专利名称：一种转基因植物分子水平非预期效应评价的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种转基因植物安全性评价方法，具体是转基因植物分子水平的非预期效应评价的方法。
背景技术：
按照联合国粮农组织(FAO)的定义，生物安全是指“避免由于对具有感染能力的有机体或者遗传修饰有机体的研究和商品化生产而对人类的健康和安全以及环境的保护带来的风险”，可归纳为生态风险、食品安全和非预期效应三个方面。在转基因植物安全性评价的诸多项目中，非预期效应的评价是难度最高的项目，其原因在于转基因植物的非预期效应具有显著的难以预测性(European foodsafety authority, 2005 ；Konig, 2004) 根据联合国粮农组织和世界卫生组织(FA0/WH0)的定义，转基因生物非预期效应是指由外源基因整合于基因组导致的非目标性状的增加或者导致受体植物存在的性状的丢失(WHO， 2000)。现在实验室中及世界各国环境和食品监管部门在研究和检测转基因植物非预期效应时所使用的方法和技术主要包括1、基于靶标的表型筛选。首先考察转基因植株整体表型与非转基因植株是否存在显著差异，即农艺性状有没有退化；然后鉴定目标性状是否被无误的引入受体植物。2、主要成分比较分析法。即基于实质等同性原则对转基因植物及其非转基因受体在组分上进行比较分析，这些主要成分包括脂肪、蛋白质、碳水化合物、矿物质、灰分、氨基酸、脂肪酸和维生素等。3、组学和谱学的方法，包括转录组学(基因芯片)、蛋白质组学(双向电泳)、代谢组学(代谢物谱系分析)。其实质也是基于实质等同性原则进行的比较法。以蛋白质组学为例，即用双向电泳技术考察转基因植物与其非转基因受体之间在表达谱上是否存在差异点。(参考文献F. Cellini, A. Chesson, I.Colquhoun, etal, .2004. Unintended effects and their detection in genetically modifiedcrops[J]. Food and Chemical Toxicology. 42 :1089-1125. Deng PJ, Zhou XY, Yang DY, et al, . 2008.The definition, source, manifestationand assessment of unintended effects in genetically modified plants[J]. Journal ofthe Science of Food and Agriculture. 88 :2401-2413.)。上述所有方法的思路都是从结果入手，先分析一个结果性事件对另一个结果性事件是否存在影响，然后从出发的结果上找原因，并试图研究这个原因是否同时是终点的结果的原因。在这一过程中间，就存在由各通路链条的“黑盒子”而导致的结论不确定性。
发明内容
本发明的目的是提供一种评价转基因植物分子水平非预期效应的方法，以克服现有技术存在的上述不足。为实现上述目的，本发明的技术方案是利用酵母双杂交的方法，首先对外源目的蛋白克隆与鉴定，构建为诱饵融合蛋白，再将转基因植物受体亲本的cDNA文库构建猎物融合蛋白，最后用诱饵融合蛋白对猎物融合蛋白文库进行筛选，通过对转基因植物受体亲本 cDNA文库的筛选，获得与外源目的蛋白相互作用的阳性作用子(见图1)。本发明直接考察外源蛋白与受体植物蛋白组的相互作用，这样从确定的原因着手，通过设计的实验得到明确的结果，从而在分子水平得到评价非预期效应的确定性结论，实现对转基因植物分子水平的非预期效应评价。在此基础上，通过遗传学和分子生物学等技术的研究可以得到转基因植物表型的非预期改变，从而进行转基因植物表型水平非预期效应的确定性结论。本发明具体包括以下步骤1、外源目的蛋白的克隆与鉴定外源目的蛋白是指转基因植物中插入的目标性状。从转基因植物或外源目的蛋白的原始来源处通过PCR或基因分离的方法获得目标蛋白的基因序列，转化大肠杆菌克隆扩增，再通过PCR、琼脂糖电泳、序列测定、序列比对分析鉴定目的片段。2、外源目的蛋白构建诱饵融合蛋白将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，双酶切同时消化目的基因片段和质粒载体，并回收纯化线性酶切产物。将载体和目的基因按照1 3的摩尔比进行连接反应，16°C过夜。连接产物转化入大肠杆菌DH5 α感受态细胞，于抗性培养基上鉴定阳性克隆。液体培养后，提取重组质粒，经过PCR、双酶切和测序鉴定后，确定为外源目的基因构建的诱饵融合蛋白质粒，最后转化酵母鉴定外源蛋白重组子的自激活活性和毒性，如无自激活活性和毒性，即可用于后续分子操作。3、转基因植物受体亲本的cDNA文库构建构建cDNA文库的材料是转基因植物受体亲本的全株幼苗。具体操作为常规文库构建的方法，提取纯化总RNA，分离纯化mRNA，反转录合成单链cDNA，利用Gubler-Hoffman 法合成ds cDNA文库，经末端平滑化，连接Adaptor、限制性酶切，去除短片段后连接到质粒载体上，构建质粒载体连接文库。取0. 5 μ L连接液转化大肠杆菌，检测文库库容约> 1. 8 X IO6Cfu, 100万倍克隆扩增放大cDNA文库后提取浓度为1. Omg/mL的质粒2mL待用，即为猎物融合蛋白表达文库。4、用共转化的方法通过酵母双杂交进行文库筛选共转系统转化使用的酵母菌株为Y2H Gold yeast strain (购自Clontech公司)， 将新鲜复苏的酵母单菌落在液体培养基中培养至对数生长期，通过去离子水、lXTE/LiAc 重悬、洗涤后获得感受态细胞；然后利用PEG/LiAc介导的方法，将诱饵融合蛋白和猎物融合蛋白双质粒系统通过热击共转入新鲜制备的酵母感受态细胞中，最后将转化后的酵母涂
布于培养基上培养。实验所用酵母双杂系统共有四个报告基因，即-His，-Ade，AURl-C和MEL1，因此筛选结果最终确定的阳性克隆应该可以同时将这四个报告基因的表达激活。文库筛选过程首先是将共转化菌液在加有α半乳糖苷酶显色底物X- α -Gal和抗真菌素金担子素Aba的双缺培养基上初筛，这一步筛选所得到的克隆即可以生长且变蓝的菌落，理论上认为是由于蛋白质之间的相互作用而激活了两个报告基因AURl-C和MELl的表达。经过第一轮筛选得到的阳性克隆继续划线培养在含Χ-α -Gal和Aba的四缺培养基上。有些第一轮筛出的阳性克隆在四缺培养基上就不能生长了，这些视为假阳性而予以舍弃。在四缺培养基上仍能很好的生长的菌落被认为又激活了 -His，-Ade基因的表达，这些菌落被认为是初步筛选得到的阳性结果。提取所有阳性克隆酵母菌株的质粒，电击法转化大肠杆菌DH5CI感受态细胞，转化后菌液涂布LB+Amp的平板，以筛选文库质粒。由于表达诱饵蛋白的质粒是Kana抗性，而表达猎物蛋白的质粒是Amp抗性，就可以筛除诱饵质粒，而只保留猎物质粒。每个板上至少随机挑取10个单克隆，测序并对序列进行分析。将上述序列分析得到的阳性蛋白分别与pGBKT7_Bt共转化Y2H Gold strain酵母菌株，重复前面的筛选过程，再次获得的阳性克隆，即可确认该蛋白与诱饵蛋白的相互作用。有益效果本发明所述方法在转基因植物分子水平非预期效应研究领域具有创新性和很强的实践性，对目前的实质等同性原则基础下的各种方法具有很好的改进和补充作用。本发明具有以下优点(1)确定性这是本方法最大的创新和优点所在。直接从效应产生的根本原因入手，获得明确的结论。传统研究转基因生物非预期效应的各种方法(如主要成分比较法和组学的方法等)最大的问题就是原因和结果之间各通路链条的“黑盒子”而导致的结论不确定性。在这点上本发明做了根本性的改进。( 高效性通过酵母双杂交进行的文库筛选和验证即可以获得一些阳性互作蛋白，结果明确且易于分析。(3)实用性酵母双杂交的方法对比于比较分析法和组学的方法技术更为成熟和简单。更易于操作。(4)广泛适应性本发明所述方法可以用于任何转基因植物外源目标蛋白分子水平的非预期效应研
图1是酵母双杂交的方法研究转基因植物分子水平非预期效应流程图；图2是文库筛选阳性结果的图样，为在四缺培养基(含有X-α-Gal和Aba)上筛选的阳性结果，在四缺培养基上仍可生长的菌落被认为是存在阳性相互作用的结果，每个菌斑对应一个可能的阳性作用结果；图3是阳性克隆PCR电泳结果图，所示为从四缺培养基上获得的阳性菌落提取酵母质粒，转化大肠杆菌，在含Amp的LB培养基上筛出的阳性单菌落提取质粒后PCR的结果， 其中I-M泳道各为一阳性结果，Marker为TrandK分子量标记。以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
具体实施例方式实施例1对转Bt基因水稻分子水平非预期效应研究的实例。1、外源蛋白Bt基因的克隆鉴定分析目的基因片段序列和连接载体多克隆位点信息，设计下列引物5，端引物CCCATATGATGGATAACAATCCGAACATC，下划线部分为所引入的Nde I酶切位点；3’端引物GCGTCGACATCATATTCTGCCTCAAAGG,下划线部分为所引入的Mil酶切位占.对苏云金杆菌HD-I菌株(购自中国科学院微生物所菌种保藏中心)PCR获得 Bt 基因片段。50 μ L PCR 体系5，端引物 1 μ L，3，端引物 1 μ L，10XK0D buffer 5 μ L, MgS04buffer 2 μ L, dNTP 5 μ L, KOD plus 酶 1 μ L，ddH20 35 μ L ；PCR 条件94 "C 5min, 94°C 30sec，58°C 30sec，72°C 2min，39 个循环，72°C IOmin0 将 PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小并测序，基因序列在NCBI上Blast比对鉴定序列信息。2、诱饵质粒载体的构建将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并回收DNA片段，用del和MlI双酶切同时分别消化目的基因片段Bt和质粒载体pGBKT7，并回收纯化线性酶切产物。将载体和目的基因按照1 3的摩尔比进行连接反应，16°C过夜。连接产物转化入大肠杆菌DH5 α感受态细胞，于抗性培养基上鉴定阳性克隆。摇菌提取重组质粒，经过PCR、双酶切和测序鉴定后， 转化酵母感受态细胞鉴定其没有自激活活性和毒性，可用于后续分子操作。3、水稻cDNA文库的构建种植水稻“明恢63” ( “华恢1号”受体亲本)，取三叶期幼苗，五叶期幼苗和分蘖期苗三个时期全株苗材料，液氮研磨后，将三期幼苗研磨粉充分混勻提取纯化总RNA，分离纯化mRNA，反转录合成单链cDNA，利用Gubler-HofTman法合成ds cDNA文库，经末端平滑化，连接Adaptor、限制性酶切，去除短片段后连接到载体pGADT7上，构建水稻质粒载体连接文库。取0.5yL连接液转化大肠杆菌，检测文库库容> LSXlO6Cfu, 100万倍克隆扩增放大cDNA文库后提取浓度为1. Omg/mL的质粒2mL待用。4、文库筛选用酵母双杂交的方法筛选水稻中与苏云金杆菌杀虫蛋白(CrylAb/Bt)相互作用的候选蛋白。本实验设计中以Bt作为诱饵连接到载体pGBKT7，而水稻文库蛋白则作为猎物。根据发明方案中所述筛库方法进行文库筛选。共转系统转化使用的酵母菌株为Y2H Gold yeast strain，将新鲜复苏的酵母单菌落在液体培养基中培养至对数生长期，通过去离子水、ΙΧΤΕ/LiAc重悬、洗涤后获得感受态细胞；然后利用PEG/LiAc介导的方法，将诱饵融合蛋白和猎物融合蛋白双质粒系统通过热击共转入新鲜制备的酵母感受态细胞中，最后将转化后的酵母涂布于培养基上培养。实验所用酵母双杂系统共有四个报告基因，即-His，-Ade, AURl-C和MEL1， 因此筛选结果最终确定的阳性克隆应该可以同时将这四个报告基因的表达激活。文库筛选过程首先是将共转化DNA-BD/Bait (pGBKT7_BT)和水稻cDNA文库构建的AD/ prey(pGADT7-Library)的酵母菌液涂布在加有α半乳糖苷酶显色底物X-α-Gal和抗真菌素金担子素Aba的双缺培养基上初筛，这一步筛选所得到的克隆即可以生长且变蓝的菌落，理论上认为是由于蛋白质之间的相互作用而激活了两个报告基因AURl-C和MELl的表达。经过第一轮筛选得到的阳性克隆继续划线培养在含X- α -Gal和Aba的四缺培养基上进行更严谨的阳性筛选。有些第一轮筛出的阳性克隆在四缺培养基上就不能生长了，这些视为假阳性而予以舍弃。在四缺培养基上仍能很好的生长的菌落被认为又激活了 -His，-Ade 基因的表达，这些菌落被认为是初步筛选得到的阳性结果。四缺培养基上筛选的阳性结果见图2。提取所有阳性克隆酵母菌株的质粒，电击法转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，转化后菌液涂布LB+Amp的平板，以筛选文库质粒。由于表达诱饵蛋白的质粒是Kana抗性，而表达猎物蛋白的质粒是Amp抗性，就可以筛除诱饵质粒，而只保留猎物质粒。每个板上至少随机挑取10个单克隆，菌落PCR(图幻后提取质粒，测序并对序列进行分析。将上述序列分析得到的有意义的阳性蛋白分别与pGBKT7_Bt共转化Y2H Gold strain酵母菌株，重复前面的筛选过程，再次获得的阳性克隆，即可确认该蛋白与诱饵蛋白的相互作用。最终得到的阳性互作蛋白有①金属硫蛋白类蛋白；②肌醇加氧酶类蛋白；③脂肪酶；④冷素类家族蛋白；⑤稻属gamma链前体类似物；⑥芥子酶前体；⑦二氢吡啶二羧酸合酶1，叶绿体内蛋白前体。由此可以看出，转Bt水稻中这些蛋白会和表达的Bt蛋白发生相互作用，在分子水平上产生非预期效应。
权利要求
1.一种转基因植物分子水平非预期效应评价的方法，其特征在于，用外源目的蛋白构建诱饵融合蛋白，用转基因植物受体亲本cDNA文库构建猎物融合蛋白文库，通过酵母双杂交用诱饵融合蛋白对猎物融合蛋白文库进行筛选，获得阳性相互作用蛋白，从而实现对转基因植物分子水平非预期效应的评价。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将外源基因连接到具有编码DNA结合功能域基因的酵母双杂交质粒上构建得到表达诱饵融合蛋白的表达质粒，将cDNA文库的基因连接到的具有编码DNA转录激活结构域基因的酵母双杂交质粒上构建得到表达猎物融合蛋白的表达质粒，将这两种质粒共转化酵母中，筛选阳性克隆，获得阳性互作蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述DNA结合功能域为GAL4-bd或 LexA-bd,所述DNA转录激活结构域为GAL4_ad或VP16。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，构建诱饵融合蛋白表达质粒的方法是通过PCR特异扩增目的基因，凝胶电泳回收PCR产物，双酶切同时消化PCR产物和质粒载体 PGBKT7，并回收纯化线性酶切产物；将载体和目的基因按照1 3的摩尔比进行连接反应， 16°C过夜；连接产物转化入大肠杆菌DH5 α感受态细胞，于抗性培养基上鉴定阳性克隆；液体培养后，提取重组质粒，经过PCR、双酶切和测序鉴定后，确定为外源目的基因构建的诱饵融合蛋白质粒，最后转化酵母鉴定外源蛋白重组子的自激活活性和毒性。
5.如权利要求1-4之一所述的方法，其特征在于，所述cDNA文库的构建方法是以转基因植物受体亲本的全株幼苗为材料提取纯化总RNA，分离纯化mRNA，反转录合成单链cDNA，利用Gubler-Hoffman法合成ds cDNA文库，经末端平滑化，连接接头、限制性酶切，去除短片段后连接到质粒载体上；将连接产物转化大肠杆菌，检测文库库容大于 LSXlO6Cfu,并扩增放大cDNA文库，即为猎物融合蛋白表达文库。
6.如权利要求1-4之一所述的方法，其特征在于，用共转化的方法通过酵母双杂交进行文库筛选的方法是将新鲜复苏的酵母单菌落在液体培养基中培养至对数生长期，通过去离子水、ΙΧΤΕ/LiAc重悬、洗涤后获得感受态细胞；然后利用PEG/LiAc介导的方法，将诱饵融合蛋白和猎物融合蛋白双质粒系统通过热击共转入新鲜制备的酵母感受态细胞中， 最后将转化后的酵母涂布于培养基上培养；酵母双杂系统共有四个报告基因-His，-Ade, AURl-C和MELl，将共转化菌液在加有α半乳糖苷酶显色底物X- α -Gal和抗真菌素金担子素Aba的双缺培养基上初筛，筛选能够生长且变蓝的菌落；经过第一轮筛选得到的菌落继续划线培养在含X-α-Gal和Aki的四缺培养基上，仍能生长的菌落为初步筛选得到的阳性克隆。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括对初步筛选得到的阳性克隆进一步鉴定提取所有阳性克隆酵母菌株的质粒，电击法转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，转化后菌液涂布LB+Amp的平板，以筛选文库质粒；每个平板上至少随机挑取10个单克隆，提取质粒，测序并对序列进行分析；将上述序列分析得到的阳性蛋白的克隆提取质粒分别与表达诱饵融合蛋白的质粒载体共转化酵母菌株，重复前面的筛选过程。
8.如权利要求2 4任一项所述的方法，其特征在于，所述植物为水稻，所述外源蛋白为CryIAb/Bt，所述具有编码DNA结合功能域基因的酵母双杂交质粒为pGBKT7，所述具有编码DNA转录激活功能域基因的酵母双杂交质粒为PGADT7，所述酵母菌为Y2HGold yeast strain。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，得到的阳性互作蛋白有①金属硫蛋白类蛋白；②肌醇加氧酶类蛋白；③脂肪酶；④冷素类家族蛋白；⑤稻属gamma链前体类似物；⑥ 芥子酶前体；⑦二氢吡啶二羧酸合酶1，叶绿体内蛋白前体。
全文摘要
本发明提供了一种基于酵母双杂交技术的转基因植物分子水平非预期效应评价的方法。将外源目的蛋白构建为诱饵融合蛋白，再将转基因植物受体亲本的cDNA文库构建猎物融合蛋白，通过酵母双杂交的方法用诱饵融合蛋白对猎物融合蛋白文库进行筛选，获得与外源目的蛋白相互作用的阳性作用子，从而实现对转基因植物分子水平的非预期效应的评价。
文档编号C12Q1/02GK102251025SQ20111010479
公开日2011年11月23日 申请日期2011年4月26日 优先权日2011年4月26日
发明者王戎疆, 甄刚, 许崇任, 韩娟 申请人:北京大学