专利名称：在无菌条件下滤过性稳定微粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及粒径非常小、除了具备易于在毛细血管内血流中流动这一优点以外还具备稳定性、能够被无菌过滤和能够被冻干诸多优点的微粒。
专利申请EP 523 183、EP 520 888和EP 520 889描述了具备可注射优点的小球形颗粒。然而，如此制成的微粒的平均粒径约为50-500nm并且在不出现产率减损明显的情况下无法通过无菌过滤实现无菌化和/或由于其稳定性不足而无法被冻干。
在Eur.J.Pharm.Biopharm.，39(5)，173-191(1993)中，其它人审阅了目前适用于药品工业中微粒的领域的技术。在第182页，明确指出从未有人描述过微粒悬浮液的无菌过滤。
业已发现，这也正是本发明的目的，可以制备其平均直径为其中95％小于100nm、更具体地其平均直径为20-75nm并且因此可在不使产率减损的条件下被0.22μm滤器无菌过滤的颗粒。此外，这些颗粒比先有技术得到的颗粒更为稳定并且可以在不产生颗粒附聚现象的条件下被冻干。
按照本发明，微粒含有至少一种憎水，非水溶性和非水分散性、可在磷脂和胆汁酸盐的水溶液或水分散体中被乳化的聚合物或共聚物.
按照本发明，活性组分可以与聚合物或共聚物一起被导入微粒之中。
作为实例，磷脂选自天然的，合成的或半合成的磷脂，更具体地，可选用卵磷脂(磷脂酰胆碱)如鸡蛋或纯大豆中的卵磷脂(卵磷脂E100、卵磷脂E80、Phospholipons如Phospholipon 90)、磷脂酰乙醇胺、磷酯酰丝氨酸、磷酯酰肌醇、磷脂酰甘油、二棕榈磷脂酰胆碱、二棕榈酰甘油磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷酯酰胆碱、磷脂酸或其混合物。
按照本发明，举例来说，胆汁酸盐为由胆酸衍生的盐，尤其是选自胆酸盐、牛磺胆酸盐、甘胆酸盐、脱氧胆酸盐、鹅去氧胆酸盐、脱氧甘胆酸盐、脱氧牛磺胆酸盐、牛磺鹅脱氧胆酸盐、脱氢胆酸盐或这些盐的衍生物或其混合物。有利的作法是使用其钠盐。
憎水性、非水溶性和非水分散性聚合物或共聚物可以选自生物相溶性和生物可降解性聚合物如乳酸或乙醇酸聚合物及其共聚物，或分子量优选为1000-200000的聚乳酸/聚环氧乙烷(或环氧丙烷)共聚物，多羟基丁酸的聚合物，含至少12个碳原子的脂肪酸的聚内酯或聚酐。
本发明的微粒完全适用于憎水活性组分的应用场合。能够被利用的活性组分选自范围广泛的用于医学或兽医的药物。它们可选自用于化妆品业、食品业的组分或选自诊断试剂。
作为实例，令药品工业感兴趣的活性组分可以选自、但不限于抗风湿药，非类固醇消炎药、止痛药、镇咳药、治疗精神病药、类固醇、巴比土酸、抗生素、抗过敏药、抗哮喘药、抗痉挛药、抗分泌药、心血管药和脑血管扩张剂、健脑药和健肝药、胃肠道治疗剂、抗癌药或抗病毒剂、维生素、避孕药、疫苗…。
按照本发明，微粒可以通过溶剂蒸发技术由其中被加入了含活性组分和憎水性、非水溶性和非水分散性聚合物或共聚物的非混溶性有机相的磷脂和胆汁酸盐的水分散体或溶液得到。该混合物经过预乳化后被均化，蒸除有机溶剂后得到尺寸很小的微粒的水悬浮液。
实施例将对该方法的实施作更详细的描述。
非混溶性有机相优选自可作为所选用的聚合物体系良好溶剂的挥发性溶剂。例如可选用酯尤其是乙酸乙酯、氯代溶剂如CH2Cl2或氯仿，或选自酮如甲乙酮。
一般地，活性组分优选占导入的聚合物数量约25％(重)。不过该数值可以改变，视需要而定可以更低或甚至多达被加入的聚合物或共聚物的50％(重)。
非混溶的有机相中活性组分与聚合物或共聚物占溶液重量的0.1-7％(重)。
由磷脂和胆汁酸盐的水分散体或溶液构成的水相有利地以摩尔比1/1含有这些组分。不过该比值可以变化，从而使磷脂与胆汁酸盐的摩尔比为0.1-1。
水相的组成是磷脂与胆汁酸盐总量占溶液的0.2-2％(重)。
选择有机相与水相的相对数量以便使有机相占水相的20-60％(体积)。
在不出现阻塞现象并且以高产率的方式过滤如此得到的微粒。借助孔隙率递减的滤器进行阶式过滤，随后，用0.22μm的滤器进行最后过滤。
优选地，于过滤之后，在一种或多种防冷冻剂存在下冻干所得到的悬浮液，该防冷冻剂构成冻干悬浮液的约5％(重量/体积)。
用于冻干的溶液含有一定添加剂如非离子化合物例如防冷冻剂或用于调整待注入的最终溶液的等渗性的试剂。这些试剂选自糖(例如葡萄糖、山梨糖醇、蔗糖、甘露糖醇)、聚合物〔例如葡聚糖(葡聚糖1500，葡聚糖40000)、可注射的聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇…〕、氨基酸(例如甘氨酸)或能够产生该作用的其它试剂。其中还含有防腐剂。必要时，冻干液可以在使用时用水溶解以便制成注射剂。这种操作当然不会改变颗粒大小。
本发明微粒由于其稳定性而特别令人感兴趣。该稳定性尤其使得产生的冻干液质量优良，在使用过程中将其重新溶解和/或悬浮的能力得到提高，为此，重新形成的悬浮液含有直径接近初始微粒的颗粒。
本发明微粒可被用可制备用于人药或兽药、化妆品、食品或诊断试剂的无菌组合物。
该技术由于开辟了以工业规模制备稳定和无污染的、视需要而定带有活性组分(时至今日，这仍然无法办到)的微粒悬浮液的途径而格外令人感兴趣。
此外，本发明的稳定化微粒在特定活性组分如紫杉化合物类抗癌药物的情况下特别有利。它们与传统配方相比能够提高产物的活性。
对被植入黑素瘤B16的小鼠通过静脉内给药进行研究的实施例6的化合物与处在多乙氧基醚/乙醇/右旋糖5％水溶液(5/5/90体积)混合物中的传统配方相比，前者的微粒组合物形式的活性比后者高2倍。
本发明还涉及本发明微粒的药物组合物，该微粒可视需要而定与一种或多种相容性和药物可接受的赋形剂或助剂结合。这些组合物优选为可被注射的组合物。
非肠胃给药包括静脉内给药、腹膜内给药、肌肉或皮下给药。更为优选的是腹膜内给药或静脉内给药。
这些组合物可以含有至少0.01％治疗活性化合物。组合物中活性组分用量符合剂量学要求。优选地，组合物的制备方式使非肠胃给药单位剂量中含有约0.01-1000mg活性化合物。
人药剂量通常为0.01-200mg/kg，对于静脉内给药，剂量通常为0.1-50mg/kg，以0.1-8mg/kg为佳。为了选择最适宜的剂量应该考虑给药途径、患者体重、总体健康状况、年龄和可能影响疗效的所有因素。
下列非限制性实施例用于描述本发明。
实施例1将4.0g分子量为2000D的聚(d，1-乳酸)和1.0g7，7-二苯基-4-(2-甲氧基苯基)-2-〔2-(2-甲氧苯基)-(S)-丙酰基〕-4-(3as，4s，7as)-全氢化异吲哚酚溶于100ml在水浴中被加热至45℃的乙酸乙酯中(溶液A)。在Ultraturrax的搅拌下将1.25g胆酸钠和1.75g卵磷脂E80分散于500ml水中以便得到可注射制剂(溶液B)。
溶液A在溶液B中借助Ultraturrax被预乳化1分钟。随后将该预制乳液导入Microfiuidizer110T型均化器中，在被加压至6巴并且被冷却至0℃的条件下连续通过该均化器20次。
将610ml乳液导入2升的圆底烧瓶中。借助旋转蒸发器在30℃真空(有微泄漏)下蒸除乙酸乙酯，历时约45分钟。回收450ml微粒悬浮液，加水使其体积达到500ml以便形成可注射制剂。
在0.5巴氮气压力下，依次在4个纤维素酯的膜Millipore(直径为45mm，参考孔隙率逐渐降低)上过滤悬浮液RAWP＝1.2μm，AAWP＝0.8μm，HAWP＝0.45μm和GSWP＝0.22μm。
过滤后的无菌悬浮液被分为2份。其中一份在5％(重/体积)葡萄糖存在下被冻干，另一份在5％(重/体积)蔗糖存在下被冻干。
于冻干前与为了得到可注射制剂用相同体积水溶解冻干液之后(在这两种情况下)，用仪器Brookhaven借助光散射测定的平均粒径约为70nm.
用7，7-二苯基-4-(2-甲氧基苯基)-2-〔2-(2-甲氧基苯基)-(S)-丙酰基〕-4-(3as，4s，7as)-全氢化异吲哚酚的过滤后最终浓度与初始理论浓度(2mg/ml)之间的比值表示的产率为95％。
于最后过滤(0.22μm)之前与之后悬浮液的光学密度(405nm)分别为2.20和2.10。
于最后过滤(0.22μm)之前与之后的7，7-二苯基-4-(2-甲氧基苯基)-2-〔2-(2-甲氧基苯基)-(S)-丙酰基〕-4-(3as，4s，7as)-全氢化异吲哚酚的浓度保持不变。
该化合物可以按照专利申请WO 93/21155所述方法制备。
实施例2按照实施例1操作，不同的是以4.0g由质量为30KD的聚(d，1-乳酸)与质量2KD的聚乙二醇形成的二嵌段共聚物(PLA-PEG)和1。0g7，7-二苯基-4-(2-甲氧基苯基)-2-〔2-(2-甲氧基苯基)-(S)-丙酰基〕-4-(3as，4s，7as)-全氢化异吲哚酚为原料，得到微粒悬浮液.
在0.5巴氮气压力下，依次在4个纤维素酯的膜Millipore(直径为45mm，参考孔隙率逐渐降低)上过滤悬浮液RAWP＝1.2μm，AAWP＝0.8μm，HAWP＝0.45μm和GSWP＝0.22μm。
过滤后的无菌悬浮液在5％p/v葡萄糖存在下被冻干。
于冻干前与为了得到可注射制剂用相同体积水溶解冻干液之后(在这两种情况下)，用仪器Brookhaven借助光散射测定的平均粒径约为75nm。
用7，7-二苯基-4-(2-甲氧基苯基)-2-〔2-(2-甲氧基苯基)-(S)-丙酰基〕-4-(3as，4s，7as)-全氢化异吲哚酚的过滤后最终浓度与初始理论浓度(2mg/ml)之间的比值表示的产率为98％。
于最后过滤(0.22μm)之前与之后悬浮液的光学密度(405nm)分别为2.7和2.6。
于最后过滤(0.22μm)之前与之后的7，7-二苯基-4-(2-甲氧基苯基)-2-〔2-(2-甲氧基苯基)-(S)-丙酰基〕-4-(3as，4s，7as)-全氢化异吲哚酚的浓度保持不变。
实施例3将160mg分子量为70000D的聚(d，1-乳酸)和40mg7，7-二苯基-4-(2-甲氧基苯基)-2-〔2-(2-甲氧苯基)-(S)-丙酰基〕-4-(3as，4s，7as)-全氢化异吲哚酚溶于4ml在水浴中被加热至45℃的乙酸乙酯中(溶液A)。在Ultraturrax的搅拌下将100mg胆酸钠和70mg卵磷脂E80分散于20ml水中以便得到可注射制剂(溶液B)。
溶液A在溶液B中借助Ultraturrax被预乳化1分钟。随后将该预制乳液导入Microfiuidizer110S型均化器中，在被加压至6巴并且被冷却至0℃的条件下连续循环3分钟。
将30ml乳液导入200ml的圆底烧瓶中。借助旋转蒸发器在30℃真空(有微泄漏)下蒸除乙酸乙酯，历时约45分钟。回收19ml微粒悬浮液，加水使其体积达到20ml以便形成可注射制剂。
依次在2个纤维素酯的膜Millipore(直径为25mm，参考孔隙率逐渐降低)上过滤悬浮液HAWP1.2μm，SLGS 0.22μm。
经过滤的无菌悬浮液被分为2份。其中一份在5％(重/体积)葡萄糖存在下被冻干，另一份在5％(重/体积)蔗糖存在下被冻干。
于冻干前与为了得到可注射制剂用相同体积水溶解冻干液之后(在这两种情况下)，用仪器Brookhaven借助光散射测定的平均粒径约为60nm。
于最后过滤(0.22μm)之前与之后悬浮液的光学密度(405nm)分别为1.29和1.14。
于最后过滤(0.22μm)之前与之后的7，7-二苯基-4-(2-甲氧基苯基)-2-〔2-(2-甲氧基苯基-(S)-丙酰基〕-4-(3as，4s，7as)-全氢化异吲哚酚的浓度保持不变。
实施例4将160mg分子量为70000D的聚(d，1-乳酸)和40mg7，7-二苯基-4-(2-甲氧基苯基)-2-〔2-(2-甲氧苯基)-(S)-丙酰基〕-4-(3as，4s，7as)-全氢化异吲哚酚溶于4ml在水浴中被加热至45℃的乙酸乙酯中(溶液A)。在Ultraturrax的搅拌下将50mg胆酸钠和70mg卵磷脂E80分散于20ml水中以便得到可注射制剂(溶液B)。
溶液A在溶液B中借助Ultraturrax被预乳化1分钟。随后将该预制乳液导入Microfluidizer110S型均化器中，在被加压至6巴并且被冷却至0℃的条件下连续循环3分钟。
将30ml乳液导入200ml的圆底烧瓶中。借助旋转蒸发器在30℃真空(有微泄漏)下蒸除乙酸乙酯，历时约45分钟.回收19ml微粒悬浮液，加水使其体积达到20ml以便形成可注射制剂。
依次在2个纤维素酯的膜Millipore(直径为25mm，参考孔隙率逐渐降低)上过滤悬浮液HAWP1.2μm，SLGS0.22μm。
经过滤的无菌悬浮液被分为2份。其中一份在5％(重/体积)葡萄糖存在下被冻干，另一份在5％(重/体积)蔗糖存在下被冻干。
于冻干前与为了得到可注射制剂用相同体积水溶解冻干液之后(在这两种情况下)，用仪器Brookhaven借助光散射测定的平均粒径约为70nm。
于最后过滤(0.22μm)之前与之后悬浮液的光学密度(405nm)分别为1.18和1.80。
于最后过滤(0.22μm)之前与之后的7，7-二苯基-4-(2-甲氧基苯基)-2-〔2-(2-甲氧基苯基)-(S)-丙酰基〕-4-(3as，4s，7as)-全氢化异吲哚酚的浓度保持不变。
实施例5将400mg由分子量为30KD的聚(d，1-乳酸)和分子量为2KD的聚乙二醇形成的二嵌段共聚物与100mg7，7-二苯基-4-(2-甲氧基苯基)-2-〔2-(2-甲氧苯基)-(S)-丙酰基〕-4-(3as，4s，7as)-全氢化异吲哚酚溶于10ml在水浴中被加热至45℃的乙酸乙酯中(溶液A)。在Ultraturrax的搅拌下将125mg胆酸钠和175g卵磷脂E80分散于50ml水中以便得到可注射制剂(溶液B)。
溶液A在溶液B中借助Ultraturrax被预乳化1分钟。随后将该预制乳液导入Microfiuidizer110S型均化器中，在被加压至6巴并且被冷却至0℃的条件下连续循环10分钟。
将60ml乳液导入200ml的圆底烧瓶中。借助旋转蒸发器在30℃真空(有微泄漏)下蒸除乙酸乙酯，历时约45分钟。回收45ml微粒悬浮液，加水使其体积达到50ml以便形成可注射制剂.
依次在2个纤维素酯的膜Millipore(直径为25mm，参考孔隙率逐渐降低)上过滤悬浮液HAWP1.2μm，SLGS0.22μm。
经过滤的无菌悬浮液在5％(重/体积)葡萄糖存在下被冻干。
于冻干前与为了得到可注射制剂用相同体积水溶解冻干液之后(在这两种情况下)，用仪器Brookhaven借助光散射测定的平均粒径约为60nm。
于最后过滤(0.22μm)之前与之后的光学密度(405nm)分别为0.87和0.81。
于最后过滤(0.22μm)之前与之后的7，7-二苯基-4-(2-甲氧基苯基)-2-〔2-(2-甲氧基苯基)-(S)-丙酰基〕-4-(3as，4s，7as)-全氢化异吲哚酚的浓度保持不变。
实施例6将300mg(15mg/ml理论值)由质量为30KD的聚(d，1-乳酸)与质量为2KD的聚乙二醇形成的二嵌段共聚物(PLA-PEG)和100mg(5mg/ml理论值)3-叔丁氧羰基氨基-2-羟基-3-苯基-(2R，3s)-丙酸4α，10β-二乙酸基-2α-苯甲酰氧-5β，20-环氧-1β-羟基-7β，8β-亚甲基-9-氧-19-降-11-紫杉烯-13α-酯溶于8ml乙酸乙酯(溶液A)。将70mg卵磷脂E80和50mg胆酸钠分散于20ml加有葡萄糖的5％(P/V)溶液中(溶液B)。溶液A在溶液B中通过Ultra-turrax被乳化，随后将此预乳液导入Microfcuidizer 110S型均化器中，于10℃下历时3分钟。回收的乳液体积约为30ml(30g)。借助旋转蒸发器减压(100mm Hg)蒸除乙酸乙酯直至悬浮液体积约为17ml(17g)为止。用串联的孔隙率逐渐降低的二个滤器(1.2μm Minisart NML＋0.22μmSLGS)过滤悬浮液。在相同条件下制备的相同的两种悬浮液被合并在同一瓶中。过滤后得到无菌悬浮液。
借助仪器Brookhaven通过光散射测定的平均粒径约为75nm。
悬浮液的光学密度(405nm)于最后过滤(0.22μm)之前或之后均为7.2。
以3-叔丁氧羰基氨基-2-羟基-3-苯基-(2R，3S)-丙酸4α，10β-二乙酸基-2α-苯甲酰氧基-5β，20-环氧-1β-羟基-7β，8β-亚甲基-9-氧-19-降-11-紫杉烯-13α-酯于过滤之后的最终浓度与初始理论浓度(5mg/ml)之比表示的产率为94％。
根据3-叔丁氧羰基氨基-2-羟基-3-苯基-(2R，3S)-丙酸4α，10β-二乙酸基-2α-苯甲酰氧基-5β，20-环氧-1β-羟基-7β，8β-亚甲基-9-氧-19-降-11-紫杉烯-13α-酯的产率计算的PLA-PEG浓度为14.1mg/ml。
可按照专利申请WO94/13654制备3-叔丁氧羰基氨基-2-羟基-3-苯基-(2R，3S)-丙酸4α，10β-二乙酸基-2α-苯甲酰氧基-5β，20-环氧-1β-羟基-7β，8β-亚甲基-9-氧-19-降-11-紫杉烯-13α-酯。
权利要求
1.在无菌条件下稳定的滤过性微粒，其特征在于含有至少一种在磷脂与胆汁酸盐溶液中被乳化的憎水性、非水溶性和非水分散性聚合物或共聚物。
2.按照权利要求1的处于无菌条件下的稳定的滤过性微粒，其特征在于一种活性组分被导入聚合物或共聚物中。
3.按照权利要求1的处于无菌条件下的稳定的滤过性微粒，其特征在于憎水、非水溶性和非水分散性聚合物或共聚物选自生物相容性和生物降解性聚合物。
4.按照权利要求1或2的处于无菌条件下的稳定的滤过性微粒，其特征在于其平均直径为其中95％小于100nm。
5.权利要求1-4中任一项的微粒的制备方法，其特征在于制备磷脂与胆汁酸盐的水溶液或水分散体，向其中加入含有憎水性、非水溶性和非水分散性聚合物或共聚物以及在必要时含活性组分的非混溶性有机相，随后进行预乳化并且将该混合物均化，蒸除有机溶剂，视需要而定过滤和冻干所得到的悬浮液。
6.权利要求1-4中任一项的稳定微粒在经过无菌过滤后制备无菌组合物方面的用途。
7.按照权利要求1-4中任一项的稳定微粒，呈无菌特性，其特征在于，它经过无菌过滤操作。
8.按照权利要求7的稳定微粒，其特征在于无菌过滤以孔隙率逐渐降低的阶式过滤器进行无菌过滤。
9.按照权利要求1-4、7或8中任一项的处于无菌条件下的稳定的滤过性微粒，其特征在于它们被冻干。
10.按照权利要求1-4或7～9中任一项的处于无菌条件下的稳定的滤过性微粒，其特征在于它们经过无菌过滤，冻干和再次被溶解。
11.药物组合物，其中含有视需要而定与一种或多种相容的和药物可接受的赋形剂或助剂结合使用的权利要求1-4或7-10的微粒。
全文摘要
在无菌条件下稳定的和可过滤的微粒，其特征在于，其中含有至少一种在磷脂与胆汁酸盐溶液中被乳化的憎水性、非水溶性和非分水分散性聚合物或共聚物(以及视需要而存在的活性组分)。
文档编号B01F17/00GK1151114SQ9519373
公开日1997年6月4日 申请日期1995年6月20日 优先权日1994年6月22日
发明者M·拉伯里, J·瓦库斯, T·维勒施艾, M-C·比斯雷 申请人:罗纳-布朗克罗莱尔股份有限公司