专利名称：：一种药物心脏毒性的检测方法
技术领域：
：本发明属于药理学
技术领域：
，具体涉及一种药物心脏毒性的检测方法。
背景技术：
：肿瘤治疗带来的各种副作用尤其是心脏毒性日益受到重视。能引起心脏毒性的化疗药物很多，从柔红霉素、表柔比星到环磷酰胺等都与心律失常、心包炎、心肌缺血和心肌病明显相关，此外，新型靶向治疗药物如曲妥珠单抗和Iapatinib的心脏毒性也令人关注。现在研究者公认uPA-uPAR系统在肿瘤的发生发展过程中起了重要的作用，uPA不仅可以促进肿瘤细胞的增殖，而且与肿瘤细胞的粘附、迁移、侵袭和转移过程密切相关。在癌症患者体内，也可以检测到一些uPA-uPAR系统的蛋白质表达量高于正常水平。文献报导指出，可以采用多种方法抑制uPA-uPAR系统，来达到抑制肿瘤细胞生长和转移的目的。虽然uPA-uPAR系统对动物的发育和生殖并不必需，但uPA-uPAR系统的缺失可能对动物的心脏产生不利的影响，这个在进行抑制uPA-uPAR系统的肿瘤治疗时是需要考虑到的一个问题。心脏是制药业的重要靶标之一，有两个原因。首先，西方国家心血管疾病是最常见的死亡原因，治疗这些疾病需要保健系统付出高额费用，说明与心脏有关的药物有巨大的市场。其次，从市场上撤药和新药审批推迟的最常见原因是出现了心脏不良反应。例如小分子酪氨酸激酶抑制剂最常见的心肌抑制引起心脏不良反应，亟需有关的毒性模型来研究。虽然成熟的标准间质细胞技术可容易地分析心肌抑制，但确立心脏毒性有关系统尚待完善。因此，在药物发现、研制和安全药理学研究中测定潜在化合物的心脏毒性是个重大问题。
发明内容本发明需要解决的问题的是为治疗肿瘤时可能产生的心脏毒性特别是通过抑制uPA-uPAR系统治疗肿瘤时可能产生的心脏毒性提供一个方便的检测方法。本发明是关于一种药物心脏毒性的检测方法。主要由以下内容组成1整体动物模型药物对小鼠心脏毒性指标的测定。取32-36周龄的C57/B6小鼠，雌雄不限，每天两次皮下注射待测药物，共注射7天，第8天杀死小鼠，取出心脏，将血液洗净，测定心室重量(ventricleweight，VW)。用心室重量与小鼠体重(bodyweight,BW)的比值(VW/BW，g/g%)作为药物心脏毒性的指标，同时做对照(用磷酸缓冲液PBS代替待测药物)用来比较。2细胞模型药物对小鼠心肌细胞毒性指标的测定。小鼠心肌细胞的体外培养。取出生3天以内的新生C57/B6小鼠20只，无菌取出心脏，用PBS将心脏中余血洗净，尽量去除心耳、血管及结缔组织，将剩余的心室肌剪成l-2mm的碎块，按照下面的步骤进行循环消化(1)加入消化液(0.trypsin，0.05%typeIIcollagenase,1%BSA,20μg/mLDNaseIinPBS)l-2mL，在35°C恒温水浴中轻轻振荡消化5min。(2)加入5-10mLPBS,用IOmL玻璃刻度吸管轻轻吹打心肌组织块lmin，再静置Imin让组织块充分沉淀到管底。(3)小心吸取上部溶液，注意不要吸到底部的组织块，尽量将溶液吸完全。将吸取的溶液离心(1000rpm，5min)，取细胞重悬于10%FBS的MEM培养液中。在未消化完的组织块中加入消化液，进入步骤(1)。循环消化直到组织块完全消化完，一般需要7-10次循环。第一次消化得到的细胞中含较多的血细胞，弃去不用，合并其余所得细胞，过300目铜网，用MEM培养液洗2次。用MEM培养液(含1%FBS,100u/mL青霉素，100g/mL链霉素)将细胞接种1_2个IOcm培养皿，37°C，预贴壁lhr。由于心肌细胞贴壁较成纤维细胞贴壁慢，Ihr后成纤维细胞已贴壁，而此时绝大部分心肌细胞还未贴壁。预贴壁结束后，轻轻振荡培养皿，吸取未贴壁细胞，洗1次，计数。用MEM培养液(含10%FBS，0.Immol/LBrdU,1.5μmol/LVB12,0.12μmol/LCu2+，0.1μmo1/LZn2+,lOOu/mL青霉素，lOOg/mL链霉素)将细胞稀释成5X105/mL接种培养皿或培养板。37°C培养过夜后换液，去除未贴壁部分。以后隔2天换液。Western-blotting测定心肌细胞磷酸化ERK1/2的水平。培养的新生小鼠心肌细胞换无血清MEM培养液，血清饥饿Mhr。换新鲜无血清MEM培养液，加入待测药物37°C刺激后，立即用4°C的PBS洗2次，加入细胞裂解液(65mMTris-Cl，pH7.4，150mMNaCl,1%ΝΡ-40，0.25%去氧胆酸钠，ImMEDTA,ImMPMSF,ImMNa3VO4,ImMNaF,Rocheinhibitorcocktailtabledtable/50mL))4°C裂解lOmin。离心(10800gXIOmin)去除不溶物，BCA法测定蛋白浓度。用12%的胶做还原型SDS-PAGE。在胶上分离的蛋白转移到NC膜上，7%脱脂奶-PBST(PBS，0.Tween20)室温封闭2hr。兔抗鼠磷酸化ERK1/2(Bioworld)(11000)室温反应2hr或4°C过夜。PBST洗3次，每次lOmin。驴抗兔IgG(H+L)-HRP(Pierce)(110000)室温反应》ir。PBST洗3次，每次lOmin。加ECL底物，压X-光胶片在暗盒中曝光，暗室显影、定影。第一次^festern结束后将NC膜用stripping缓冲(62.5mMTris-ClpH6.7,2%SDS,ΙΟΟπιΜβ-巯基乙醇)50°C处理30min，剥离膜上结合的蛋白。用兔抗鼠TotalERK1/2(Bioworld)作为一抗，与上述第一次^festern类似，做第二次狗8丨6111反应。将X-光胶片扫描(Imag沾canner，Pharmacia)，用QuantityOne软件(Bio-Rad)进行处理，分析每个曝光条带的光密度。以药物刺激后的ERK1/2的相对磷酸化值(磷酸化ERK1/2的光密度/总ERK1/2的光密度，P/TERK1/2)作为药物心肌细胞毒性的指标。本发明与现有技术相比具有的有益效果。目前检测心脏毒性最常用的指标是左心室射血分数，另外血清肌钙蛋白作为生物学标志物适用于心肌改变的早期检测。本方法与这些技术相比，具有灵敏度高，检测方便的优点，不仅适用于检测心脏功能的改变，而且也可用于具有心脏潜在毒性的药物毒性评价。具体实施例方式以下通过具体的实施例对本发明作进一步阐述。实施例1ISO(异丙基肾上腺素)对野生型C57/B6小鼠和uPA基因敲除(uPA-/_)小鼠心脏的毒性给C57/B6小鼠注射ISO或PBS7天，计算心脏毒性指标VW/BW，结果见表1，可见ISO组心脏毒性指标明显高于PBS组(P<0.0001)，ISO的刺激使小鼠心脏明显变大。4分别给野生型和UPA-/-的C57/B6小鼠注射ISO和PBS7天，用心脏毒性指标的差值DeltaVW/BW(IS0组的VW/BW-PBS组的VW/BW)来表示ISO对两种小鼠的心脏毒性的差异，结果见表2。可见uPA-/-小鼠心脏毒性指标比野生型小鼠更加严重，二者间差异显著(P<0.0009)。表权利要求1.一种药物心脏毒性的检测方法，其特征是“整体动物模型，药物对小鼠心脏毒性指标的测定或细胞模型，药物对小鼠心肌细胞毒性指标的测定”。2.根据权利要求1所述的药物心脏毒性的检测方法，其特征是整体动物模型检测方法为小鼠每天两次皮下注射待测药物，共注射7天，第8天测定心室重量与小鼠体重的比值，用小鼠心室重量与小鼠体重的比值作为药物心脏毒性的指标。3.根据权利要求1所述的药物心脏毒性的检测方法，其特征是细胞模型检测方法为小鼠心肌细胞的体外培养，在培养液中加入待测药物37°C刺激，Western-blotting测定心肌细胞相对磷酸化ERK1/2的水平，即磷酸化ERK1/2的光密度比总ERK1/2的光密度，用ERK1/2的相对磷酸化值作为药物心肌细胞毒性的指标。全文摘要本发明属于药理学
技术领域：
，具体涉及一种药物心脏毒性的检测方法。本发明解决了治疗肿瘤时可能产生的心脏毒性特别是通过抑制uPA-uPAR系统治疗肿瘤时可能产生的心脏毒性的检测方法的问题。本发明的技术方案由以下步骤组成整体动物模型，药物对小鼠心脏毒性指标的测定，用心室重量与小鼠体重(bodyweight，BW)的比值(VW/BW，g/g％)作为药物心脏毒性的指标。细胞模型，药物对小鼠心肌细胞毒性指标的测定，以药物刺激心肌细胞后的ERK1/2的相对磷酸化值(磷酸化ERK1/2的光密度/总ERK1/2的光密度，P/TERK1/2)作为药物心肌细胞毒性的指标。文档编号C12Q1/02GK102145182SQ201010106810公开日2011年8月10日申请日期2010年2月9日优先权日2010年2月9日发明者刘建宁,袁达文申请人:南京大学