专利名称：阿卡波糖简易的发酵方法
技术领域：
本发明涉及一种阿卡波糖的发酵方法，具体的说是利用游动放线菌 α^ ο/^^ ^^)研究其在30-m3罐上发酵产阿卡波糖的工业化放大方法。
背景技术：
阿卡波糖是由游动放线菌(^^//^/^浙然印)发酵产生的假性四糖物质，能与 α -葡萄糖苷酶发生竞争性抑制作用(Wehmeier UF, Piepersberg W. Biotechnology and molecular biology of the α -glucosidase inhibitor acarbose[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 63: 613 - 625)。由于阿卡波糖在人体内难以被消化，加之目前未发现其对人体有毒性，因此阿卡波糖被广泛应用于II型糖尿病的治疗，以达到降低糖尿病患者餐后高血糖的目的(Hanefeld M, Schaper F, Koehler C. Effect of Acarbose on Vascular Disease in Patients with Abnormal Glucose[J]. Tolerance Cardiovasc Drugs Ther, 2008，22: 225 - 231)。阿卡波糖由氨基环醇、4-氨基-4，6- 二脱氧葡萄糖和一分子麦芽糖三部分组成(顾觉奋，陈菁.阿卡波糖生物合成和发酵工艺研究进展[J].国外医药抗生素分 M ， 2006, 27(3) 122-125; Lee S, Saueribrei B, Niggemann J, Egelkraut E. Biosynthesic studies on the α -glucosidase inhibitor acarbose in Actinoplanes sp: source of the maltose unit [J]. J Antibiot, 1997, 50: 954 - 961), ^iftnTjALH 卡波糖的生物合成与碳源物质的分解代谢有着密切的关系。Lee等(Lee JS, Hai Τ, Pape H, Kim TJ, Suh Jff. Three trehalose synthetic pathways in the acarbose-producing Actinoplanes sp SN223/29 and evidence for the TreY role in biosynthesis of component C[J], Appl Microbiol Biotechnol, 2008，80: 767 - 778)已详细阐明了有关阿卡波糖生物合成的基因簇和酶组学。形成一分子的阿卡波糖，理论上需要二分子的葡萄糖和一分子的麦芽糖(Heinz GF, Paul JK, John MB. Studies on the biosynthesis of antibiotics[J]. Journal of Natural Products, 1986, 49(6): 957-970; Arakawa K, Bowers SG, Michels B, et al. Biosynthetic studies on the alpha—glucosidase inhibitor acarbose: the chemical synthesis of i sotopi calIy labeled 2-epi-5-epi-valiolone analogs[J], Carbohydr Res, 2003, 338(20): 2075-2082; Stratmann A, Mahmud T, Lee S, et al. The AcbC protein from Actinoplanes specise is a C7~cyclitol synthase related to 3-dehydroquinate synthases and is involved in the biosynthesis of the α -glucosidase inhibitor acarbose[J]. The Journal of Biological Chemistry, 1999， 274(16): 10889-10896)。微生物的代谢途径是由许多关联的代谢途径协同完成的，而且其代谢活动能根据外界环境的变化进行高度调节(储炬，李友荣.现代工业发酵调控学[M].北京化学工业出版社，2002)。因此，利用微生物发酵生产目的代谢产物时，产物的产量除了受菌种自身特性的影响外，各种复杂的发酵条件也会对产物的生成产生重要的影响，比如培养基成分、温度、pH、溶氧等。Choi 和 Shin(Choi BT, Shin CS. Reduced Formation of Byproduct Component C in Acarbose Fermentation by Actinoplanes sp CKD485-16[J] · Biotechnol Prog, 2003, 19(6) : 1677 - 1682)通过控制培养液的渗透压，1500-L 发酵罐中的阿卡波糖产量达到 3490 mg/Lo Beunink(Beunink J, Schedel Μ, Steiner U. Osmotically controlled fermentation process for the preparation of acarbose. German patent DE 19637591 (US patent 6130072), 1997)也研究了渗透压对阿卡波糖合成的影响，结果表明400 mOsm /kg的渗透压最有利于阿卡波糖的合成。然而，在阿卡波糖工业 化规模的发酵控制策略上，目前没有文献报道这方面的内容。本实验室在进行放线菌的分离过程中，分离得到一株产阿卡波糖的游动放线菌A-5. 6 (Actinoplanes sp. A-5. 6) (程新，徐波，魏赛金，等.一株产α-糖苷酶抑制剂的稀有放线菌的分离与鉴定[J]. 食品与发酵工业，2008，34(9) 58-60)。200810038903. 3公开了一种阿卡波糖的制备方法，其包含下述步骤
(1)将游动放线菌斜面接种于斜面培养基进行斜面培养；
(2)挑选生长丰满的斜面接种于种子培养基进行种子培养；
(3)发酵罐培养，在培养过程中向发酵培养基中流加葡萄糖和麦芽糖；其特征在于 步骤(3)中还流加氮源，控制培养基中氨基氮的含量小于或等于0. 15mg/ml，但不包括 00.15mg/ml。
发明内容
本发明的目的在于提供一种阿卡波糖的发酵方法，首先在摇瓶和100-L发酵罐上采用碳源控制方法，然后以总糖和还原糖为放大参数，成功实现了阿卡波糖在工业化规模 (30-m3发酵罐)的发酵放大。本发明的目的是通过以下技术方案来实现
一种阿卡波糖简易的发酵方法，采用游动放线菌(Α^ ο/^^Μ^)或同属种的菌种为发酵菌种，采用的培养基包括斜面培养基、种子培养基和发酵培养基，其中
斜面培养基(g/L)葡萄糖 20 ；蛋白胨 5 ；KCl 0. 5 ；K2HPO4 1. 0 ；MgSO4 0. 5 ；琼脂 20 ； pH 7. 0-7. 2 ；
种子培养基(g/L):玉米淀粉10;葡萄糖20;玉米浆20;黄豆饼粉10; KH2PO4 1.0； MgSO4 1. 0 ；CaCO3 20 ；pH 7. 0-7. 2 ；
发酵培养基(g/L):玉米淀粉30 ；葡萄糖50 ；玉米浆10 ；黄豆饼粉20 ；谷氨酸钠1. 0 ； FeCl3 0. 5 ； K2HPO4 1. 0 ；CaCO3 2. 0 ；pH 7. 0-7. 2 ； 发酵步骤包括
(1)摇瓶发酵
每支培养好的新鲜斜面用10 ml无菌水洗下菌体，制成菌悬液。将Iml菌悬液接至种子培养基装量为12%的250ml三角瓶中，28 °C温度条件下，在摇床上以180r/min的转速振荡培养48 h，制得摇瓶种子液；按10%接种量将培养好的摇瓶种子液接至发酵培养基装量为12%的250 ml三角瓶中，28 °C温度条件下以180r/min的转速振荡培养168 h ；
(2)100-L罐上的发酵
以40 ml无菌水洗下4支斜面培养基上的菌体，制成菌悬液，将菌悬液接至种子培养基装量为30%的1000ml三角瓶中，28 ！温度条件下在摇床上以180r/min的转速振荡培养48 h;将摇瓶种子液3000 ml接种值装量为60 L/100-L罐的发酵培养基中，培养条件为罐温 28 °C、罐压0. 04-0. 05 MPa,通过搅拌转速和通气量的调节，将发酵过程的溶氧控制在30% 左右；
(3)30-m3罐上 的发酵
以40 ml无菌水洗下4支斜面培养基上的菌体，制成菌悬液，将菌悬液接至种子培养基装量为30%的1000 ml三角瓶中，28 ！温度条件下在摇床上以180r/min的转速振荡培养 48 h，制得一级种子；将一级种子液1200 ml接种至装量为70 L/100-L罐的种子培养基中， 在罐温28 "C、罐压0.04-0. 05 Mpa、通气比0. 8 v/v/min、搅拌转速300 rpm下，培养36 h 制得二级种子；70 L 二级种子液移至装量为650 L/1-m3罐的种子培养基中，在罐温28 °C、 罐压0.04-0. 05 Mpa、通气比0.8 v/v/min、搅拌转速200 rpm下，培养30 h制得三级种子; 最后将700 L三级种子液移入30-m3发酵罐上的发酵培养基中；在发酵过程中，罐温和罐压分别控制在28 ！和0. 04-0. 05 Mpa，通过搅拌转速和通气量的调节将溶氧控制在30%左右，168 h结束发酵。本发明所述的阿卡波糖简易发酵方法，首先在摇瓶和100-L发酵罐上，采用游动放线菌Ucii/^/^^M·^)或其他同属种菌种研究其分批补料发酵产阿卡波糖的碳源控制策略，结果表明补料阶段的总糖控制浓度，尤其是麦芽糖和葡萄糖的浓度对阿卡波糖的合成具有显著的影响。基于此，筛选出总糖和还原糖(麦芽糖和葡萄糖)这两个关键参数作为放大因子，成功实现了阿卡波糖从100-L罐到30-m3罐的工业化发酵放大。
下面根据附图和实施例对本发明作进一步详细说明。图1是在30-m3罐上阿卡波糖发酵过程典型的参数变化趋势图。
具体实施例方式阿卡波糖的合成途径表明，麦芽糖和葡萄糖为阿卡波糖的前体，它们直接结合到阿卡波糖的分子结构中。因此，麦芽糖和葡萄糖的配比在阿卡波糖的合成过程中具有重要的作用。为了探索麦芽糖和葡萄糖配比对游动放线菌(^^//^/^^然印)发酵产阿卡波糖的影响，以麦芽糖和葡萄糖作为补料培养基的碳源，采用七种不同的配比，其质量比分别为 1:1、1:0、2:1、3:1、4:1、5:1和0:1。在摇瓶分批补料发酵过程中，每个摇瓶分别在第72、 96和120 h补加以上配比的补料培养基，使得每次补加的总糖浓度达30 g/L，具体的实验结果及其方差分析结果如表1所示。表1补料培养基中麦芽糖和葡萄糖的配比对阿卡波糖发酵的影响
权利要求
1.一种阿卡波糖简易的发酵方法，采用游动放线菌(^^//70/^3/7^577)或同属种的菌种为发酵菌种，采用的培养基包括斜面培养基、种子培养基和发酵培养基，发酵步骤包括(1)摇瓶发酵每支培养好的新鲜斜面用10 ml无菌水洗下菌体，制成菌悬液，将Iml菌悬液接至种子培养基装量为12%的250ml三角瓶中，28 °C温度条件下，在摇床上以180r/min的转速振荡培养48 h，制得摇瓶种子液；按10%接种量将培养好的摇瓶种子液接至发酵培养基装量为 12%的250 ml三角瓶中，28 °C温度条件下以180r/min的转速振荡培养168 h ；(2)100-L罐上的发酵以40 ml无菌水洗下4支斜面培养基上的菌体，制成菌悬液，将菌悬液接至种子培养基装量为30%的IOOOml三角瓶中，28 ！温度条件下在摇床上以180r/min的转速振荡培养48 h;将摇瓶种子液3000 ml接种值装量为60 L/100-L罐的发酵培养基中，培养条件为罐温 28 °C、罐压0. 04-0. 05 MPa,通过搅拌转速和通气量的调节，将发酵过程的溶氧控制在30% 左右；(3)30-m3罐上的发酵以40 ml无菌水洗下4支斜面培养基上的菌体，制成菌悬液，将菌悬液接至种子培养基装量为30%的1000 ml三角瓶中，28 ！温度条件下在摇床上以180r/min的转速振荡培养 48 h，制得一级种子；将一级种子液1200 ml接种至装量为70 L/100-L罐的种子培养基中， 在罐温沘"C、罐压0.04-0. 05 Mpa、通气比0. 8 v/v/min、搅拌转速300 rpm下，培养36 h 制得二级种子；70 L 二级种子液移至装量为650 L/1-m3罐的种子培养基中，在罐温观°C、 罐压0.04-0. 05 Mpa、通气比0.8 v/v/min、搅拌转速200 rpm下，培养30 h制得三级种子; 最后将700 L三级种子液移入30-m3发酵罐上的发酵培养基中；在发酵过程中，罐温和罐压分别控制在28 ！和0. 04-0. 05 Mpa，通过搅拌转速和通气量的调节将溶氧控制在30%左右，168 h结束发酵。
2.根据权利要求1所述的阿卡波糖简易的发酵方法，其特征在于，斜面培养基(g/L) 葡萄糖 20 ；蛋白胨 5 ；KCl 0. 5 ；K2HPO4 1. 0 ；MgSO4 0. 5 ；琼脂 20 ；pH 7. 0-7. 2。
3.根据权利要求1所述的阿卡波糖简易的发酵方法，其特征在于，种子培养基(g/L) 玉米淀粉10;葡萄糖20;玉米浆20;黄豆饼粉10; KH2PO4 1. 0 ；MgSO4 1. 0 ；CaCO3 20; pH 7. 0-7. 2。
4.根据权利要求1所述的阿卡波糖简易的发酵方法，其特征在于，发酵培养基(g/L) 玉米淀粉30;葡萄糖50 ；玉米浆10 ；黄豆饼粉20;谷氨酸钠1.0;FeCl3 0.5; K2HPO4 1. 0 ；CaCO3 2. 0 ；pH 7. 0-7. 2。
全文摘要
一种阿卡波糖简易的发酵方法，采用游动放线菌(Actinoplanessp)或同属种的菌种为发酵菌种，发酵步骤包括(1)摇瓶发酵，(2)100-L罐上的发酵，(3)30-m3罐上的发酵。本发明所述的阿卡波糖简易发酵方法，首先在摇瓶和100-L发酵罐上，采用游动放线菌(Actinoplanessp)或其他同属种菌种研究其分批补料发酵产阿卡波糖的碳源控制策略，结果表明补料阶段的总糖控制浓度，尤其是麦芽糖和葡萄糖的浓度对阿卡波糖的合成具有显著的影响。基于此，筛选出总糖和还原糖(麦芽糖和葡萄糖)这两个关键参数作为放大因子，成功实现了阿卡波糖从100-L罐到30-m3罐的工业化发酵放大。
文档编号C12R1/045GK102220396SQ20111010586
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月27日 优先权日2011年4月27日
发明者李昆太, 程新 申请人:江西农业大学