方案制备方法中步骤2)所述蛋白质为白蛋白，血红蛋白，肌红蛋白，溶菌 酶，免疫球蛋白，转铁蛋白，球蛋白，股原蛋白。优选为人血白蛋白。
[0012] 本技术方案所述在于步骤4)所述稀释的倍数为1~500倍，优选为10-50倍。
[0013] 本发明提供一种稳定蛋白质载药微粒系统制备方法，其特征在于：所述包载药物 为抗肿瘤药物，优选紫杉醇，多烯紫杉醇，卡巴他赛，阿霉素，替西罗莫司，西罗莫司，丝裂霉 素，罗米地辛，SN38,顺钼及其衍生物，伊立替康、拓扑替康、埃博霉素，伊沙匹龙，硼替佐米。 更优选为紫杉醇。
[0014] 本发明所述蛋白质稳定微粒系统的平均粒径为IOnnTlO μ m，优选为50nnT500nm, 最优选为50nm?250nm。
[0015] 本发明进一步公开一种稳定的人血白蛋白载地西他滨微粒系统制备方法，包括以 下步骤：首先用二甲亚砜溶解地西他滨，然后在有机相中加入1~15%氯化钠溶液，混合均匀 后，加入l(T500mg/ml pH 7~8人血白蛋白缓冲液，混勻为均相溶液后，分装，冻干，临床使 用时采用5%葡萄糖或生理盐水等稀释剂配伍稀释成稳定的蛋白质载地西他滨微粒系统。
[0016] 本发明还公开了一种稳定的人血白蛋白载紫杉醇微粒系统制备方法，包括以下步 骤：首先用无水乙醇溶解紫杉醇，然后在有机相中加入1%~饱和氯化钠溶液，混合均匀后， 加入l(T500mg/ml白蛋白水溶液，混匀为均相溶液后，稀释到ΚΓ50倍的(T70°C注射用水 中，人血白蛋白快速包埋紫杉醇形成人血白蛋白载紫杉醇微粒系统。
[0017] 本发明的稳定蛋白质载药微粒系统在临床使用时可采用生理盐水、葡糖糖溶液等 配伍稀释后直接注射或静脉滴注给药。
[0018] 本发明的积极效果在于：制备方法工艺简单，条件温和，适合产业化，克服现有制 备方法中使用高温、高压或化学交联剂等缺点，可在温和条件下，利用桥梁剂溶液将含药物 的有机相和含蛋白质的水相溶液混合成均相溶液；来制备稳定蛋白质载药微粒系统。
[0019] 本发明制备稳定蛋白质载药微粒系统还可以使用超滤洗涤浓缩装置，致使微粒系 统更适宜产业化，同时通过除水步骤制备成药物制剂，进一步增大蛋白质稳定微粒系统的 稳定性和实用性，方便使用，存储和运输。
【附图说明】
[0020] 图1、人血白蛋白载丝裂霉素微粒系统的粒径分布结果。
[0021] 图2、人血白蛋白载紫杉醇微粒系统的粒径分布结果。
[0022] 图3、人血白蛋白载紫杉醇微粒复溶后溶液照片。
[0023] 图4、桥梁剂在含药有机相和人血白蛋白水相中作用验证。
【具体实施方式】
[0024] 以下通过实施例来进一步说明本发明，必须说明，本发明的实施例是用于说明本 发明，而不应理解为对本发明的限制。
[0025] 实施例1 将IOmg丝裂霉素溶于Iml N，N-二甲基乙酰胺中，然后加入5%氯化钠溶液Iml混合 均匀，最后加入用pH 7. 8磷酸盐缓冲液溶解成20%人血清白蛋白溶液2ml，形成均相溶液。 在〇°C下，将该均相溶液直接冻干成粉针制剂，最后粉针成品采用生理盐水稀释，采用马尔 文粒度分析仪ZS90测定粒径和HPLC测定载药量。结果显示人血白蛋白载丝裂霉素微粒系 统平均粒径为290. 9nm，粒径及其粒径分布图见图1。微粒载药量达2. 1%。
[0026] 实施例2 将Img硼替佐米溶于Iml叔丁醇中，然后加入2%氯化钠溶液0. 5ml混合均匀，最后加 入2%牛血清白蛋白溶液0. 5ml，形成均相溶液。在室温下，将该均相溶液直接冻干成粉针制 齐U，最后粉针成品采用生理盐水稀释，采用马尔文粒度分析仪ZS90测定粒径和HPLC测定微 粒载药量，结果表明制备微粒系统平均粒径为164nm，微粒载药量达7. 8%。
[0027] 实施例3 将IOmg地西他滨溶于Iml二甲亚砜中，然后加入1%磷酸钠溶液Iml混合均匀，最后 加入用pH 7.0磷酸盐缓冲液溶解成50%牛血清白蛋白溶液0.4ml，形成均相溶液。在室温 下，将该均相溶液直接冻干成粉针制剂，最后粉针成品采用生理盐水稀释，采用马尔文粒度 分析仪ZS90测定粒径和HPLC测定微粒载药量，结果表明制备微粒系统平均粒径为264nm， 微粒载药量达4. 1%。
[0028] 实施例4 将40mg紫杉醇溶于4ml乙醇中，然后加入12. 5%氯化钠溶液2ml混合均匀，最后加入 10%人血白蛋白溶液I. 0ml，形成均相溶液。将该均相溶液在40°C下使用注射用水稀释100 倍，得到淡蓝色澄清溶液。采用马尔文粒度分析仪ZS90测定粒径和HPLC测定微粒载药量， 实验结果表明制备微粒系统平均粒径为102nm，粒分布径图谱见图2,微粒载药量达18. 4%。 同时将该溶液超滤浓缩后，分装，冻干，冻干后复溶溶液稀释不同浓度图片见图3 :a.为人 血白蛋白载紫杉醇微粒复溶后浓度〇. 2mg/ml溶液照片；b.为人血白蛋白载紫杉醇微粒复 溶后浓度〇. 5mg/ml溶液照片；c.为人血白蛋白载紫杉醇微粒复溶后浓度2mg/ml溶液照 片。
[0029] 实施例5 将6mg紫杉醇溶于2ml甲醇中，然后加入10%氯化钾溶