专利名称：一种植物乳杆菌生物转化共轭亚油酸的方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌生物转化共轭亚油酸的方法。
背景技术：
共轭亚油酸(Conjugated Linoleic Acid，简称CLA)是一系列含有共轭双键、 具有位置和构象异构的十八碳二烯酸的总称，是必需脂肪酸亚油酸(Linoleic acid，简称LA)的一组异构体。人类和动物中最主要的异构体是顺_9，反-11-十八碳二烯酸(c9， tll-CLA)，被命名为瘤胃酸(rumenicacid)。CLA的合成主要有化学法和微生物法两种。根据反应机理的不同，化学方法可分为碳负离子历程、碳正离子历程、自由基历程、加成消除历程、VIII族金属或其化合物催化的共轭化等。但是，化学合成法不可避免地产生一系列CLA异构体混合物、饱和或不饱和脂肪酸；虽然操作成本较低，但分离效率差，需要多次重复操作，活性CLA提纯工艺繁琐。微生物法合成CLA相比化学法具有很多优势微生物培养灵活，不需要高温高压环境；产物分离方便，通常微生物只专一合成特定的具有生理活性的CLA异构体。CLA合成菌株包括瘤胃菌、乳酸菌、丙酸菌等三大类。瘤胃菌需要严格厌氧培养，且合成的异构体种类复杂，限制了其在工业生产上的应用；乳酸菌是比较理想的菌种，乳酸菌含有亚油酸异构酶可以将LA转化为具有生物活性的CLA异构体，且产物分离相对简单，已得到广泛应用。研究表明，CLA具有抗癌(结肠癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌)、提高细胞免疫、降低体脂含量、预防糖尿病的发生以及抑制动脉粥样硬化等诸多生理功能。基于此，CLA已被应用于药品、保健品、功能食品、化妆品等领域。关于CLA应用于药品的临床报道较少，但CLA 具有减肥、抗癌、抗动脉粥样硬化等作用已被证实，相信不久的将来CLA—定会成为临床治疗的佳品。目前，市场上已出现多种CLA保健品，作为营养增强剂或者减肥食品吸引了大量顾客。由此可见，作为近二十年来发现的最重要的天然活性脂肪酸之一，CLA具有广阔的应用前景，对人类健康意义重大。
发明内容
本发明提供了一种植物乳杆菌生物转化共轭亚油酸的方法，产物分离方便，共轭亚油酸的产量较高。一种植物乳杆菌生物转化共轭亚油酸的方法，包括将植物乳杆菌(LactobacillusρIantarum)CGMCC NO. 3782接种到含亚油酸的MRS 培养基中，预培养后冷冻离心获得静息细胞，将所述静息细胞接种到含3. 0 25mg/ml亚油酸的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，振荡培养84h 120h。本发明采用的菌株为植物乳杆菌(LactcAacillus plantarum) 1ρ15-2_1，保藏于位于北京市朝阳路北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，保藏日期为2010年4月27日，保藏号为CGMCC NO. 3782。该菌株的分离、纯化及鉴定方法已在中国专利申请201010251108. X中公开。LA对费氏丙酸菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌等产CLA的乳酸菌的生长有明显抑制作用，微生物为了消除LA对细胞的毒害作用，而将其转化为CLA，但是，LA浓度过高时，这一过程会受到抑制，无法完全进行，细菌也会因此而停止生长，采用离心获得静息细胞催化合成CLA可以很好地避免这一问题。由于静息细胞已停止生长，高浓度的LA不会对其产生影响，从而可以达到高产CLA的目的；静息细胞仍是一个完整的细胞反应体系，对反应条件的要求比亚油酸异构酶酶液低，有效避免了催化过程中辅酶再生的问题。所述的预培养温度为28 32°C，时间为20 30h。所述的MRS培养基中亚油酸的重量百分比浓度为0. 1 1%。所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为0. 1 0. 2mol/L, pH为5. 0 6. 0。所述静息细胞接种到柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中的浓度为0. ;3mg/mL。本发明的方法转化LA产生CLA，不需要高温高压环境，产物分离方便；采用离心获得静息细胞催化合成CLA，有效避免了 LA浓度过高时抑制细菌的生长，从而达到高产CLA的目的；静息细胞仍是一个完整的细胞反应体系，对反应条件的要求比亚油酸异构酶酶液低， 有效避免了催化过程中辅酶再生的问题。
图1是预培养方式对CLA产量影响的关系图；图2是贮存条件对CLA产量影响的关系图；图3是培养温度对CLA产量影响的关系图；图4是LA浓度对CLA产量影响的关系图。
具体实施例方式植物乳杆菌(LactcAacillus ρlantarum) 1ρ15-2_1已保藏于位于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2010年4月27日，保藏号为CGMCC NO. 3782。该菌株的分离、纯化及鉴定方法已在中国专利申请201010251108. X中公开。亚油酸的乳化配置吐温80-水溶液，121°C，灭菌20min。灭菌后加入适量亚油酸，混勻，冰水浴下超声波乳化分散(功率600W，工作k，间歇10s，20次)；之后用0. 22 μ m 无菌滤膜过滤。实施例1将植物乳杆菌(LactcAacillus plantarum) 1ρ15-2_1活化两次后，以接种量接种至300ml MRS液体培养基中，加入乳化后的亚油酸溶液，使得LA重量百分比浓度达 0. 5%, 30°C厌氧振荡培养(180r/min) 24h后，高速冷冻离心 5_20min(10000r/min,4°C )，收
集菌体，并用生理盐水洗涤三次，获得静息细胞。将静息细胞重悬于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0. 15mol/L, pH5. 5)中，使其浓度达到0. 3mg/mL,加入乳化后的底物LA，LA浓度达3mg/ml，30°C震荡培养(180r/min) 84h，通过下述方法检测计算CLA的产量，达到0. 32mg/ml，转化率为10%。采用紫外分光光度法进行检测，共轭亚油酸在233nm处有明显吸收峰，以正己烷为溶剂，将CLA标样配成不同浓度的溶液，以正己烷为参比，测定233nm处的吸光值，以CLA浓度(yg/ml)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。取发酵液5mL，转入大离心管中，每管发酵液中加入等体积(5mL)的氯仿，振荡混勻；每管发酵液中再加入两倍体积(IOmL)的正己烷振荡萃取CLA，涡旋振荡3 5min ； 3000g/min离心5min ；将上层正己烷层转至新的50mL离心管中，水洗两遍后，加入少量无水硫酸钠脱去萃取液中的水分和水溶性物质；高纯N2吹干正己烷，5mL正己烷溶解提取的脂肪酸，于233nm下测定吸光度，空白对照为同条件培养的缓冲液(添加同浓度LA)的正己烷提取液。LA转化率=等体积发酵液中CLA产量/等体积发酵液中LA添加量实施例2本发明还考察了不同预培养方式、不同静息细胞的贮存条件、不同的振荡培养温度以及不同的LA浓度对最终CLA产量的影响。(1)预培养方式对CLA产量的影响如图1所示，共设置了 6个预培养条件，分别为石蜡密封+不添加LA、石蜡密封+ 添加0. 5% LA、无石蜡密封+不添加LA、无石蜡密封+添加0. 5% LA、厌氧瓶培养+不添加 LA、厌氧瓶培养+添加0. 5 % LA,静息细胞细胞浓度0. 3mg/mL,柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液 (0. lmol/L, ρΗ6· 0)，反应温度30°C，转速180r/min,反应时间24h,柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中LA的浓度为0. 5mg/ml。从图1可以得出，厌氧瓶培养+添加0. 5% LA的预培养条件下，CLA产量最高，是其它预培养方式的5倍。采用石蜡液封或不加入石蜡，CLA的产量均很低。这是由于菌体培养过程是在180r/min的摇床中进行的，转速较快，石蜡会被搅散，发酵液仍然会大面积与空气接触，由此可见，氧气是制约CLA产量的关键因素。(2)贮存条件对CLA产量的影响为了考查贮存条件对CLA产量的影响，通过实施例1的方法离心获得静息细胞后， 并不立即使用，而是分别在4°C和-20°C条件下保存一定时间后，再用缓冲液溶解细胞，培养条件静息细胞浓度0. :3mg/mL，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0. lmol/L, pH6. 0)，反应温度 30°C，转速180r/min，反应时间Mh，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中LA的浓度为0. 5mg/ml。培养后测定其CLA产量。结果如图2所示，静息细胞在4°C和_20°C条件下保存2d内，产CLA能力变化较小； 15d内呈显著下降趋势，其中，-20°C条件下贮存时下降速度较缓；贮存30d后，贮存在4°C条件下的静息细胞的催化活性降至原来的16%，而贮存在_20°C条件下的静息细胞的催化活性降至不到原来的10%。该结果表明，静息细胞即使在严格非生长环境中保存，也应当在 2d内使用较好。(3)培养温度对CLA产量的影响为了考查培养温度对CLA产量的影响，将培养温度分别设为20°C、25°C、30°C、 35°C、40°C。将离心获得的静息细胞按0. 3mg/mL的浓度接种到在LA浓度为3. Omg/ml的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0. 15mol/L，pH5.5)中培养84h，结果如图3所示，当培养温度为 30°C时，CLA产量达到最大值0. 32mg/ml，温度过高或过低都不利于CLA的合成。(4) LA浓度对CLA产量的影响为了考查LA浓度对CLA产量的影响，在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中从3mg/ml到25mg/ml (3、5、10、15、20、25mg/ml)分别加入LA，在30°C条件下，培养120h，结果如图4所示，随着LA浓度的增加，CLA的产量逐渐增加，当添加LA浓度为25mg/ml时，缓冲液中CLA 含量达到1.02mg/ml。
权利要求
1.一种植物乳杆菌生物转化共轭亚油酸的方法，包括将植物乳杆菌(Lactobacillus ρIantarum)CGMCC NO. 3782接种到含亚油酸的MRS培养基中，预培养后冷冻离心获得静息细胞，将所述静息细胞接种到含3. 0 25mg/ml亚油酸的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，振荡培养84h 120h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的预培养温度为观 32°C，时间为 20 30h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的MRS培养基中亚油酸的重量百分比浓度为0. 1 1%。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为 0. 1 0. 2mol/L, pH 为 5. 0 6. 0。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述静息细胞接种到柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中的浓度为0. ;3mg/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述振荡培养的温度为30°C。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的预培养为厌氧培养。
全文摘要
本发明公开了一种植物乳杆菌生物转化共轭亚油酸的方法，包括将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC NO.3782接种到含亚油酸的MRS培养基中，预培养后冷冻离心获得静息细胞，将所述静息细胞接种到含3.0～25mg/ml亚油酸的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，振荡培养84h～120h。本发明的方法转化LA产生CLA，不需要高温高压环境，产物分离方便；采用离心获得静息细胞催化合成CLA，有效避免了LA浓度过高时抑制细菌的生长，从而达到高产CLA的目的。
文档编号C12R1/25GK102206687SQ201110105610
公开日2011年10月5日 申请日期2011年4月27日 优先权日2011年4月27日
发明者何国庆, 刘佩, 周倩, 阮晖 申请人:浙江大学