山核桃叶总黄酮在tbbpa诱导心脏发育毒性的保护作用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了环境污染物TBBPA所诱导毒害的研究和评价方法及一种中药有效成分用于防护环境污染物TBBPA所致病害方面的新应用，尤其涉及山核桃叶总黄酮在TBBPA所诱导毒害方面的保护作用。本发明深入解释TBBPA暴露斑马鱼胚胎后所致毒害的毒性机制。显示山核桃叶总黄酮对TBBPA诱导的斑马鱼胚胎发育毒性的形态学保护，可对TBBPA诱导斑马鱼胚胎体内ROS水平升高，促凋亡基因的表达上调及凋亡抑制基因的表达下调分别具有一定的抗氧化和抑制凋亡作用。山核桃叶总黄酮对TBBPA诱导斑马鱼胚胎发育毒性的保护作用，既有助于探讨中药有效成分的药用价值和作用机理，也对日益引起重视的环境污染物危害防治提供了新路径。
【专利说明】山核桃叶总黄酮在TBBPA诱导心脏发育毒性的保护作用
【技术领域】:
[0001]本发明涉及中药有效成分在环境污染物致病方面的新应用，尤其是山核桃叶总黄酮在TBBPA诱导毒害方面的保护作用。
[0002]背景研究:
[0003]近年来，随着合成材料工业的迅速发展，高分子材料广泛应用于工业、农业、国防等领域，与人们的生活密切相关。高分子材料在给生活带来便利的同时也带来许多安全隐患，比如易燃性，这就迫使人们对各种合成材料提出了阻燃的要求。研究发现，通过添加阻燃剂或者通过化学反应在高分子材料中引入阻燃基团，能有效提高材料的抗燃性。溴代阻燃剂(BFRs)是合成高分子材料的重要助剂之一，其功能是使合成材料具有难燃性、自熄性和消烟性，其工业化生产和应用始于60年代的美国，此后阻燃剂的用量随着社会的现代化发展而持续增长。
[0004]四溴双酚A (Tetrabromo-bisphenol A, TBBPA)是目前全球生产量和使用量最大的溴代阻燃剂(BRFs)之一，被广泛应用于印刷线路板、丙烯腈-苯乙烯-丁二烯共聚物(ABS)、耐冲击性聚苯乙烯(HIPS)等多种材料的合成中，以提高阻燃性。全球TBBPA年产量已超过170000吨，其中76%在亚洲，我国年产量约为18000吨，约为全球的1/10左右，近些年，它在各种环境介质如沉积物、土壤、水体、大气及生物体中被检测到，德国河流水体TBBPA浓度范围为0.2-20.4ng/L。湖泊是陆源TBBPA等有机污染物重要的富集库，我国巢湖、青岛和珠江三角洲近岸海域的水体、沉积物和鱼体中也均已检出TBBPA的存在。TBBPA在鱼类体内检出含量可高达245ng/g，巢湖沉积物和水体中浓度为分别为21.96-481.80 μ g/kg和0-4.77 μ g/L,为全球已有报道的最高值；最新数据显示，Hongfeng等检测到珠江三角洲表层沉积物中TBBPA含量为干重0.03-31.6ng/g,且结合在沉积物中的TBBPA含量有上升趋势 。
[0005]就生态毒理效应而言，TBBPA对哺乳动物的免疫毒性、细胞和神经毒性、内分泌干扰效应等研究方面已取得一定进展，但对水生生物毒理学的研究开展较少。TBBPA对鱼类具有强毒性，同时具有高亲脂性、良好热稳定性及一定溶解性，使其容易通过水环境介质沿食物链累积并向上传递，最终对鱼类及人体具有潜在毒害威胁，考虑到我国水体TBBPA环境暴露水平较高的特点，鱼类毒理学的研究日益成为关注的重点。然而，TBBPA对鱼类的毒性仍然数据不足，这也正是欧盟未能同时提供TBBPA生态风险评估报告的重要原因。因此当前迫切需要加强TBBPA对鱼类等水生动物的毒理学研究，以对其生态风险做出准确和全面的评估。
[0006]斑马鱼(Danio rerio)是常见的暖水性(21_32°C )观赏鱼，鲤科，由于其常年产卵，鱼卵易收集，而且小规模饲养技术简单，20世纪90年代初开始，被用于有机污染物急、慢性毒性的检测。斑马鱼胚胎发育技术具有材料方便易得、操作简单、可重复性及可靠性较高等优点，而且与传统的鱼类急性毒性实验相比，成本低、影响因素少、灵敏度更高、毒性终点观察项多，并且各个发育阶段可直接在显微镜下观察。近几年，TBBPA对斑马鱼的毒性作用研究逐渐成为一个研究热点，相关毒性机理方面的研究也同时开展，国内有关TBBPA对斑马鱼甲状腺分泌干扰作用，及国外有关TBBPA对斑马鱼胚胎发育性别失调，神经毒性分泌等方向弓丨起极大关注。然而至今，分子和基因水平的毒性机理研究较少。
[0007]山核桃(Cathay hickory cathaensis sarg)又名“小核桃”,是一种落叶乔木，是我国特有的名优干果和木本油料作物，约有20个种，是国家3级保护的濒危植物。研究表明，多食干果可以预防心血管疾病的发生。目前国内对山核桃的植物形态分类、栽培、山核桃仁营养价值等的研究较多，但对山核桃的副产品如果壳、叶、外皮等研究报道较少，而到山核桃果仁、外果皮及山核桃叶均具有不同的药用价值。山核桃果仁中富含不饱和脂肪酸和高级醇，具有润肤、降低胆固醇和疏通血管等作用。作为一种健脑益肾的优质保健食品，山核桃果仁还具有滋润、补气、养血、化痰止咳的功效，其果皮具有抑菌、抗癌等功效。在山核桃叶的药用功效研究中发现，核桃叶中含有大量的黄酮类化合物、萜类化合物及胡萝卜素等，其中山核桃叶总黄酮是将山核桃叶进行初步提取分离得到的多种黄酮类物质，山核桃叶总黄酮类化合物的抗氧化作用的研究较多。其中分离所得2’，6’ - 二羟基-4’ -甲氧基查耳酮可抑制平滑肌细胞增殖及迁移引起的血管管腔狭窄，减轻血管炎症反应，对动脉粥样硬化性心脏病等心血管疾病的发生具有防治作用。目前关于山核桃叶的活性成分以及其药理作用报道仍很少，有待于进一步研究。
[0008]目前极少有关于中药有效成分对环境污染物毒性效应的保护作用研究。本发明人深入研究了山核桃叶总黄酮对TBBPA诱导斑马鱼胚胎体内ROS水平升高，促凋亡基因的表达上调及凋亡抑制基因的表达下调的保护作用，一方面有助于探讨中药有效成分的药用价值和作用机理，另一方面也对日益引起重视的环境污染物危害防治提供新的路径。
【发明内容】
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[0009]本发明的目的在于提供山核桃叶总黄酮的一种新用途，具体即山核桃叶总黄酮在环境污染物TBBPA诱导毒害方面的保护作用。本发明人研究发现，山核桃叶总黄酮表现出对TBBPA诱导的斑马鱼胚胎发育毒性的形态学保护，其中山核桃叶总黄酮对TBBPA诱导斑马鱼胚胎体内ROS水平升高，促凋亡基因的表达上调及凋亡抑制基因的表达下调分别具有一定的抗氧化和抑制凋亡作用。`
[0010]在本发明的一个方面，本发明提供一种山核桃叶总黄酮在制备防治环境污染物所致水生生物病害方面的药物应用。
[0011]在如上所述的本发明的应用中,其中所述水生生物为斑马鱼。
[0012]在如上所述的本发明的应用中，其中所述山核桃叶总黄酮的使用浓度为1.0mg/L。
[0013]在如上所述的本发明的应用中，其中所述山核桃叶总黄酮具有降低TBBPA所致胚胎发育形态异常的作用。
[0014]在如上所述的本发明的应用中，其中所述山核桃叶总黄酮具有抑制TBBPA所致胚胎ROS活性升高的作用。
[0015]在如上所述的本发明的应用中，其中所述山核桃叶总黄酮对TBBPA诱导的斑马鱼胚胎发育过程中P53基因表达上调和Bcl-2基因表达下调具有明显的抑制作用。
[0016]在本发明的另一个方面，本发明提供一种山核桃叶总黄酮在制备降低TBBPA所致水生生物胚胎发育形态异常的药物应用。
[0017]在如上所述的本发明的应用中,其中所述水生生物为斑马鱼。[0018]在如上所述的本发明的应用中，其中所述山核桃叶总黄酮的使用浓度为1.0mg/L。
[0019]在本发明的又一个方面，本发明提供一种山核桃叶总黄酮抑制TBBPA所致胚胎ROS活性升高的药物应用。
[0020]在如上所述的本发明的应用中，其中所述水生生物为斑马鱼。
[0021]在如上所述的本发明的应用中，其中所述山核桃叶总黄酮的使用浓度为1.0mg/L。
[0022]在本发明的再又一个方面，本发明提供一种山核桃叶总黄酮抑制TBBPA诱导的斑马鱼胚胎发育过程中P53表达上调和Bcl-2表达下调的药物应用。
[0023]在如上所述的本发明的应用中，其中所述水生生物为斑马鱼。
[0024]在如上所述的本发明的应用中，其中所述山核桃叶总黄酮的使用浓度为1.0mg/L。
[0025]本发明具有如下有益效果:
[0026]第一，本发明通过对不同浓度的TBBPA暴露斑马鱼胚胎后的形态学指标测试，毒性靶器官探寻，凋亡及凋亡机制的初步探讨，尝试从个体、器官、酶学及分子水平层层深入解释其毒性机制，特别是对相关基因异常表达的检测，将有利于系统阐释毒性机制，甚至预测污染物潜在的毒性效应。更为重要的是，分子水平的生化指标能够标识低水平接触环境毒物后的生物效应，敏锐反映正常和应激状态下的变化，还将有助于发现新的生物标志物，建立起更加灵敏高效的安全性评价方法。
[0027]第二，本发明有关山核桃叶总黄酮对TBBPA诱导斑马鱼胚胎体内ROS水平升高，促凋亡基因的表达上调及凋亡抑制基因的表达下调的保护作用的研究，一方面有助于探讨中药有效成分的药用价值和作用机理，另一方面也对日益引起重视的环境污染物危害防治提供新的路径。
[0028]第三，本发明显示，山核桃叶总黄酮对TBBPA诱导斑马鱼胚胎体内ROS水平升高、促凋亡基因的表达上调及凋亡抑制基因的表达下调分别具有一定的抗氧化和抑制凋亡作用。
【专利附图】
【附图说明】:
[0029]图1斑马鱼胚胎暴露于不同浓度TBBPA后各形态学指标观测结果；各指标与空白对照组比较，one-way ANOVA 分析，*ρ〈0.05;**ρ<0.01;***ρ<0.001 ；
[0030]图2斑马鱼幼体暴露于TBBPA 96h后卵凝结、心包水肿、畸形及AO染色观测结果；其中，A示24h发育正常受精卵；B示卵凝结导致死亡；C示48h正常卵；D示48h心包水肿；E示畸形；F-J示分别为空白对照及从低到高不同浓度TBBPA暴露96h后的AO染色结果；
[0031]图3斑马鱼胚胎暴露于不同浓度TBBPA后琼脂糖凝胶电泳检测DNA ladder凋亡结果;
[0032]图4 ROS活性标准曲线与回归方程；
[0033]图5斑马鱼胚胎暴露于各浓度TBBPA 96h后所测ROS水平结果；各指标与空白对照组比较，one-way ANOVA 分析，*ρ〈0.05;**ρ〈0.01 ；
[0034]图6 PCR熔解曲线观测；
[0035]图7 TBBPA暴露96h后斑马鱼胚胎凋亡相关基因P53，Bax, Caspase9和Bcl-2的表达水平检测结果；各指标与空白对照组比较，one-way ANOVA分析，*ρ〈0.05;**ρ〈0.01;***ρ〈0.001 ；[0036]图8 Caspase 9酶活性测定标准曲线与回归方程；
[0037]图9斑马鱼胚胎暴露于TBBPA 96h后Caspase酶活性水平测定结果；各指标与空白对照组比较，one-way ANOVA分析，*p<0.05 ；
[0038]图10山核桃叶总黄酮提取物的HPLC检测结果；
[0039]图11山核桃叶总黄酮保护作用下各实验组斑马鱼胚胎的死亡率、畸形率和孵化率观测结果；0ne-Way ANOVA分析，各指标与空白对照组比较显著性差异用星号表示，T+S组与T组结果比较显著性差异用井号表示，*ρ〈0.05 ；**p<0.01 ;***ρ〈0.001 ；#ρ<0.05 ；##ρ<0.01 ；###ρ<0.001 ；
[0040]图12 ROS活性标准曲线与回归方程；
[0041]图13山核桃叶总黄酮保护作用下各实验组斑马鱼胚胎ROS水平；one-way ANOVA分析，各组与空白对照组比较显著性差异用星号表示，T+S组与T组结果比较显著性差异用井号表示，*Ρ〈0.05 ;**ρ〈0.01 ;***ρ〈0.001 ；#ρ<0.05 ；##ρ<0.01 ；###ρ<0.001 ；
[0042]图14山核桃叶总黄酮保护作用下各实验组斑马鱼胚胎Ρ53表达水平结果；one-way ANOVA分析，各组与空白对照组比较显著性差异用星号表示，T+S组与T组结果比较显著性差异用井号表示，*Ρ〈0.05 ;**ρ〈0.01 ;***ρ〈0.001 ；#ρ<0.05 ；##ρ<0.01 ；###ρ<0.001 ；
[0043]图15山核桃叶总黄酮保护作用下各实验组斑马鱼胚胎Bcl-2表达水平结果；one-way ANOVA分析，各组与空白对照组比较显著性差异用星号表示，T+S组与T组结果比较显著性差异用井号表示，*Ρ〈0.05 ;**ρ〈0.01 ;***ρ〈0.001 ；#ρ<0.05 ；##ρ<0.01 ；###ρ<0.001。
【具体实施方式】
[0044]为了更好的理解本发明的实质，下面以非限制性的具体实施例的方式进一步详细说明本发明。但并非以此意图限制本发明的保护范围。即本发明并不限于这些实施例。
[0045]实施例1 TBBPA诱导斑马鱼胚胎心脏发育毒性及机理
[0046]—实验材料与方法
[0047](一)实验用品
[0048]斑马鱼(AB种)，中国环境科学研究院水生生物实验室；
[0049]四溴双酚A (ΤΒΒΡΑ)，分析纯，购自美国Alfa Aesar化学试剂公司(Β1138Α)；
[0050]吖啶橙(Α0)，购自上海绿叶生物科技有限公司(100910)；
[0051]PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit,购自美国 Omega Bio-tek 公司(D6210S)；
[0052]E.Z.N.A.?Total RNA Kitl，购自美国 Omega Bio-tek 公司(R6836-02)；
[0053]SYBR Green Supermix，购自美国 Bio-Rad 公司(170-8862)；
[0054]Tricaine (MMS),购自美国 Sigma-Aldrich 公司(D33601);
[0055]乙醇分析纯，购自北京化工厂(20110810)；
[0056]鱼活性氧簇(ROS) ELISA试剂盒，购自上海慧颖生物科技有限公司(R2012223)；
[0057]凋亡DNA Ladder快速提取试剂盒，购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司(ZP324)；[0058]DNA Ladder Marker,购自Takara宝生物工程有限公司；
[0059]PBS 缓冲液，购自北京 Neuronbc 公司(1115203)；
[0060]引物序列见下表:
[0061]表I引物序列
【权利要求】
1.山核桃叶总黄酮在制备防治环境污染物所致水生生物病害方面的药物应用。
2.如权利要求1所述的应用，其中，其中所述环境污染物所致病害为四溴双酚A(TBBPA)诱导的胚胎心脏发育毒害。
3.如权利要求1或2所述的应用，其中所述水生生物为斑马鱼。
4.如权利要求1-3任一所述的应用，其中所述山核桃叶总黄酮的使用浓度为1.0mg/Lo
5.如权利要求1-3任一所述的应用，其中，所述山核桃叶总黄酮具有降低TBBPA所致胚胎发育形态异常的作用。
6.如权利要求1-3任一所述的应用，其中，所述山核桃叶总黄酮具有抑制TBBPA所致胚胎ROS活性升高的作用。
7.如权利要求1-3任一所述的应用，其中，所述山核桃叶总黄酮对TBBPA诱导的斑马鱼胚胎发育过程中P53表达上调和Bcl-2表达下调具有明显的抑制作用。
8.山核桃叶总黄酮在制备一种降低TBBPA所致水生生物胚胎发育形态异常的药物应用。
9.如权利要求8所述的应用，其中所述水生生物为斑马鱼。
10.如权利要求8或9所述的应用，其中所述山核桃叶总黄酮的使用浓度为1.0mg/L。
11.山核桃叶总黄酮在制备一种抑制TBBPA所致胚胎ROS活性升高的药物应用。
12.如权利要求11所述 的应用,其中所述水生生物为斑马鱼。
13.如权利要求11或12所述的应用，其中所述山核桃叶总黄酮的使用浓度为1.0mg/L0
14.山核桃叶总黄酮在制备一种抑制TBBPA诱导的斑马鱼胚胎发育过程中P53表达上调和Bcl-2表达下调的药物应用。
15.如权利要求14所述的应用，其中所述水生生物为斑马鱼。
16.如权利要求14或15所述的应用，其中所述山核桃叶总黄酮的使用浓度为1.0mg/
【文档编号】A61K127/00GK103432194SQ201310410581
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月10日 优先权日:2013年9月10日
【发明者】杨苏文, 郑丙辉, 丁志山 申请人:中国环境科学研究院, 浙江中医药大学