专利名称：斑马鱼胚胎模型检测抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子活性的方法及 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用斑马鱼胚胎模型检测抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子活性的方法及其应用，尤其是抗新生血管生成蛋白因子活性的检测方法及其应用。
背景技术：
恶性肿瘤是危害人类健康的主要疾病，因而也是当前全球研究的热点。目前常用的抗肿瘤药物因其专一性差，多具有很强的毒副作用，而且至今尚没有得到一种理想的药物。以新生血管生成为靶点的抗肿瘤药物具有较好的专一性，近年来受到广泛关注，人们发现抑制新生血管生成过程可以有效抑制肿瘤生长，许多新生血管生成抑制剂在多种动物模型中表现出强烈的抗肿瘤活性。与常用的细胞毒性药物相比，由于内皮细胞具有遗传学的稳定性，以其作为生物靶点的抗肿瘤药物不易产生抗药性，其意义特别重大。
目前用于检测血管形成的方法由于太复杂而不利于进行药物筛选，内皮细胞增殖与迁移试验，不仅试验方法复杂，且为体外试验；鸡胚绒毛尿囊膜新生血管生成试验，兔角膜新生血管生成试验和小鼠肿瘤模型等，虽为体内试验，但是试验周期长、方法较繁琐。采用小鼠肿瘤模型与斑马鱼(Brachydanio rerio)胚胎模型用抗新生血管生成药物SU5416进行对比试验前者试验周期为4周，后者只需2-3天；前者血管抑制率为42％后者则为40％；每个样品组需要药物的体积和药物浓度前者分别为1800-3600ul和12mg/ml，后者分别为100ul和80ug/ml；前者给药频率连续18天，每天都需给药，后者仅需给药一次；前者为注射给药，后者直接加到孵化液；前者的一组试验动物数量一般为6只，后者可达36个。这一新型的活性检测模型在此领域中的应用，必将大大提高抗新生血管生成药物筛选的速度。对阐明抗新生血管生成因子的抗肿瘤机制，发展新型的抗肿瘤药物都具有十分重要的意义。
本发明首次应用斑马鱼胚胎模型检测抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子的活性，用来筛选抗新生血管生成活性蛋白因子或促新生血管生成活性蛋白因子。该模型比以往的检测模型更简单、经济、准确、直观、周期短，可以应用于所有抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子的筛选和检测，以及进一步的机理研究。由此，为分离纯化、鉴定新型的抗肿瘤药物提供了一条新的简易的检测模型。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型、具有较好的重复性、直观性、试验周期短、且检测过程简便的抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子活性检测模型方法。
本发明的一个方面，涉及一种用于检测待测蛋白质组分的抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子活性的方法，包括如下步骤1)随机选取一定数量的孵化22小时的斑马鱼胚胎，去掉所述胚胎的绒毛膜；2)向步骤1)中的所述斑马鱼胚胎孵化液加入待测蛋白质组分，在恒温下培养一段时间后，观察斑马鱼胚胎的血管形成情况；3)判断所述待测蛋白质组分是否具有抗新生血管生成活性或促新生血管生成活性。
为了便于定量化比较所述待测蛋白质组分的活性，本发明的另一方面，涉及一种用于检测待测蛋白质组分的抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子活性的方法，包括如下步骤1)随机选取一定数量的孵化22小时的斑马鱼胚胎，去掉所述胚胎的绒毛膜；2)步骤1)中的斑马鱼胚胎孵化液中加入待测蛋白质组分，在恒温下培养一段时间后，观察斑马鱼胚胎的新生血管生成情况；3)待胚胎发育到一定时间后进行血管染色；4)判断所述待测蛋白质组分是否具有抗新生血管生成活性或促新生血管生成活性。
本领域普通技术人员知晓，经过染色后可以在立体显微镜下观察斑马鱼胚胎血管形成情况。
在本发明的一个具体实施方案中，所述血管染色在斑马鱼胚胎发育的第三天进行。在本发明的一个具体实施方案中，所述血管染色包括如下步骤将胚胎浸在4％多聚甲醛2小时，在PBS缓冲液中洗2次，然后依次在含25、50、75和100％甲醇的PBT中脱水并浸润，在NTMT中平衡后，加入染色液；胚胎中的血管都被标记后，加PBST终止反应。将染色后的斑马鱼胚胎放在脱色液中除去色素细胞的内源黑色素，使染色的血管清晰可见。
本领域普通技术人员知晓，本发明所述方法适于检测的待测蛋白质组分可以为任一可能具有抗新生血管生成活性或者促新生血管生成活性的蛋白质、多肽或糖蛋白。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为取数对野生的斑马鱼交配，按照(Westerfield M.The Zebrafish BookA Guide for theLaboratory Use of Zebrafish.Eugene，OregonThe University of Oregon Press，1993.)方法孵化胚胎，在孵化后20-24小时，优选为22小时，按照(G.N.Serbedzija，E.Flynn，C.E.Willett.ZebrafishangiogenesisA new model for drug screening.Angiogenesis 3353-359，1999.)方法去掉斑马鱼胚胎绒毛膜(去除100％)，在孵化液中加入待测蛋白质组分，27-29℃下，持续培养48小时后观察斑马鱼胚胎的血管形成(对于胚胎血管形成的变化，最好采用定性或定量的比较标准，否则无法判定待测物质是否影响血管形成以及影响程度的大小)，以检验该蛋白质组分对斑马鱼胚胎新生血管生成的影响。
例如，在48小时后观察到出现斑马鱼胚胎的肠下血管完全不存在或侧面、腹面的血管网消失的待测物质，认为具有抗新生血管生成活性；在48小时后观察到出现血管网包围区域面积的增大或血管网内部血管大小长短的增加的待测物质，判定具有促新生血管生成活性。
为了便于定量比较所加入的待测物质的活性，在本发明的技术方案中，还包括如下的染色方法具体的，将27-29℃孵化液中发育到72小时的斑马鱼胚胎，在室温条件下，浸在4％多聚甲醛的固定液作用2小时，将斑马鱼胚胎固定，使斑马鱼胚胎保持在发育72小时的天然状态，用磷酸盐缓冲液(PBS，NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4(12H2O)1.44g，KH2PO40.24g，加蒸馏水到1000ml，pH7.0)把胚胎表面残留的固定液冲洗干净。然后将固定并冲洗好的斑马鱼胚胎依次在不同浓度梯度的脱水剂中逐次脱水，从而提高斑马鱼胚胎的渗透性以利于染色液进入胚胎内。
将经过上述处理的胚胎放在平衡液(0.1M三羟甲基氨基甲烷盐酸，pH 9.5，50mM氯化镁，0.1M氯化钠，0.1％吐温-20)中，使整个胚胎的通透性处于平衡状态后，加入染色液(蓝四氮唑75mg/ml，5-溴-4-氯-3吲哚磷酸盐50mg/ml)，染色液中的显色剂5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐和蓝四氮唑使斑马鱼胚胎血管内的碱性磷酸酶发生显色反应，形成紫红色沉淀，从而标记斑马鱼胚胎的血管。
待胚胎中的血管都被标记后，加入终止液(PBST，含0.05％tween-20的磷酸缓冲盐溶液)终止染色反应；然后将胚胎放在脱色液(含5％甲酰胺和10％过氧化氢的磷酸缓冲盐溶液)中除去色素细胞的内源黑色素，以便使染色的细胞清晰可见；在立体显微镜下观察胚胎并采集和保存图像。
采集和保存图像后，采用专门的图像处理软件，计算出不同情况下的各个斑马鱼胚胎新生血管生成量后进行比较。正常情况下，在不加入抗新生血管生成蛋白质组分或促新生血管生成蛋白质组分的斑马鱼胚胎中，其肠下静脉形成于卵黄的背面，篮状血管网，自体节腹面边缘开始越过卵黄延伸50-100μm；而抗新生血管生成效应的表现是斑马鱼胚胎的肠下血管完全不存在或侧面、腹面的血管网消失；促进新生血管生成的效应表现为(a)血管自体节开始的延伸超过150μm；或(b)血管网包围区域的面积的增大；或(c)血管网内部血管粗细长短的增加。另外，正常血管直径小于10μm，测量血管直径也可得到比较。
本发明具有如下优点1.材料易得。斑马鱼(Brachydanio rerio)属鲤科，淡水鱼，产地为印度和孟加拉国，繁殖速度较快，产卵量大，极易饲养，经济实用，是一种理想的脊椎动物模式生物。
2.待测蛋白质组分给药方式简单。可将待测蛋白质组分直接加至胚胎生活的孵化液中，在96孔板中只需加入100ul的水体积即可，蛋白质组分的用量少。
3.检测方法简便。收集胚胎后，加入待测蛋白质组分，培养2天后进行血管染色并观察，操作简便，所需周期短。
4.成本低廉。所用试剂为磷酸盐、多聚甲醛、甲醇、双氧水等，且用量少，检测成本低廉，由此可以降低抗新生血管生成蛋白因子此类药物的价格。
5.应用前景好。本发明斑马鱼胚胎模型在检测抗新生血管生成蛋白质因子或促新生血管生成蛋白质因子活性方面的应用，必将大大提高抗新生血管生成药物筛选的速度。对阐明抗新生血管生成因子的抗肿瘤机制，发展新型的抗肿瘤药物都具有十分重要的意义。
具体实施例方式
实施例1源自青鲨软骨蛋白质组分1的抗新生血管生成活性的检测1.胚胎采集 早晨取15对野生斑马鱼，自由组合分成5组交配孵化胚胎，采集1200个斑马鱼胚胎，吸出沉淀物质，放于孵化液(蒸馏水)中，27℃培养箱保存22小时，应及时取出白色胚胎(已死的)以防止水质变坏；在此期间胚胎可通过卵黄取得养料，不需要其他的养料。
2.蛋白质组分1的准备 以青鲨软骨为原料，通过盐酸胍抽提、丙酮分级沉淀、超滤、凝胶过滤层析等技术分离纯化得到待测的鲨鱼软骨蛋白质组分1。
3.加入蛋白质组分1 待斑马鱼胚胎发育到22小时，用1mg/ml的胰蛋白酶消化斑马鱼胚胎的绒毛膜，10分钟后，绒毛膜开始脱落，此时用大量的水反复冲洗3次，去除所有的绒毛膜，得到健康的斑马鱼胚胎。将青鲨软骨蛋白质组分1直接溶解在斑马鱼胚胎的孵化液中。随机选取健康的288个胚胎分组，吸净孵化液，加入含不同浓度蛋白质组分1的孵化液于96孔培养板中，每一孔容量100ul，包括3个胚胎，为一小组。详细分组情况及待测蛋白质组分加入量如表1所示表1试验分组情况及待测蛋白质组分1加入量
4.视觉鉴定 加入待测青鲨软骨蛋白质组分1后，将胚胎分开置于96孔板的微孔中，27℃下孵化到受精后72小时，每组取一半胚胎直接观察，鉴定存活状况，形态以及循环系统是否有缺陷或异常，其中循环系统的鉴定可通过比较处理组和对照组血细胞运动状况及流速来判断。
经48小时的处理，斑马鱼胚胎可观察到以下现象表2青鲨软骨蛋白质组分1的抗新生血管生成作用
5.血管染色 在视觉鉴定的同时，每组取另一半胚胎进行血管染色。首先将胚胎置于4％多聚甲醛中室温处理2小时；而后在磷酸盐缓冲液(PBS)中冲洗两次，把胚胎表面残留的固定液冲洗干净；依次浸于甲醇和PBT(含有0.1％Triton X-100和5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液)溶液的混合液中渗透脱水并随后逐渐浸润；混合液的成分如下表3所示表3甲醇和PBT溶液的配方
接着将胚胎置于NTMT(0.1M三羟甲基氨基甲烷盐酸，pH 9.5，50mM氯化镁，0.1M氯化钠，0.1％吐温-20)缓冲液中，室温处理30分钟，使胚胎平衡后染色；每毫升加入5μl75mg/ml蓝四氮唑和4μl 50mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐显色剂染色20分钟；加入终止液PBST(含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液)，染色反应停止，将胚胎浸入脱色液(含5％甲醛胺和10％H2O2的PBS溶液)中30分钟，除去色素细胞的内源黑色素，使已染色的细胞清晰可见；然后在立体显微镜下观察胚胎，收集图像并拍照。
6.测定血管变化利用图像分析软件NIH image(NIH image是由Wayne Rasband编写的Mac图像分析应用程序，可对图像面积、平均密度、重心及用户定义的多边形区域的分析，自动进行点的分析、测定路径长度和角度)测定肠下静脉长度，进行血管形成影响作用的判断。
通过以上斑马鱼胚胎模型检测平台，可以得出，我们所分离纯化的青鲨软骨蛋白质组分1具有抑制斑马鱼胚胎新生血管生成的活性，从而证明其是一种具有抗肿瘤活性的蛋白质组分，有待于进一步的分离纯化、理化性质研究和开发应用。
实施例2源自青鲨软骨的蛋白质组分2的抗新生血管生成活性的检测1.胚胎采集 早晨取12对野生斑马鱼，自由组合分成4组交配孵化胚胎，采集1000个斑马鱼胚胎，吸出沉淀物质，放于孵化液中，29℃培养箱保存22小时，利用形态和发育学标准来随时鉴定死活；已死的胚胎呈白色，应及时取出以防止水质变坏。
2.蛋白质组分2的准备 以青鲨软骨为原料，通过盐酸胍抽提、丙酮分级沉淀、超滤和凝胶过滤层析等技术分离纯化得到纯的蛋白质组分2，分子量为1550道尔顿。
3.加入蛋白质组分2 待斑马鱼胚胎发育到22小时，用1mg/ml的胰蛋白酶消化斑马鱼胚胎的绒毛膜，10分钟后，绒毛膜开始脱落，此时用大量的水反复冲洗3次，得到健康的斑马鱼胚胎。将提纯的鲨鱼软骨蛋白质组分2直接加入到斑马鱼胚胎的孵化液中。随机选取健康的288个胚胎分组，吸净孵化液，加入蛋白质组分2的孵化液于96孔培养板中，每一孔容量100ul，包括3个胚胎，为一小组。分组情况及待测蛋白质组分2加入量与前表1相同。
4.视觉鉴定 加入蛋白质组分2后，将胚胎分开置于96孔培养板的微孔中，29℃下孵化到受精后72小时，每组取一半胚胎直接观察，鉴定存活状况，形态以及循环系统是否有缺陷或异常，其中循环系统的鉴定可通过比较处理组和对照组血细胞运动状况及流速来判断。
经48小时的处理，斑马鱼胚胎可观察到以下现象，如表4所示
表4青鲨软骨蛋白质组分2的抗新生血管生成作用
5.血管染色 在视觉鉴定的同时，每组取另一半胚胎进行血管染色。首先将胚胎置于4％多聚甲醛中室温处理2小时；而后在磷酸盐缓冲液(PBS)中冲洗两次，把胚胎表面残留的固定液冲洗干净；依次浸于甲醇和PBT溶液的混合液中渗透脱水并随后逐渐浸润。混合液的成分如前表1所示。
接着将胚胎置于NTMT缓冲液中，室温处理30分钟，使胚胎平衡后染色；每毫升加入5μl75mg/ml蓝四氮唑和4μl 50mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐显色剂染色20分钟；加入终止液PBST，染色反应停止，将胚胎浸入脱色液中30分钟，除去色素细胞的内源黑色素，使已染色的血管清晰可见；然后在立体显微镜下观察胚胎，收集图像并拍照。
6.测定血管变化利用图像分析软件NIH image测定肠下静脉长度，进行血管形成影响作用的判断。
通过以上斑马鱼胚胎模型检测平台，可以得出，我们所分离纯化的分子量为1550Da蛋白质组分，具有抑制斑马鱼胚胎新生血管生成的活性，从而证明其是一种纯的具有抗肿瘤活性的蛋白质，可进一步研究此蛋白质的其他活性，测定序列以及克隆表达等。
权利要求
1.一种抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子活性检测方法，包括如下步骤1)向孵化后22小时的斑马鱼胚胎孵化液中加入待测蛋白质组分，在恒温下培养一段时间后，观察斑马鱼胚胎的血管发育；2)判断所述待测蛋白质组分是否具有抗新生血管生成活性或促新生血管生成活性。
2.权利要求1所述的方法，其中在所述步骤1)还包括如下步骤待胚胎发育到一定时间后进行血管染色，在立体显微镜下观察斑马鱼胚胎血管发育情况；
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述步骤1)中，在加入待测蛋白质组分之前还包括去掉斑马鱼胚胎的绒毛膜的步骤。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所加入的待测蛋白质组分可以为任一可能具有抗新生血管生成活性或者促新生血管生成活性的蛋白质、多肽或糖蛋白。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述步骤1)中加入待测蛋白质组分后，在27-29℃持续培养48小时。
6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于在斑马鱼胚胎发育的第三天进行血管染色。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于将胚胎浸在4％多聚甲醛2小时，在PBS缓冲液中洗2次，然后依次在含25、50、75和100％甲醇的PBT中脱水并浸润，在NTMT中平衡后，加入染色液；胚胎中的血管都被标记后，加PBST终止反应。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于将染色后的斑马鱼胚胎放在脱色液中除去色素细胞的内源黑色素，使染色的细胞清晰可见。
9.权利要求1所述的方法，其中表现出斑马鱼胚胎的肠下血管完全不存在或侧面、腹面的血管网消失的待测物质，认为具有抗新生血管生成活性；表现出a)血管自体节开始的延伸超过150μm；或(b)血管网包围区域面积的增大；或(c)血管网内部血管粗细长短的增加的待测物质，认为具有促新生血管生成活性。
全文摘要
本发明涉及一种新型抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子相关活性检测方法及其应用，具体地说就是通过斑马鱼胚胎模型方法检测抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子相关活性，以及该方法的应用。斑马鱼胚胎孵化后，直接加入抗新生血管生成蛋白质组分或促新生血管生成蛋白质组分，在恒温下培养一段时间后，观察斑马鱼胚胎的发育情况；待胚胎发育到一定时间后进行血管染色，在立体显微镜下观察斑马鱼胚胎血管形成情况，采集和保存图像。本发明具有材料易得，蛋白质组分给药方式简单，检测方法简便，成本低，应用性好等特点。
文档编号A61K49/00GK1866025SQ20061004453
公开日2006年11月22日 申请日期2006年6月1日 优先权日2006年6月1日
发明者林秀坤, 郑兰红, 杨少丽, 牛荣丽, 胡朝欣 申请人:中国科学院海洋研究所