专利名称：一种可用于对斑马鱼胚胎进行药物筛选的微流芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微流芯片，特别涉及一种廉价、易于制备、适合大规模、高通量、自动化对斑马鱼胚胎进行药物筛选的微流芯片。
背景技术：
斑马鱼是一种胚胎透明且渗透性强、发育快速且调控过程相对保守、体积小且易于操作的模式生物，利用斑马鱼进行高通量的药物筛选在生态毒理学、发育遗传学、药物研发等众多领域有着广泛应用。在筛选过程中，若能够实现自动化的换液步骤，则可以大量的减少劳动力及实验的人为误差。虽然人们已经发展了利用高密度孔板及排枪来进行换液的技术，但该技术只能提高操作的效率而不能满足完全自动化的实现整个换液过程的需求。
近几年，单细胞的研究越来越受到人们的重视，单个胚胎的研究也将成为生物学领域的一个热点。然而，传统的利用斑马鱼进行筛选的方法，都是对几个或者十几个胚胎进行群体处理及分析，这种群体方法得到的结果很可能淹没了个体的信息。但是，由于传统方法操作繁琐，使得对单个胚胎逐一进行处理不易实现。因此，我们的自动化操作的芯片也将在单个胚胎的研究方面扮演着重要的角色。
发明内容
本发明的目的正是针对现有技术中斑马鱼胚胎换液自动化程度低、劳动密集、消耗大的问题，提供一种微流芯片以及微流液体操作系统，该系统可实现斑马鱼胚胎药物筛选过程中在设定时间点完成换液的全部过程，在一个优选的实施方式中，在一张4X6个“养鱼微池”(以下简称微池)的芯片中，每个微池中只有一个鱼胚胎，这些养鱼微池与流体层管道相连接，流体层管道通过程序控制对每个微池中的液体在设定的时间点实现加药或洗脱，从而实现自动化的换液过程。如图I所示，黑色管道为控制管道，红色管道和绿色管道为流体层管道，黄色部分为微池，微池的入口和出口都采用二分型的管道设计来平衡阻力。本发明中的“芯片”与通常本领域所定义的芯片概念相同，其外观为厚度均一的平整片状物体，最常见的形状为长方形或正方形。本发明中的“一条微流通道”是根据微流通道在微流芯片上的开口(非微池内壁的开口)来确定的，与一个上述的开口连通的微流通道都属于同一条微流通道。本发明中的“一条控制通道”是以在微流芯片上的开口为标志，与一个上述的开口连通的控制通道都属于同一条控制通道。本发明中的“交叉点”指的是微流通道与控制通道在微流芯片上的投影的相交点。显而易见，由于微流通道和控制通道属于不同的层，它们之间不可能是连通的。本发明采用的技术方案如下。一种可用于对斑马鱼胚胎进行药物筛选的微流芯片，其特征在于所述微流芯片包括至少一个微流层、至少一个与微流层相邻的控制层、将相邻的微流层和控制层连接起来的连接层和至少一个用于容纳斑马鱼胚胎并为其提供生长环境的微池；所述微流层具有至少2条微流通道；每一个微池的内部空间与至少两条微流通道连通，其中至少一条微流通道用于往微池中注入液体，上述微流通道称为输入微流通道，其余的微流通道用于从微池中抽出液体，上述微流通道称为输出微流通道；每一条微流通道在微流芯片上具有一个开口与外界连通，在至少一个微池内壁上具有至少一个开口与微池内部空间连通，所述开口的横截面小于微池中鱼胚胎的横截面；所述控制层具有至少一条控制通道，每一条控制通道在微流芯片上具有一个开口与外界连通，其他部分均在微流芯片内部；每一条微流通道与所述控制通道具有至少一个交叉点，至少一个交叉点位置的连接层由弹性体材料构成，当控制通道中的压力增加到一定值时，上述至少一个交叉点位置的弹性体连接层将向微流层方向膨胀并与微流通道内表面紧密接触至完全阻断微流通道，使其处于断开的状态，当控制通道中的压力恢复时，交叉点位置的弹性体连接层恢复原态，微流通道重新连通，上述交叉点处的弹性体连接层具有阀门的功能，称为弹性体阀门。采用上述技术方案便可以实现对斑马鱼胚胎全自动地进行药物筛选。在每个微池中放置一个鱼胚胎，通过与其连通的某一条或多条微流通道往其中输入溶液，该溶液可 以是供鱼胚胎发育的缓冲溶液，也可以是影响胚胎发育的药物溶液；通过与微池连通的其他微流通道从微池中抽出溶液，由于微流通道在微池内壁上的开口的横截面小于鱼胚胎的横截面，在抽出溶液的过程中，鱼胚胎并不会被抽走，且抽吸过程经检测不足以明显影响胚胎的正常发育。控制通道与微流通道形成交叉点，在某些交叉点处使用弹性体材料形成连接层，便可以在这些交叉点处形成弹性体阀门，通过调节控制通道中的压力便可以控制上述弹性体阀门的开或闭，从而控制对应位置的微流通道的连通或断开。将合适尺寸的管道从外部连接到微流芯片的微流通道入口和控制通道入口，在每一个与控制通道相连的管道上设置一个电磁阀，电磁阀与计算机连接，与输入微流通道相连的外部管道称为输入管道，与输出微流通道相连的外部管道称为输出管道，往输入管道中预先注入一定量的液体(溶液)，使用时，将上述输入管道与提供正压的压力泵连接，将输出管道与提供负压的压力泵连接，将与控制通道相连的外部管道与提供正压的压力泵连接，通过计算机编程控制电磁阀在设定的时间打开或关闭，便可以实现全自动地对斑马鱼胚胎进行药物筛选。在一个优选的实施方案中，微流层、控制层和连接层均由弹性体材料构成，控制通道在与微流通道的部分或全部交叉点处扩大形成空腔，该空腔的尺寸大于上述交叉点处微流通道的宽度，所述尺寸指空腔在微流通道的宽度方向上的尺寸，上述具有空腔的交叉点处的连接层具有阀门的功能，称为弹性体阀门。微流层、控制层和连接层均由弹性体材料构成是为了用简便的实验室方法制备微流芯片。由于许多弹性体材料具有良好的加工成型的性能，例如热塑性、热固性、辐射诱导交联等，无需昂贵的设备以及复杂的方法，采用实验室简单的常用设备便可以方便地制备出各种结构的微流芯片。控制通道在与微流通道的部分或全部交叉点处扩大形成空腔，由于空腔位置的连接层较薄、面积较大，因此当控制通道中的压力增加时，空腔位置处的连接层将最先膨胀，并且膨胀的形变较大，控制合适的压力便可以保证只有空腔范围内的连接层膨胀至与微流通道内壁紧密接触，从而只在形成空腔处的交叉点阻断微流通道。将空腔的尺寸设置为大于上述交叉点处微流通道的宽度，便可以保证空腔处的连接层膨胀时能彻底阻断对应位置的微流通道。在一个优选的实施方案中，微流层、控制层和连接层的数目均为I ;多个微池排列成a行Xb列的点阵，其中a和b均为大于或等于4的正整数；微流层中的微流通道数目为2，其中一条微流通道为输入微流通道，另一条微流通道为输出微流通道；每一条微流通道均分叉形成分支，在每一个微池内壁形成一个或多个开口从而与微池的内部空间连通；每一条微流通道与控制通道形成aXb个弹性体阀门，所述弹性体阀门设置于微流通道上适当的位置，从而可以通过弹性体阀门控制每一个微池与微流通道的连通状态。在上述技术方案中，微流层只具有2条微流通道，每一条都与所有的微池连通，其中一条与提供正压的压力泵连接，往微池中输入溶液，另外一条与提供负压的压力泵连接，从微池中抽出溶液。弹性体阀门设置于微流通道上适当的位置，一般设置在微流通道在微池内壁上的出口附近的微流通道上，每一个微池都对应2个弹性体 阀门，其中一个控制输入微流通道，另一个控制输出微流通道，因此通过一共2XaXb个弹性体阀门便可以控制每一个微池与微流通道的连通状态。当每一条微流通道在一个微池内壁仅形成一个开口时，可以将所述弹性体阀门设置于上述开口与最近的一个分叉之间；当每一条微流通道在一个微池内壁形成多个开口时(多个开口是由微流通道经过一次分叉形成的)，所述弹性体阀门位于与上述开口距离最近的两个分叉之间，上述多个开口等间距地分布在微池内壁上，目的是使得液体更换的效率更高，以及使得液体的注入能更快地分散均一；优选地，每一条控制通道只与一条微流通道形成一个弹性体阀门，也就是2 X a X b个弹性体阀门对应2 X a X b条控制通道，从而可以单独地控制每一个微池与微流通道的连通状态。在一个优选的实施方案中，微流层、控制层和连接层的数目均为I ;多个微池排列成a行Xb列的点阵，其中a和b均为大于或等于4的正整数；微流层中的微流通道数目为b+Ι，其中b条微流通道为输入微流通道，一条微流通道为输出微流通道；b条输入微流通道中的每一条均分叉形成分支，在某一列微池中的每一个微池的内壁形成一个或多个开口，从而与微池内部空间连通；输出微流通道则分叉形成分支，在每一个微池内壁形成一个或多个开口从而与微池的内部空间连通；b条输入微流通道中的每一条均与控制通道形成a个弹性体阀门，输出微流通道与控制通道形成aXb个弹性体阀门，所述弹性体阀门设置于微流通道上适当的位置，从而可以通过弹性体阀门控制每一个微池与微流通道的连通状态。设置b条微流通道用于往微池中注入液体，每列微池与同一条微流通道连通，b列微池就对应b条微流通道，这样设置的目的是为了可以在不同列的微池中输入不同的溶液，从而进行对比实验。当每一条微流通道在一个微池内壁仅形成一个开口时，可以将所述弹性体阀门设置于上述开口与最近的一个分叉之间；当每一条微流通道在一个微池内壁形成多个开口时(多个开口是由微流通道经过一次分叉形成的)，所述弹性体阀门位于与上述开口距离最近的两个分叉之间，上述多个开口等间距地分布在微池内壁上，目的是使得液体更换的效率更高，以及使得液体的注入能更快地分散均一；优选地，每一条控制通道只与一条微流通道形成一个弹性体阀门，也就是2 X aXb个弹性体阀门对应2 X aXb条控制通道，从而可以单独地控制每一个微池与微流通道的连通状态。在一个优选的实施方案中，每一个微池内壁上，输入微流通道的开口与输出微流通道的开口处于相对的位置。这样设置的目的也是为了提高液体更换的效率。在实验中，一般先通过微流通道抽出微池中原有的溶液，然后再注入新的溶液，由于注入口和抽出口处于相对的位置，原有溶液和新注入的溶液混合的可能性就减小，从而提高了更换溶液的效率。
优选地，弹性体材料选自聚二甲基硅氧烷(PDMS)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚氨酯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚氯乙烯(PVC)、环状聚烯烃共聚合物(Cyclic Olefin Copolymers ;C0C)、聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚砜、尼龙、苯乙烯-丙烯酸共聚物、天然橡胶、聚异戊二烯、丁基橡胶、齒化丁基橡胶、聚丁二烯、丁苯橡胶、丁腈橡胶、氯丁二烯橡胶、乙丙橡胶、表氯醇橡胶、聚丙烯酸酯橡胶、硅酮橡胶、氟硅橡胶、含氟弹性体(FKM)、全氟弹性体(FFKM)、乙烯-乙酸乙烯酯、节肢弹性蛋白(resilin)、弹性蛋白(elastin)、聚酰亚胺、酹醒树脂中的一种或者任意两种以上的混合物。实施例中使用聚二甲基硅氧烷制备微流芯片，这是由于PDMS具有许多有利于微浇筑、微模塑和微图案化的材料特性。本领域技术人员能够了解，所有本领域现有的弹性体材料都能应用于本发明的微流芯片中，而并不限于上述优选的实例。
本发明还提供一种可用于对斑马鱼胚胎进行自动药物筛选的装置，其特征在于该装置包括上述微流芯片、与微流通道以及控制通道连通的管道、与所述管道连接的泵、设置在所述管道上的电磁阀、以及与所述电磁阀连接并对电磁阀进行控制的计算机。使用该装置进行实验的时候，若实验时间较长，还可以在芯片上盖一层盖板，以防止微池中溶液的蒸发。使用上述装置对斑马鱼胚胎进行自动药物筛选的方法，按照如下步骤进行1)在每个微池中放入一枚斑马鱼胚胎以及缓冲溶液；2)在与输入微流通道连接的管道中预先通入实验所用的溶液；3)开启与管道连接的泵，其中与输入微流通道以及控制通道连接的泵产生正压，与输出微流通道 连接的泵产生负压；4)通过计算机控制电磁阀，在设定的时间打开或关闭电磁阀，便可以实现对斑马鱼胚胎进行全自动的药物筛选。各个泵试验中都处于开启状态，电磁阀开启的时候，泵提供的压力就能传达到控制通道中去，于是控制通道上的弹性体阀门便膨胀，关闭对应的微流通道，因此虽然泵处于工作状态，微池中的溶液并不会被更换；当需要更换溶液的时候，通过计算机控制关闭与输出微流通道交叉的控制通道上的电磁阀，电磁阀所在的管路上与控制通道相连那一端的压力便消除，弹性体阀门恢复原态，输出微流通道变为连通状态，在泵的负压作用下，微池中的溶液被抽出；然后，通过计算机开启上述电磁阀，输出微流通道断开，采用同样的步骤使输入微流通道连通，往微池中输入新的溶液，一个换液循环便完成了。通过计算机的程序(例如Labview)可以方便的实现整个实验过程的全自动化。不难发现，本发明所带来的技术效果是很显著的。I)传统的方法需要人工换液，操作及其繁琐，而且当实验通量较大的时候，其需要的操作量是相当巨大的，而采用本发明的装置进行操作，往微池中加入鱼胚胎之后，所有的操作都由计算机控制自动完成，节省了大量的人力。2)斑马鱼的发育过程持续很长时间，一般需要2-3天，在整个实验过程中，操作员都必须守候在实验室，随时对其进行换液操作，而采用本发明的装置进行操作，则只需事先编好程序，实验开始之后就不需要人工监护，只需等待实验自动完成之后取实验结果；3)传统的实验方法往往由于人力操作成本的限制，需要在同一个微池中养育多个胚胎，以获得足够多的样本数，但是同一个微池中的多个胚胎之间可能会相互影响彼此的发育，对实验结果造成不利影响，而采用本发明的装置则没有上述问题，由于实现了全自动化的操作，而芯片的制造简单而廉价，可以很方便地制造出具有大量微池的微流芯片，在保证样本数的前提下，每一个微池中只养育一个胚胎，从而消除了胚胎之间的相互影响，使得实验结果更加可靠。
图I本发明的一种优选结构的微流芯片示意图，黑色管道为控制管道，红色管道和绿色管道为流体层管道，黄色部分为“养鱼微池”(简称微池)，微池的入口和出口都采用二分型的管道设计来平衡阻力。图2使用本发明的微流芯片替换养鱼微池中液体的过程照片。(a)为操作之前，微池中充满了绿色染料，(b)为操作之后，微池中的绿色染料被替换为红色染料。图3(a)_(c)展示了使用本发明的微流芯片对正常斑马鱼胚胎经过两个换液循环操作后被染成绿色的过程。图4用本发明的微流芯片对斑马鱼胚胎进行药物处理结果。(a)-(c)使·用Hedgehog通路的小分子抑制剂cytopamine对转基因鱼系Tg(8gli:GFP)的胚胎在6hpf-36hpf进行处理的结果,其中Tg(8gli:GFP)是利用Hedgehog通路下游基因Gli的结合位点串联八次做出来的GFP报告鱼系。(a)0yM浓度药物刺激下，躯干部荧光很强。(b)在50 μ M浓度的药物刺激下，躯干部荧光基本正常。(c)在100 μ M浓度的药物刺激下，躯干部的突光非常弱。(d)-(g)使用Hedgehog通路的小分子抑制剂cytopamine对血管特异性转基因鱼系Tg(Flk:eGFP)在不同的时间段进行处理的结果。(d) O μ M浓度药物刺激下，在各不同的处理时间下，均发育正常，荧光显微镜下观察节间血管，荧光很强，发育正常。(e)在6hpf-36hpf施加100 μ M的药物刺激，节间血管未见生长，发育不正常。(f)6hpf-17hpf施加100 μ M的药物刺激，节间血管发育基本正常。(g)在17hpf-36hpf施加100 μ M的药物刺激，节间血管未见生长，发育不正常。
具体实施例方式以下举例说明微流芯片的制备方法，下面的实施例中使用较简便的光刻胶GM1070、ΑΖ4620以及PDMS制备，但并不表示微流芯片只能由这样的方法制备，本领域技术人员可以了解，任何本领域现有的技术都可以用来制备具有本发明结构的微流芯片。I.制备方法I. I.微流芯片模板的制备I. I. I.控制层模板的制作方法用Auto CAD软件设计控制层的模板再由苏州美精微光电有限公司打印。清洗硅片，先用丙酮后用异丙醇清洗，吹干。把清洗后的硅片至于110°c加热板上加热lOmin。将GM1070光刻胶倒在硅片上，用匀胶机甩匀2000rpm，60sec。将硅片至于平整台面上放置IOmin0将娃片至于65°C加热台上烘5min,再将娃片转移到95°C加热台上烘15min。待娃片冷却后,紫外光曝光,曝光量200mJ/cm2。将娃片至于65°C加热台上烘5min,再将娃片转移到95°C加热台上烘15min。在负胶显影液中显影，用丙酮和异丙醇冲洗干净。最后将硅片放到155°C加热台上烘3h。I. I. 2.流体层模板的制作方法用Auto CAD软件设计流体层的正胶模板后由苏州美精微光电有限公司打印。清洗硅片，先用丙酮后用异丙醇清洗，吹干。把清洗后的硅片至于110°c加热板上加热lOmin。再用六甲基氮二硅烷(HMDS)熏蒸硅片lOmin。将AZ4620光刻胶倒在硅片上，用匀胶机甩匀1200rpm,60seco将娃片至于平整台面上放置lOmin。将娃片至于95°C加热台上烘3min。再将硅片至于115°C加热台上烘5min。之后在涂有正胶的模板上再涂上一层AZ4620，用勻胶机甩勻1200rpm,60sec。将娃片至于平整台面上放置lOmin。将娃片至于95°C加热台上烘4min。再将娃片至于115°C加热台上烘6min。待娃片冷却后，紫外光曝光，曝光量200mJ/cm2。用AZ显影液(显影液与水的比例为I : 2)显影，显影后将硅片至于清水中浸泡30min。最后将硅片至于加热台上，从20°C升温到22 0°C，6°C /h，并且在220°C停留3h。流体层的负胶掩模用AutoCAD软件设计后由苏州美精微光电有限公司打印。将GM1070光刻胶倒在有正胶流体层的娃片上，用勻胶机甩勻IOOOrpm,60sec。将该娃片至于平整台面上放置lOmin。将娃片至于65°C加热台上烘5min,再将娃片转移到95°C加热台上烘15min。待娃片冷却后，在曝光机的显微镜下将正负胶的图形对准，紫外光曝光，曝光量200mJ/cm2 ο将娃片至于65°C加热台上烘5min,再将娃片转移到95°C加热台上烘15min。在负胶显影液中显影，用丙酮和异丙醇冲洗干净。最后将硅片放到155°C加热台上烘3h。1.2.微流芯片的制备1.2.1.微流芯片的微流层(fluid layer)的制作用GE RTV615PDMS，取 50g 的 PDMS(A) (a)和 IOg 的 PDMS (b)放入同一容器中。将配好PDMS的容器放入混合器中，混合除泡各3min，2000rpm。模具用流体层模板。模板用三甲基氯硅烷(TMS)熏蒸lOmin。将模板放在用铝箔包好的培养皿中，之后将混合好的PDMS灌在模板上，放入保干器中抽气。放入烘箱中80°C，烘40min。1.2.2.微流芯片的控制层(fluid layer)和连接层的制作用GE RTV615PDMS,取IOg的PDMS⑷和O. 5g的PDMS⑶放入同一容器中。将配好PDMS的容器放入混合器中，混合除泡各3min，2000rpm。模具用控制层模板。模板放在匀胶台上，倒上混合好的PDMS，匀胶1300rpm，60sec，放置约20min，使PDMS表面平整。放入烘箱 80。。，烘 40min。I. 2. 2.微流芯片的基底层(fluid layer)的制作将配好的20 I的PDMS用混合器混合均匀，混合除泡各3min，2000rpm。载玻片放在匀胶台上，倒上混合好的PDMS，匀胶1500rpm，60sec，放置约20min，使PDMS表面平整。放入烘箱80°C，烘20min。I. 2. 3.微流芯片芯片盖(即上文所述防止微池中溶液蒸发的“盖板”)的制作用GE RTV615PDMS，取20g的PDMS⑷和Ig的PDMS⑶放入同一容器中。将配好PDMS的容器放入混合器中，混合除泡各3min，2000rpm。模具用无图案的硅片将模板放在用铝箔包好的培养皿中，之后将混合好的PDMS灌在模板上，放入保干器中抽气。放入烘箱中80°C，烘60min。取出制备好的芯片盖PDMS，取下硅片，PDMS胶块切成合适大小待用。I. 3.芯片各层进行不可逆热聚合的处理取出制备好的流体层PDMS，取下硅片，沿着边框线将胶块切开，然后用直径为I. 5mm的打孔针在流体层进样口打孔，用直径为4mm的打孔针在“养鱼微池”的位置打孔。取出制备好的控制层和连接层PDMS，将流体层PDMS贴在控制层和连接层PDMS上方，在显微镜下对齐叠放两层PDMS。放入烘箱80°C，80min。沿边缘撕下已经聚合的两层PDMS芯片，然后在控制层进样口处用直径为I. 5mm的打孔针打孔。将作好的芯片贴在芯片基底上。80°C烘过夜。实施例I微流芯片的结构。本实施例详细说明本发明的微流芯片的一个优选结构，该结构如图I所示。开口在微流芯片上方的输入微流通道分叉形成3个分支，每一个分支又进一步分叉形成2个小分支，形成的6个分支分别与6列微池中某一列微池的内部空间连通，每个分支进一步分叉为4个小分支在每一个微池内壁上形成4个开口，4个开口等间距地分布在微池内壁上，使得液体的注入、更换更加高效；输出微流通道一共有6条，每一条与一列微池连通，同样的，微流通道在每一个微池内壁上形成4个开口，4个开口等间距地分布在微池内壁上，使得液体的抽出、更换更加高效。控制通道一共22条，对应有66个弹性体阀门，用于控制微池与微流通道连通状态的弹性体阀门设置在离微池最近的2个分叉之 间，通过调节上述22条控制通道中的压力，便可以控制上述66个弹性体阀门的开或闭，从而控制每一个微池与微流通道的连通状态。控制通道以及弹性体阀门的设置并不限于上述方式，总的原则是用尽量少的控制通道以及阀门来控制尽可能多的微流通道，这种设计方法属于成熟的现有技术，可以参考文献Todd Thorsen et al. /iMicrofluidic Large-ScaleIntegration”，Science，Vol.298，580-584，2002-10-18。实施例2本实施例用染料实验说明本发明提供的微流液体操作系统可以实现养鱼微池中液体的替换。在真空抽气泵驱动及电磁阀的控制下，微池中的液体通过微管道及软管与负压相连，在一个负大气压的作用下，10秒内，养鱼微池内的液体被完全吸出芯片，此过程为吸液过程。在压缩空气的驱动及电磁阀的控制下，微池中的液体通过微管道及软管与正压相连，在一个大气压的作用下，5秒内，养鱼微池内的液体软管中的液体被送到指定的微池中，在微池中积蓄了一定高度的液体，此过程成为送液过程。一个抽液过程和一个送液过程共同被称为一个循环。一个循环后微池中的液体即可被替换。图2(a)_(b)展示了微流芯片的一个微池中一个循环后绿色染料被替换成红色染料的过程。实施例3本实施例利用斑马鱼胚胎在芯片中自动被染料染色过程实验说明本发明提供的微流液体操作系统可以用于进行鱼胚胎的药物处理。用绿色染料来染正常的斑马鱼胚胎。先将斑马鱼胚胎和缓冲溶液一同放入养鱼微池中。先进行吸液过程，此后用绿色染料进行进液过程，之后重复吸液过程，最后用缓冲溶液进行进液过程。图3(a)_(c)展示了正常斑马鱼胚胎经过两个循环后被染成绿色的过程。实施例4本实施例利用Hedgehog通路的特异性小分子抑制剂cytopamine抑制斑马鱼体节间血管生长的现象说明本微流芯片在不同的时间点处理胚胎，得到药物作用的关键时期方面的应用。首先，本实施例利用不同浓度药物对斑马鱼胚胎进行处理找到药物处理的有效浓度。本实施例使用Hedgehog通路下游分子Gli的结合位点做成的荧光报告系统做成转基因鱼系Tg(8gli:GFP)，该鱼系可用来指示Hedgehog是否激活而使Gli结合其结合位点启动GFP表达。在芯片中，用塑料吸管将每个养鱼微池放入一枚斑马鱼胚胎及缓冲溶液并且用芯片盖盖好，之后放入28°C水浴锅中培养。在水浴锅中，保持锅内的水接触但不淹没芯片上表面。通过芯片上较小的开口连接软管，软管中预先通入不同浓度的药物，同一列用同一浓度的cytopamine药物进行刺激，不同列间刺激药物的浓度不同，药物浓度分别为O μ M，50 μ M和ΙΟΟμΜ。每个养鱼微池中的鱼会按照设定的程序被加以不同浓度的药物，斑马鱼胚胎在6hpf-36hpf (hours past fertilization)受到药物刺激。每次换液操作为实施例I中的一个循环。36hpf时，将芯片从水浴锅中拿出，取下芯片盖并且用塑料吸管吸出芯片内的鱼，去卵膜在显微镜下记录结果。图4(a)-(c)显示出了 36hpf，转基因鱼系Tg(8gli:GFP)的斑马鱼在荧光显微镜下观察的结果图。结果显示斑马鱼胚胎在不同浓度的药物刺激下有不同响应。如图4，(a)鱼胚胎在0μ M浓度药物刺激下，躯干部荧光很强。(b)在50μΜ浓度的药物刺激下，躯干部荧光基本正常。(c)在ΙΟΟμΜ浓度的药物刺激下，躯干部的荧光非常弱。以上结果说明100 μ M可为药物处理的有效浓度。其次，本实施例用有效浓度的药物在不同的时间点处理胚胎，得到药物作用 时期的关键时间。本实施例使用血管内皮细胞特异性标记的转基因鱼系Tg(Flk = GFP)来观察斑马鱼胚胎体节间血管的生长情况。用上述胚胎处理方法，每列用同一浓度的cytopamine药物进行刺激，不同列间刺激药物的浓度不同，药物浓度分别为O μ M，100 μ Μ。每一行施加相同的处理时间，不同行之间的处理时间不同，第一行为6hpf_36hpf (hourspast fertilization)，第二行药物的刺激时间为6hpf_17hpf,三行药物刺激时间为17hpf-36hpf，。每一行鱼胚胎在相应药物处理时间外的6hpf-36hpf的其他时间均在普通缓冲溶液中，无药物刺激。每个微池中的鱼会按照设定的程序被加以不同浓度的药物及刺激时间的操作。每次换液操作为实施例I中的一个循环。在36hpf时，将芯片从水浴锅中拿出，取下芯片盖并且用塑料吸管吸出芯片内的鱼，去卵膜在显微镜下记录结果。图4 (d) - (g)显示出了 36hpf，转基因鱼系Tg(Flk = GFP)的斑马鱼在荧光显微镜下观察的结果图。如图4，(d)结果显示斑马鱼胚胎在ΟμΜ浓度药物刺激下，在各不同的处理时间下，均发育正常，荧光显微镜下观察节间血管，荧光很强，发育正常。(e)在6hpf-36hpf施加100 μ M的药物刺激，节间血管未见生长，发育不正常。(f)6hpf-17hpf施加ΙΟΟμΜ的药物刺激，节间血管发育基本正常。(g)在17hpf-36hpf施加100 μ M的药物刺激，节间血管未见生长，发育不正常。本实施例的结果初步说明17hpf_36hpf是Hedghog通路影响节间血管生长的关键时期，此结果与传统方法所得结果有一致性。
权利要求
1.一种可用于对斑马鱼胚胎进行药物筛选的微流芯片，其特征在于所述微流芯片包括至少一个微流层、至少一个与微流层相邻的控制层、将相邻的微流层和控制层连接起来的连接层和至少一个用于容纳斑马鱼胚胎并为其提供生长环境的微池；所述微流层具有至少2条微流通道；每一个微池的内部空间与至少两条微流通道连通，其中至少一条微流通道用于往微池中注入液体，上述微流通道称为输入微流通道，其余的微流通道用于从微池中抽出液体，上述微流通道称为输出微流通道；每一条微流通道在微流芯片上具有一个开口与外界连通，在至少一个微池内壁上具有至少一个开口与微池内部空间连通，所述开口的横截面小于微池中鱼卵的横 截面；所述控制层具有至少一条控制通道，每一条控制通道在微流芯片上具有一个开口与外界连通，其他部分均在微流芯片内部；每一条微流通道与所述控制通道具有至少一个交叉点，至少一个交叉点位置的连接层由弹性体材料构成，当控制通道中的压力增加到一定值时，上述至少一个交叉点位置的弹性体连接层将向微流层方向膨胀并与微流通道内表面紧密接触至完全阻断微流通道，使其处于断开的状态，当控制通道中的压力恢复时，交叉点位置的弹性体连接层恢复原态，微流通道重新连通，上述交叉点处的弹性体连接层具有阀门的功能，称为弹性体阀门。
2.根据权利要求I所述的微流芯片，其特征在于微流层、控制层和连接层均由弹性体材料构成，控制通道在与微流通道的部分或全部交叉点处扩大形成空腔，该空腔的尺寸大于上述交叉点处微流通道的宽度，所述尺寸指空腔在微流通道的宽度方向上的尺寸，上述具有空腔的交叉点处的连接层具有阀门的功能，称为弹性体阀门。
3.根据权利要求I或2所述的微流芯片，其特征在于微流层、控制层和连接层的数目均为I ;多个微池排列成a行Xb列的点阵，其中a和b均为大于或等于4的正整数；微流层中的微流通道数目为2，其中一条微流通道为输入微流通道，另一条微流通道为输出微流通道；每一条微流通道均分叉形成分支，在每一个微池内壁形成一个或多个开口从而与微池的内部空间连通；每一条微流通道与控制通道形成aXb个弹性体阀门，所述弹性体阀门设置于微流通道上适当的位置，从而可以通过弹性体阀门控制每一个微池与微流通道的连通状态。
4.根据权利要求3所述的微流芯片，其特征在于每一条微流通道在一个微池内壁仅形成一个开口，所述弹性体阀门位于上述开口与最近的一个分叉之间。
5.根据权利要求3所述的微流芯片，其特征在于每一条微流通道在一个微池内壁形成多个开口，上述多个开口等间距地分布在微池内壁上，所述弹性体阀门位于与上述开口距离 >最近的两个分叉之间。
6.根据权利要求3-5的任一项所述的微流芯片，其特征在于每一条控制通道只与一条微流通道形成一个弹性体阀门。
7.根据权利要求I或2所述的微流芯片，其特征在于微流层、控制层和连接层的数目均为I ;多个微池排列成a行Xb列的点阵，其中a和b均为大于或等于4的正整数；微流层中的微流通道数目为b+Ι，其中b条微流通道为输入微流通道，一条微流通道为输出微流通道山条输入微流通道中的每一条均分叉形成分支，在某一列微池中的每一个微池的内壁形成一个或多个开口，从而与微池内部空间连通；输出微流通道则分叉形成分支，在每一个微池内壁形成一个或多个开口从而与微池的内部空间连通；b条输入微流通道中的每一条均与控制通道形成a个弹性体阀门，输出微流通道与控制通道形成aXb个弹性体阀门，所述弹性体阀门设置于微流通道上适当的位置，从而可以通过弹性体阀门控制每一个微池与微流通道的连通状态。
8.根据权利要求7所述的微流芯片，其特征在于每一条微流通道在一个微池内壁仅形成一个开口，所述弹性体阀门位于上述开口与最近的一个分叉之间。
9.根据权利要求7所述的微流芯片，其特征在于每一条微流通道在一个微池内壁形成多个开口，上述多个开口等间距地分布在微池内壁上，所述弹性体阀门位于与上述开口距离最近的两个分叉之间。
10.根据权利要求7-9的任一项所述的微流芯片，其特征在于每一条控制通道只与一条微流通道形成一个弹性体阀门。
11.根据权利要求1-10的任一项所述的微流芯片,其特征在于,在每一个微池内壁上，输入微流通道的开口与输出微流通道的开口处于相对的位置。
12.根据权利要求1-11的任一项所述的微流芯片，其特征在于所述弹性体材料选自聚二甲基硅氧烷(PDMS)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚氨酯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚氯乙烯(PVC)、环状聚烯烃共聚合物(Cyclic Olefin Copolymers ;C0C)、聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚砜、尼龙、苯乙烯-丙烯酸共聚物、天然橡胶、聚异戊二烯、丁基橡胶、齒化丁基橡胶、聚丁二烯、丁苯橡胶、丁腈橡胶、氯丁二烯橡胶、乙丙橡胶、表氯醇橡胶、聚丙烯酸酯橡胶、硅酮橡胶、氟硅橡胶、含氟弹性体(FKM)、全氟弹性体(FFKM)、乙烯-乙酸乙烯酯、节肢弹性蛋白(resilin)、弹性蛋白(elastin)、聚酰亚胺、酚醛树脂中的一种或者任意两种以上的混合物。
13.一种可用于对斑马鱼胚胎进行自动药物筛选的装置，其特征在于该装置包括权利要求1-12的任一项所述的微流芯片、与微流通道以及控制通道连通的管道、与所述管道连接的泵、设置在与控制通道连接的管道上的电磁阀、以及与所述电磁阀连接并对电磁阀进行控制的计算机。
14.一种使用权利要求13所述的装置对斑马鱼胚胎进行自动药物筛选的方法，其特征在于按照如下步骤进行1)在每个微池中放入一枚斑马鱼卵以及培养液；2)在与输入微流通道连接的管道中预先通入实验所用的溶液；3)开启与管道连接的泵，其中与输入微流通道以及控制通道连接的泵产生正压，与输出微流通道连接的泵产生负压；4)通过计算机控制电磁阀，在设定的时间打开或关闭电磁阀，便可以实现对斑马鱼胚胎进行全自动的药物筛选。
全文摘要
本发明涉及一种廉价、易于制备、适合大规模、高通量、自动化对斑马鱼胚胎进行药物筛选的微流芯片，包括至少一个微流层、至少一个与微流层相邻的控制层、将相邻的微流层和控制层连接起来的连接层和至少一个用于容纳斑马鱼胚胎并为其提供生长环境的微池；所述微流层具有微流通道，微流通道与微池的内部空间连通，控制层具有至少一条控制通道，微流通道与控制通道具有至少一个交叉点，至少一个交叉点位置的连接层由弹性体材料构成，形成弹性体阀门。通过弹性体阀门可以方便地控制微流通道的连通状态，从而通过外接计算机控制的电磁阀门，可以实现对斑马鱼胚胎进行药物筛选的全自动化操作。
文档编号C12M1/36GK102757885SQ20111010628
公开日2012年10月31日 申请日期2011年4月27日 优先权日2011年4月27日
发明者刘新星, 周宏伟, 周莹, 庞玉宏, 张博, 李文涛, 郑春红, 黄岩谊 申请人:北京大学