专利名称：水稻类凝集素激酶基因启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种水稻类凝集素激酶基因启动子的分离鉴定和应用。该启动子被命名为LecRKP(即Receptor Kinase Promoter), 是水稻组织特异表达启动子。将其应用于研究基因在特异组织表达，特别是将其用于研究重要作物基因的遗传转化，达到优化品种的目的。
背景技术：
水稻是目前农业生产和科学研究的热点植物，在完成水稻全基因组计划之后，其功能基因组的研究得到越来越多的广泛关注，特别是对一些调控水稻重要农业性状基因的研究日益受到研究人员的重视。植物类受体激酶(LRK)基因是植物中最重要的基因家族之一，它编码的蛋白具有胞外受体结构域和胞内激酶结构域，目前发现该家族几乎参与植物的生长发育、抗病、 抗逆等各个生命活动过程。类凝集素受体(LecRK)基因是该基因家族中的重要一员，它广 S^^iiIUΦ (Bouwmeester ^,2009 Arabidopsis L-type lectin receptor kinases: phylogeny, classi cation, and expression pro les. J. Exp. Bot. 60: 4383-4396)。第一个LecRK基因Ath. Iecrkl由Herve等从拟南芥中分离得到(Herve等， 1996 Characterization of an Arabidopsis thaliana gene that de nes a new class of putative plant receptor kinases with an extracellular lectin-like domain. J Mol Biol 258:778-788)。通过对水稻全基因组比较学研究，人们预计在水稻中该类基 13至少存在 103 Shiu 等，2004 Comparative analysis of the receptor-like kinase family in arabidopsis and rice. Plant Cell 16: 1220-1234)。然而,迄今为止,人们只克隆得到一个该类基因/^-必(Chen 等，2006 A B-Iectin receptor kinase gene conferring rice blast resistance. Plant J 46 :794_804)。胃禾143 ^!; ]+ 能的研究尚未报道，由其是其作用方式尚不清楚。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水稻类凝集素激酶基因启动子，其是具有组织特异性表达的植物内源启动子。本发明的另一目的在于提供该启动子在制备转基因植物以及改良植物品种的应用。本发明启动子来源于籼稻B5的基因组。通过分离水稻类凝集素激酶基因UecRlO 的启动子(LecRKP，即LecRK Promoter),经研究发现，该启动子具有组织表达特异性。本发明启动子的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，序列全长2579个碱基。根据植物顺式调控元件数据库(PLACE)的搜索，本发明所提供的启动子区域含有多个组织特异性的顺式作用元件(如图1所示)。其中在152-156和2468-M72位碱基是种子萌发时特异表达的顺势作用元件AS-1，在1510-1516位碱基含有特异调控种子萌发的顺式调控元件 RY-element,在 27-31，56-60，757-761，2106-2110 和 2221-2225 位碱基含有抗病反应应答元件OsBIHDI，在1031-1036和2182-2187位碱基含有受病原菌诱导上调的顺式作用元件GT-I，在1492-1498和1554-1560位碱基也存在受病原菌诱导上调的顺式作用元件 GCC-box。本发明技术人员应当理解根据SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，对其替换、 缺失和/或增加一个或几个核苷酸，获得具有相同功能的核苷酸序列，例如，在非应答原件或作用原件，替换一个或几个碱基，将13M或2508位的T替换为C，或1630位的 C 替换成 T (Yamaguchi-Shinozaki 等，1993 Arabidopsis DNA encoding two desiccation-responsive rd29 genes. Plant Physiol 101:1119-1120)。本领域技术人员还可以根据SEQ ID No. 1的序列获得具有控制基因时空特异表达的DNA功能片段，例如SEQ ID No. 1的第152 第M72之间的片段。因此，本发明所述的启动子还包括SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列经替换、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，且具有相同功能的核苷酸序列；以及由SEQ ID No. 1产生的具有控制基因时空特异表达的DNA功能片段。本领域技术人员可以将本发明启动子用于构建组织特异表达的表达载体。此外还可以将目的基因可操作地连接到本发明的启动子之下，构建得到表达盒，进一步可将该表达盒导入植物表达载体，获得组织特异表达的重组表达载体。因此，本发明还包括由上述启动子构建的表达盒，以及含有上述启动子或表达盒的表达载体或重组表达载体。本发明启动子可以用于制备转基因植物。比如，通过农杆菌介导、基因枪法以及花粉管通道等方式获得转基因植物。从而可以通过引入重要的农艺性状基因，培育出高效特异表达的植株，从而达到改良品种的目的，例如引入抗白叶枯病或者抗稻瘟病基因，用来提高植物在芽期的抗病能力。在本发明实施例中，利用所述启动子LecRKP构建成得到植物表达载体 pCAMBIA1381z-lecRKP (如图2所示)，通过农杆菌介导的遗传转化方法将所述载体转化水稻品种，可以在植物的幼芽和幼根中观察到报告基因GUS的表达(如图3所示)。本发明的优点和效果
1、本发明的启动子为组织特异表达，可以用于基因在植株幼芽和幼根中的特异表达的研究。2、本发明的启动子与植物的抗病相关，可以用于提高植物抗病反应的研究。
图1.启动子序列，加粗下划线表示的碱基是种子萌发时在根和芽中特异表达的顺式作用元件AS-1，加粗波浪线标记的碱基表示的是种子萌发时特异调控表达的顺式调控元件RY-element，方框内加粗的部分为抗病反应应答元件OsBIHDI。方框内加粗斜体的部分是受病原菌诱导上调的顺式作用元件GT-1，方框内阴影部分为受病原菌诱导上调的顺式作用元件GCC-box。图2.半定量PCR检测ZecI基因在水稻各组织器官中的表达。actin为对照基因，1 胚芽鞘，2 胚芽，3 胚根，4 根，5 顶端分生组织，6 茎，7 叶，8 花。数据显示Zed 基因的只在幼芽、幼根和花中有表达。图3.表达载体pCAMBIA1381z-LeCRKP的物理图谱，该载体含有潮霉素抗性筛选基因，启动子被融合到GUS基因5’端非翻译区。图4. GUS活性检测，图A、B分别为启动子转基因阳性植株和对照受体材料，a代表胚芽，b代表胚根。如图显示，只在胚芽和胚根有微弱的蓝色。图5.半定量PCR检测ht^f受病原菌诱导表达。act in为对照基因，A 清水接种 48h，B 白叶枯病菌接种48h，C 清水接种48h，D 稻瘟病病菌接种48h。数据显示IecRK在接种白叶枯病菌和稻瘟病病菌后，表达量明显增加，而清水接种对IecRK的表达没影响。这些说明IecRKP确实受病原菌诱导。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1:启动子的分离和鉴定
在克隆水稻抗褐飞虱基因hcl时，发明人根据已测序的该基因所在药用野生稻的基因组BAC克隆6409的信息，进行分析。搜索该区段药用野生稻的基因组序列，并选取该基因的转录起始位点上游2. 51Λ的范围作为候选启动子区域进行PCR扩增。设计引物F (agtcggatccgggattttgggaaaatgtga)和 R (agtcggatcctgttctttgcttcaggctctt)，下划线表示保护碱基和添加的限制性酶切位点。首先利用引物以药用野生稻的基因组DNA (CTAB 法抽提，Zhang QF 等，1992, Genetic diversity and differentiation of indica and japonica rice detected by RFLP anaysis. Theor. App 1. Genet. 83，495—499)为 1^ 进行扩增，反应条件是94°C 5min ；94°C 30sec,55°C 45sec，72°C 3min，沘个循环；72°C 5min)。PCR产物回收后连入pGEM-T载体上，连接反应PCR产物1μ 1，pGEM-T 0. 5μ 1,1U T4 ligase，5X buffer 2μ 1，总10 μ 1体积，4°C连接过夜；连接产物与大肠杆菌T0P10混勻，42°C热激90s，加500 μ 1 LB，复苏45分钟，取200 μ 1涂于含氨苄霉素的LB平板，37°C， 过夜。筛选阳性克隆并测序。结果如SEQ ID No. 1所示。将该序列输入PLACE数据库，即给出了该启动子包含多个具有时空表达特异性以及抗病反应应答元件(图1)。实施例2 水稻类凝集素激酶基因LecRK的组织特异性表达
以受体材料合江19 (购自国家水稻种质资源库)为研究材料，对其不同生长阶段， 分别取胚芽鞘、幼芽、幼根、根、顶端分生组织、茎、叶和花2g立即封于液氮以便保存。用 Invitrogen 白勺 TRIzol ￠1 , RNA, Fermentas 白勺 RevertAid first strand cDNA synthesis kit 反转合成 cDNA 第一链。用 BIO-RAD MyCyler Thermal Cyler 对不同组织的类凝集素激酶基因hcl进行半定量PCR检测。PCR的IOul反应体系cDNA模板0. Iul, IXPCR buffer (Mg2+), dNTP ImM，弓丨物 2uM，Fermentas Taq DNA Polymerase 0.3U，力口灭菌水至 10ul。反应条件是94°C 4min ；94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 30 sec，40 个循环。以 actin为参照基因，同样PCR体系以及反应条件二8个循环。半定量结果显示ZecI基因只在幼芽、幼根和花中表达(图2)。实施例3 启动子表达活性鉴定
本发明的实施例构建启动子的GUS基因表达载体并转化到水稻品种，GUS显色观察该启动子的组织特异表达活性。具体操作如下
首先将实施例1中获得的含启动子的T载体扩大培养，抽提质粒，用BamHI酶切，反应体系总体积20 μ 1 含启动子的T载体约5 μ 1 (2 μ g)、1 X反应缓冲液、BamHI 0. 5U，混勻后37°C酶切过夜，琼脂糖凝胶电泳回收所需片段。pCAMBIA1381z载体酶切体系同上，试剂盒纯化回收。将启动子片段连入pCAMBIA1381z载体，反应体系同上(图3)。通过酶切验证正向连接的阳性克隆后电转农杆菌EHA105。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Hiei 等,1994, Efficient transformation of rice {Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T—DNA. Plant Journal 6:271-282)将基因组载体导入水稻品种。将获得的转基因阳性植株的幼根、幼芽分别进行⑶S活性染色(Lagarde D等， 1996, Tissue-specific expression of ArabidopsisAKTl gene is consistent with a role in K+ nutrition. Plant J. 9, 195 - 203)。染色后材料在体视镜观察拍照后。观察结果表明，确实在水稻幼根、幼芽中有微弱蓝色(图4)。表明LecRKP为组织特异性表达的启动子。实施例4 水稻类凝集素激酶基因IecRK受病原菌诱导表达
以受体材料H1493为研究材料，播种至两叶一心时分别接种白叶枯病菌和稻瘟病菌， 并以清水接种作为对照。48小时后，取材2g并封于液氮以便保存。用Transgen Biotech的 Transzol 11 ^ RNA, Fermentas ^ RevertAidTM first strand cDNA synthesis kit 反转合成cDNA第一链。用BIO-RAD MyCyler Thermal Cyler对不同处理的类凝集素激酶基因IecRK进行半定量PCR检测。PCR的IOul反应体系cDNA模板0. lul, IXPCR buffer (Mg2+)，dNTP ImM，弓丨物 2uM，Fermentas Taq DNA Polymerase 0. 3U，力口灭菌水至 IOul。反应条件是94°C 4min ；94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 30 sec，30 个循环。以 actin 为参照基因，同样PCR体系以及反应条件，28个循环。半定量结果显示IecRK基因接种清水表达无变化，接种白叶枯病菌和稻瘟病病菌后表达明显上调(图5)。
权利要求
1.水稻类凝集素激酶基因(Lectin-likeReceptor Kinase, LecRK)的启动子LecRKP， 其为1)SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；2)SEQID No. 1所示的核苷酸序列经替换、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，且具有相同功能的核苷酸序列；或3)由SEQID No. 1产生的具有控制基因在幼芽和幼根特异表达的DNA功能片段。
2.含有权利要求1所述启动子构建的表达盒。
3.含有权利要求1所述启动子或权利要求2所述表达盒的植物表达载体。
4.如权利要求3所述的表达载体，其为pCAMBIA1381z-lecRKP。
5.权利要求1所述的启动子LecRKP、权利要求2所述的表达盒或权利要求4或5所述的表达载体制备转基因植物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述植物为水稻。
7.权利要求1所述的启动子LecRKP、权利要求2所述的表达盒或权利要求4或5所述的表达载体在培育组织特异表达植株中的应用。
8.权利要求1所述的启动子LecRKP、权利要求2所述的表达盒或权利要求4或5所述的表达载体在培育新型抗病植株中的应用。
全文摘要
本发明公开了水稻类凝集素激酶基因(Lectin-likeReceptorKinase,LecRK)启动子(LecRKP)，属于植物基因工程技术领域。本发明启动子具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，控制水稻类凝集素激酶基因仅在水稻幼芽、幼根以及花中特异表达。启动子含有的AS-1和RY-element顺式作用元件，使基因在植物中具有特异的时空表达模式，同时抗病反应应答元件OsBIHD1和受病原菌诱导上调的顺式作用元件GT-1和GCC-box，使得lecRK基因在抗病反应中发挥了作用。本发明启动子可以用于外源基因在水稻幼芽和幼根中特异表达。
文档编号C12N15/113GK102212521SQ20111010500
公开日2011年10月12日 申请日期2011年4月25日 优先权日2011年4月25日
发明者何光存, 杜波, 祝莉莉, 程晓艳, 陈荣智 申请人:武汉大学