专利名称：一种适用于鲜胚运输的早期胚胎密闭培养装置及培养方法
技术领域：
本发明属于动物胚胎工程领域，涉及一种哺乳动物早期胚胎体外培养装置及培养方法，可用于哺乳动物附植前胚胎的体外培养和远距离鲜胚运输。
背景技术：
哺乳动物早期胚胎体外培养技术已基本趋于成熟。目前，胚胎培养主要采用开放培养系统进行研究，这一系统主要包括两类培养方法。一类培养方法是将胚胎置入开放式培养器皿的胚胎培养液内，放入二氧化碳培养箱或三气培养箱进行培养，其主要特点是培养箱可自动控制胚胎发育所需的温度条件及气相条件，而稳定地提供给培养胚胎发育代谢所需的O2和维持PH所需的CO2条件。根据培养器皿的不同，可主要分为大体积液体(大液体)培养法、小液体体积(微滴)培养法、微孔培养法、玻璃输卵管培养法等。由于这类胚胎培养方法需要培养箱及配套的气体压力容器，而且使用开放培养器皿，无法在培养的同时进行运输，仅适用于科研或教学实验室使用。另一类培养方法是将胚胎置入开放式培养器皿的胚胎培养液内，再将含胚胎的培养器皿放入一个密封的小环境中(如可密封的塑料袋或密闭培养盒等)，在培养前预先向密封环境中充入已知成分的混合气体(如一定比例的02、C02、&混合标准气或肺气等)作为气相支持。其主要特点是利用充气的密闭环境提供胚胎发育所需的气相条件，其温度条件只需要由普通的恒温箱提供，即可支持早期胚胎的体外发育。这类胚胎培养方法不需要培养箱及配套的气体压力容器，所以适于在生产条件下进行胚胎培养。而使用的培养器皿仍是开放培养器皿，仍无法在培养的同时进行运输。
发明内容
本发明提供一种可用于胚胎培养并适于运输的密闭培养装置及培养方法。在胚胎培养前预先使用一定比例的o2、co2j2混合组成的标准气对胚胎培养液进行缓慢充气处理， 然后将充气培养液与胚胎一同加入小容积管状容器中，并迅速利用管状容器的盖子和石蜡进行密封，达到气密和液密。然后将装有充气培养液和胚胎的容器置于一个便携式恒温箱中，使用市电、电池或车载电源给恒温箱供电以维持恒温箱的温度条件，可在数十小时内支持胚胎的体外发育。这种胚胎培养装置及培养方法的特点是由溶入胚胎培养液的气体提供胚胎发育代谢所需的α和维持PH所需的Co2，胚胎发育所需的温度条件则由便携式恒温箱提供，从而维持胚胎发育。这种胚胎培养方法不需要培养箱及配套的气体压力容器，所以适于在生产条件下或特定实验条件下进行胚胎培养；使用的培养容器可以保持胚胎培养体系的气密和液密，所使用的便携式恒温箱可使用电池或车载电源供电，从而可实现在培养的同时进行运输。本发明所述胚胎体外培养装置包括恒温箱1、培养容器支架2、小容积管状培养容器3。所述恒温箱在市电、电池或车载电源支持下，应提供恒定的温度环境。所述培养容器支架主要用于运输过程中稳定安放胚胎培养容器，带有与所述小容积管状培养器3大小相当的孔槽。所述小容积管状培养容器3可以是PCR管，也可以是离心管或其他小型管状容器，在加入充气胚胎培养液和胚胎后需进行密封，密封后的容器内部与外界环境在液相和气相方面均无沟通。本发明所述的胚胎体外培养方法，其技术方案是在培养前用气体比例为5% O2, 5% CO2和90% N2的高纯标准气对胚胎培养液进行缓慢充气处理，用灭菌的小容积管状容器(以容积为200μ L的PCR管为例)作为胚胎培养容器。具体操作方法为胚胎培养前池开始，使用上述标准气压力容器供应标准气，并经过二级减压后以低压、缓慢地进行培养液充气(培养液装至分装瓶的1/2高度以下，合适的充气压力和速度以充气培养液内连续冒出气泡，并且气泡不溢出瓶口为度)。培养液充气管采用灭菌玻璃管，充气时将玻璃管伸入培养液的底部；充气玻璃管与气体减压器之间用灭菌硅胶管或乳胶管连接；在连接管道上安装2个气体滤器二次过滤除菌；连续充气直到培养液和胚胎加入培养容器时为止。胚胎培养时，首先用充气胚胎培养液润洗PCR管2-5次，然后向管中加满充气培养液，并立即加入胚胎、盖紧PCR管盖并快速翻转PCR管，将管口缝隙部位浸入熔融的低熔点石蜡中并迅速离开，对PCR管进行二次封口，以保证胚胎培养环境的气密和液密。然后将PCR管安放于便携式恒温箱中的培养容器支架上，恒温箱已提前恒温至培养温度。闭合恒温箱盖后继续维持培养温度，进行胚胎培养，并在培养过程中完成鲜胚的运输。另外，在恒温箱底部放置湿润的纱布以提供箱内的湿度环境，减少恒温箱加热时的过冲温度对胚胎发育造成不利的影响，同时可缓冲运输过程中对培养容器支架造成的震动。放置湿润纱布多少以胚胎培养和运输结束时纱布仍能保持—定的湿度为度。湿润纱布应与恒温箱一同预热。本发明的应用效果应该达到采用的小容积管状培养容器的体积大小与培养或运输的胚胎数量比例适当；培养容器内充气培养液体积与容积的容积相当，以防止运输过程中液体晃动对胚胎造成的液体剪切力的影响；充气培养液的营养条件与气相条件可满足胚胎在数十小时内的发育代谢需求；培养容器应做到气密和液密，不会出现培养容器内液体或气体的逸出；可在保持鲜胚发育能力的同时完成胚胎的运输；可应用于生产条件下的胚胎培养和鲜胚运输，降低生产成本、提高生产效率。
图1为本发明胚胎培养装置示意简图。图2为图1中培养容器支架的局部放大示意图。图3-A为4细胞小鼠胚胎密闭培养1 后体外发育图片Q00X)。图3-B为4细胞小鼠胚胎微滴法培养12h后体外发育图片Q00X)。图4-A为4细胞小鼠胚胎密闭培养3 后体外发育图片Q00X)。图4-B为4细胞小鼠胚胎微滴法培养3 后体外发育图片Q00X)。图5-A为4细胞小鼠胚胎密闭培养60h后体外发育图片Q00X)。图5-B为4细胞小鼠胚胎微滴法培养60h后体外发育图片Q00X)。图6-A为4细胞小鼠胚胎密闭培养84h后体外发育图片Q00X)。图6-B为4细胞小鼠胚胎微滴法培养84h后体外发育图片Q00X)。图7-A为小鼠4细胞胚胎密闭培养84h后囊胚细胞凋亡图片(标尺=40 μ m)。图7-B为小鼠4细胞胚胎微滴法培养84h后囊胚细胞凋亡图片(标尺=40 μ m)。
具体实施例方式本发明所提供的哺乳动物早期胚胎体外培养装置及培养方法，使早期胚胎在培养过程中不依赖二氧化碳培养箱或三气培养箱以及压力气体提供气相支持，培养容器简单轻便、便于携带，可在胚胎培养过程中完成鲜胚运输。本发明用小容积管状容器(以 200 μ LPCR管为例)作为胚胎培养容器，用气体比例为5% 02，5% CO2和90% N2的高纯标准气对胚胎培养液进行充气处理，将充气培养液用于胚胎培养，在向PCR管中加入充气培养液和胚胎后用熔融的低熔点石蜡对管口进行密封，组成胚胎密闭培养体系，使早期胚胎发育所需的营养条件与气相条件均由此密闭培养体系提供。胚胎发育所需温度条件由便携式恒温箱提供。实施例1小鼠4细胞胚胎的培养一、小鼠的超排处理及胚胎采集1.小鼠超排处理主要试验材料昆白系小鼠(第四军医大学实验动物中心提供)；孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin, PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)(宁波第二激素厂)。小鼠超排方法选择阴道口黏膜淡粉红色的雌性小鼠(25 ^g)，于超排当天 (Od) 15:00每只小鼠腹腔注射PMSG 10IU,48hB (2d)腹腔注射hCGlOIU，随后将超排雌鼠立即与雄鼠1 1合笼，于次日(3d)7:30观察其阴门栓形成情况，有阴门栓形成者假定为受孕母鼠，可用于胚胎收集。2.小鼠4细胞胚胎的采集主要试验材料胚胎操作液，改良杜氏磷酸盐缓冲液(modified Dulbecco' sphosphate buffer solution，mDPBS)，按照《小鼠胚胎操作实验手册第三版》 (Nagy A，et al. 2005)配方配制，所用试剂均为Sigma-Aldrich(USA)公司产品，并添加5% 胎牛血清(Invitrogen, 10099-141)。小鼠4细胞胚胎采集方法于注射hCG后57h，颈脱臼法处死假定受孕母鼠，用 75%酒精喷洒下腹进行消毒。在下腹中剪开、口，用两手拇指和食指捏紧切口两侧皮肤分别向头部和尾部牵拉，直到充分暴露腹壁。剪开腹壁组织，翻开内脏、暴露两侧子宫角，沿子宫角牵拉输卵管和卵巢。用眼科剪分别剪段宫管接合部、分离输卵管。将输卵管转移到加有胚胎操作液的表面皿中，置于实体显微镜载物台上，镜下用眼科异物针仔细将输卵管向两侧撕开使输卵管中胚胎游离到胚胎操作液中，用较细的吸卵管检出4细胞胚胎，转移到加有胚胎操作液的检卵杯内，用胚胎操作液清洗3次。镜下鉴定质量合格者用于培养。二、小鼠4细胞胚胎的体外培养主要试验材料小鼠胚胎培养液((观液)，按照《小鼠胚胎操作实验手册第三版》 (Nagy A,et al. 2005)配方配制，所用试剂均为Sigma-Aldrich公司产品，并添加10%胎牛血清(Invitrogen, 10099-141) ο高纯标准气(气体比例为5% O2, 5% CO2,90% N2,北京龙辉京城气体有限公司生产)，气体细菌滤器(Axygen)，PCR管(Axygen)。小鼠胚胎培养方法胚胎密闭培养组于胚胎培养前池开始，对培养液进行标准气充气处理。胚胎培
5养时，用充气胚胎培养液润洗PCR管3次后向管中加满充气培养液，并立即加入胚胎、盖紧 PCR管盖并用熔融的低熔点石蜡二次封口。然后将PCR管放于已预热的便携式恒温箱中的培养容器支架上，闭合恒温箱盖后继续维持培养温度，进行胚胎培养。在恒温箱底部放置湿润的纱布以提供箱内的湿度环境，减少恒温箱加热时的过冲温度对胚胎发育造成不利的影响。胚胎微滴培养组胚胎培养前池，在35mm培养皿内制作50 μ L胚胎培养液微滴， 上覆石蜡油，置入CO2培养箱预平衡，培养前将胚胎移入胚胎培养液微滴，培养皿放入饱和湿度，37°C，体积分数5% C02的培养箱中进行培养。分别于培养开始后的iai，3^!，60h和84h时终止培养，回收胚胎并统计胚胎发育率。结果表明，密闭培养组小鼠4细胞胚胎在培养的各个时间点的发育率与微滴培养组发育规律基本一致。培养12h时，发育到8细胞及以上阶段的胚胎发育率分别为 81. 60 士6. 08和86. 67 士 12.22 (图3-A，B)；培养36h时，发育到桑葚胚及以上阶段的胚胎发育率为75. 60士5. 42和83. 67士8. 50 (图4-A，B)；培养60h时，发育到囊胚及以上阶段的胚胎发育率为83. 46士2. 13和91. 00士4. 58 (图5-A，B)；培养84h时，孵化胚发育率为 62. 17 士 8. 42和55. 60 士 3. 93 (图6-A，B)。实施例2小鼠4细胞胚胎培养84h后囊胚细胞计数与胚胎细胞凋亡情况一、囊胚细胞计数将密闭培养或微滴培养84h的囊胚用4%多聚甲醛(Sigma-Aldrich)磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)固定 lh，用 PBS 清洗 3 次，在含有 0· 4 μ g/mL RNase A (Fermentas)和 10 μ g/mL Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich)的 PBS 中避光染色 20min，用 PBS洗3次后，将胚胎逐个移至载玻片上，滴加抗荧光衰减封片剂(碧云天)并加盖盖玻片后，在倒置荧光显微镜(Olympus)下计数囊胚总细胞数。二、细胞凋亡检测将密闭培养或微滴培养84h后的囊胚用含4%多聚甲醛的PBS固定Ih后，将胚胎置于含3% H2O2的甲醇溶液中，室温封闭lOmin，用含0. 1% Triton X-100的PBS冰上处理 2min，)|f 胚月台移入含 5μ LEnzyme Solution 禾口 45 μ L LabelSolution (In Situ Cell Death Detection Kit, Roche)的混合液中，37°C避光孵育60min (此后所有的操作都在避光的环境中进行)，Hoechst 33342染核、封片(封片步骤与囊胚细胞计数中封片步骤相同)，在进行每一步操作前均需使用PBS清洗胚胎3次。将胚胎压片置于倒置荧光显微镜下观察，胚胎细胞的细胞核呈蓝色，凋亡的细胞出现亮绿色荧光点。结果显示，密闭培养组与微滴培养组胚胎在体外培养84h后囊胚细胞总数差异不显著(81. 08士 10. 99和85. 08士8. 83，P > 0. 05)。两组囊胚细胞凋亡率分别为3. 00士2. 45 和 1. 40 士 1. 63，亦无显著差异(P > 0. 05)(图 7-A，B)。实施例3密闭培养与微滴培养囊胚移植后妊娠率一、供体母鼠超数排卵与受体母鼠同期发情处理对供体母鼠与受体母鼠进行超数排卵与同期发情处理，处理方法同实施例1的母鼠超排方法。在处理母鼠注射hCG后，供体母鼠与配种公鼠(1 1)同笼过夜，受体母鼠与输精管结扎公鼠(1 1)同笼过夜。次日早7:30观察阴门栓形成情况，供体母鼠有阴门栓者假定为受孕母鼠，受体母鼠有阴门栓者假定为可移植受体。二、4细胞胚胎的采集与体外培养于hCG后Wh处死供体母鼠，采集输卵管4细胞胚胎(方法同实施例1)，密闭培养或微滴培养60h时，选取发育正常的囊胚以备移植。三、胚胎移植与结果观察将收集到的正常发育囊胚，以手术方法移植到黄体发育正常的受体母鼠子宫角内，每只受体母鼠每侧子宫角各移植7枚囊胚，以检栓时为交配后0. 5天(0. 5day post coitus, 0. 5dpc)，在8. 5dpc断颈放血法处死受体母鼠，分离子宫并检查移植胚胎的植入情况。结果显示，密闭培养组囊胚移植受体10只，移植总胚胎数140枚，妊娠4只，妊娠率40% ；微滴培养组移植受体12只，移植总胚胎数168枚，妊娠5只，妊娠率41. 67%。二者妊娠率差异不显著(P < 0. 05)。
权利要求
1.一种胚胎培养装置，包括恒温培养箱(1)、培养容器支架( 和小容积管状培养容器(3)，所述培养容器支架( 置恒温箱(1)内，其上设有孔径与所述小容积管状培养容器 (3)相符的孔槽，所述小容积管状培养容器C3)置所述培养容器支架的孔槽内，所述小容积管状培养容器(3)内装有充气胚胎培养液和发育中胚胎。
2.根据权利要求1所述的胚胎培养装置，其中所述小容积管状培养容器C3)是带盖的管状容器。
3.根据权利要求2所述的胚胎培养装置，其中所述小容积管状培养容器C3)是经石蜡对管身与管盖间的接缝进行密封的。
4.根据权利要求1至3中任意一权利要求所述的胚胎培养装置，其中所述小容积管状培养容器C3)是PCR管或离心管。
5.一种体外培养胚胎的方法，包括用经灭菌处理的小容积管状容器作为胚胎培养容器，向所述胚胎培养容器内加入充气培养液，并快速移入胚胎，盖上管盖后，对管状胚胎培养容器进行密封处理，将密封好的胚胎培养容器放入胚胎培养容器支架上，置恒温箱中，进行胚胎培养。
6.根据权利要求5所述的方法，所述培养方法进一步为用经灭菌处理的小容积管状容器作为胚胎培养容器，所述胚胎培养容器事先用经含有5% 02,5% CO2和90% N2的标准气体处理的培养液润洗2-5次后，向管中加满充气培养液，并快速移入胚胎，盖上管盖后， 管状培养器用石蜡对管身与管盖间的缝隙进行密封处理，将密封好的胚胎培养容器放入培养容器支架上，置37°C恒温箱中，进行胚胎培养。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述培养液充气处理方式为在胚胎培养2小时，培养液使用气体比例为5% O2,5% CO2和90% N2的高纯标准气体，二级减压、缓慢充气， 减压气体与培养液充气管的连接管道上安装气体细菌滤器对气体进行二次过滤除菌，连续充气2小时，即得。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述小容积管状培养容器为PCR管或离心管。
9.根据权利要求5或6所述的方法，在将所述培养容器支架放置到所述恒温箱之前，进一步包括在恒温培养箱预热前放入湿润纱布，并与恒温培养箱一起预热，然后将放有胚胎培养容器的培养容器支架放在该湿润纱布上，关好恒温箱，即可进行培养。
10.根据权利要求5或6所述的方法，胚胎的最佳培养密度应为每2 4μL培养液体积支持1枚胚胎的体外发育。
全文摘要
本发明涉及一种胚胎培养装置及胚胎培养方法，所述胚胎培养装置包括便携式恒温箱(1)、培养容器支架(2)和小容积管状容器(3)。所述培养容器支架(2)置于恒温箱(1)内，其上设有孔径与所述小容积管状容器(3)相同的孔槽，所述小容积管状容器(3)置所述培养容器支架的孔槽内，所述小容积管状容器(3)内装有胚胎培养液和发育中的胚胎。用该培养装置进行胚胎培养，是在胚胎培养前用标准气对培养液进行充气处理2h，然后将充气培养液和胚胎一同加入到一个小体积的培养容器中，迅速加盖并密封后置于便携式恒温箱中进行胚胎培养，充气培养液的体积应与小体积管状容器的容积相同。培养箱中预先置有湿润纱布以提供湿度环境。这种装置及方法可用于胚胎培养和运输。
文档编号C12M3/00GK102242063SQ20111010552
公开日2011年11月16日 申请日期2011年4月26日 优先权日2011年4月26日
发明者刘洁, 曹宇静, 马保华 申请人:西北农林科技大学