发酵方法
【专利摘要】本发明提供了用于细菌类毒素的周质表达的方法，包括步骤：a)在发酵培养基中培养革兰氏阴性宿主细胞的培养物，其中所述宿主细胞用多核苷酸转化，并且其中所述多核苷酸编码细菌类毒素和周质信号序列；或提供革兰氏阴性宿主细胞，其中所述宿主细胞用多核苷酸转化，并且其中所述多核苷酸编码细菌类毒素和周质信号序列并且其中所述革兰氏阴性宿主细胞包括在周质中表达的细菌类毒素；a(i))诱导所述细菌类毒素的表达；b)使所述宿主细胞成熟，其中所述成熟步骤包括：I)使宿主细胞接受pH休克；II)无补料添加孵育所述宿主细胞；和/或III)使宿主细胞接受低于-20℃的温度；和c)从所述宿主细胞提取细菌类毒素，其中所述提取方法包括渗透压休克。
【专利说明】发酵方法
[0001]背景
本发明涉及用于产生重组蛋白的方法，具体是包括培养表达重组蛋白的宿主细胞和使宿主细胞成熟的步骤的用于产生重组蛋白的方法。本发明还提供了通过本发明的方法可获得的重组蛋白，和包括所述重组蛋白的免疫原性组合物或疫苗。
[0002]某些毒素的表达已知是有挑战性的，例如白喉毒素。DT可以通过纯化来自白喉杆菌{Corynebacterium diphtheriae)的培养物的毒素，随后通过化学解毒产生,或者可以通过纯化毒素的重组或遗传解毒的类似物制成(例如CRM197，或US4，709, 107、US5.846.711、US5, 601，827和US5, 917，017中描述的其它突变体)。
[0003]由于低蛋白丰度，用于疫苗中的白喉毒素例如CRM197的大量的产生已被阻碍。此问题先前已通过在大肠杆菌中表达CRM197 (Bishai等J.Bacteriol.169:5140-5151)得以解决，Bishai等描述了包含白喉毒素(包括tox信号序列)的重组融合蛋白的表达，这导致降解的蛋白的产生。
[0004]包含tox信号序列的白喉片段的克隆和这些序列在大肠杆菌中的表达涉及某些困难。表达的蛋白分泌到周质间隙并且此分泌伴随宿主细胞的活力降低(O’Keefe等Proc.Natl, Acad.Sc1.86:343-346)和重组蛋白的蛋白水解增加(Bishai等JBacteriol.169:5140-5151)。由于这些原因，已经暗示去除tox信号序列使得表达不再是在周质，这可以增加白喉类毒素的表达(Bishai等)。
[0005]PCT/EP2010/065047 (W0 2011/042516)首次公开了成功的 CRM197 的周质表达。这增加了 CRM197的产量，但是即使如此，仍然可以进行对提取方法的改善以增加产量。Rathore公开了渗透压程序的优化,用于在大肠杆菌中表达的蛋白产物的分离(Rathore等Biotechnol.Prog.2003, 19, 15`41-1546)。Bochner 等还公开了用于从宿主细胞回收周质蛋白的方法(US4680262)。
[0006]从而本发明提供了改善的用于产生重组多肽的方法，其包括使宿主细胞成熟的步骤，其中此步骤可以包括下列的任一或更多:
(1)使宿主细胞接受pH休克；
(2)孵育宿主细胞；或
(3)冷冻宿主细胞。
[0007]此使宿主细胞成熟的步骤具有实质上增加蛋白提取效率的令人惊讶的结果。
[0008]简要概述
在第一实施方案，提供了用于细菌类毒素的周质表达的方法，包括步骤:
a)在发酵培养基中培养革兰氏阴性宿主细胞的培养物，其中所述宿主细胞用多核苷酸转化，并且其中所述多核苷酸编码细菌类毒素和周质信号序列。
[0009]a(i))诱导所述细菌类毒素的表达；
b)使所述宿主细胞成熟，其中所述成熟步骤包括:
I)使宿主细胞接受PH休克；
II)无补料添加孵育所述宿主细胞；和/或III)使宿主细胞接受低于-20°C的温度；和
c)从所述宿主细胞提取细菌类毒素，其中所述提取方法包括渗透压休克。
[0010]在第二实施方案，提供了用于细菌类毒素的周质表达的方法，包括步骤:
a)提供包括在周质中表达的细菌类毒素的革兰氏阴性宿主细胞；
b)使所述宿主细胞成熟，其中所述成熟步骤包括:
I)使宿主细胞接受PH休克；
II)无补料添加孵育所述宿主细胞；和/或
III)使宿主细胞接受低于_20°C的温度；和
c)从所述宿主细胞提取细菌类毒素，其中所述提取方法包括渗透压休克。
[0011]在第三实施方案中，提供了通过本发明方法可获得或通过本发明方法获得的细菌
类毒素。
[0012]在第四实施方案，提供包括本发明细菌类毒素和药学可接受赋形剂的免疫原性组合物。
[0013]在第五实施方案，提供包括本发明免疫原性组合物的疫苗。
[0014]在第六实施方案，提供本发明的免疫原性组合物或疫苗在用于疾病的预防或治疗的药物的制造中的用途。
[0015]在第七实施方案，提供了预防或治疗疾病的方法，包括向患者施用本发明的免疫原性组合物或疫苗。
[0016]附图简述
图1-发酵概况的描述，在20升规模补料发酵期间监测发酵参数。线I描述添加的基质的量(克)，线2描述pH，线3描述搅拌速率(rpm)，线4描述p02 (%)，线5描述温度(V )并且线6描述添加的碱的量(克)。
[0017]图2-对于在pH6.8下进行的生长，作为补料速率和诱导期间pH的函数的CRM197在周质中的产生和细胞缔合级分的描述。左边小图显示周质CRM197的产生。右边小图显示细胞缔合的CRM197的产生。
[0018]图3-发酵概况的描述，在20升规模补料分批发酵和成熟期间监测方法参数。线I描述添加的基质的量(克)，线2描述pH，线3描述搅拌速率(rpm)，线4描述p02 (%)，线5描述温度(V )并且线6描述添加的碱的量(克)。箭头指示成熟步骤的开始。成熟步骤在右边小图中放大。
[0019]图4-本发明多核苷酸和多肽的序列表。
[0020]发明详述
本发明提供了用于细菌类毒素的周质表达的方法，包括步骤:
a)在发酵培养基中培养革兰氏阴性宿主细胞的培养物，其中所述宿主细胞用多核苷酸转化，并且其中所述多核苷酸编码细菌类毒素和周质信号序列。
[0021]a(i))诱导所述细菌类毒素的表达；
b)使所述宿主细胞成熟，其中所述成熟步骤包括:
I)使宿主细胞接受PH休克；
II)无补料添加孵育所述宿主细胞；和/或 III)使宿主细胞接受 低于_20°C的温度；和c)从所述宿主细胞提取细菌类毒素，其中所述提取方法包括渗透压休克。
[0022]在进一步的实施方案中，提供了用于细菌类毒素的周质表达的方法，包括步骤:
a)提供包括在周质中表达的细菌类毒素的革兰氏阴性宿主细胞；
b)使所述宿主细胞成熟，其中所述成熟步骤包括:
I)使宿主细胞接受PH休克；
II)无补料添加孵育所述宿主细胞；和/或
III)使宿主细胞接受低于_20°C的温度；和
c)从所述宿主细胞提取细菌类毒素，其中所述提取方法包括渗透压休克。
[0023]周质是革兰氏阴性细菌中细胞质膜和外膜之间的间隙。术语“周质表达”指在宿主细胞内蛋白(例如细菌类毒素)的表达/产生和其分泌进入宿主细胞的周质间隙。周质表达适合通过使用信号序列实现，所述信号序列能引导表达的蛋白到周质。当在革兰氏阴性细菌中与周质信号序列一起表达时，典型地，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100%的目的多肽导向周质。
[0024]“重组”核酸是一种具有非天然发生的序列或具有通过人工组合两种另外分开的序列区段制成的序列的核酸。人工组合可以是通过化学合成，或更常规地，通过分离的核酸区段的人工操作，例如通过遗传改造技术实现。“重组”蛋白是一种由异源(例如，重组)核酸编码的蛋白，所述核酸已被导入宿主细胞，例如细菌或真核细胞。所述核酸可以被导入到具有能够表达由所述导入的核酸编码的蛋白的信号的表`达载体上，或所述核酸可以被整合进宿主细胞染色体。
[0025]术语“使宿主细胞成熟”指一种方法，其在步骤c)之前进行，并且增加重组多肽例如细菌类毒素从宿主细胞或周质释放的效率。重组多肽从周质释放的效率可以以多种方法确定。例如通过测量在渗透压休克后从周质释放的重组多肽的量，和在渗透压休克后仍保持与细胞缔合的重组多肽的量，这可以用于计算所产生的目的多肽的总量(细胞质和周质)。在渗透压休克后保持细胞缔合的多肽的量可以通过使用弗氏压碎器破碎细胞后测量蛋白水平来确定。为了计算重组多肽从周质释放的效率是否已经增加，可以在进行具有或不具有成熟步骤的方法后测量从周质释放的目的多肽的百分比，并且比较百分比。
[0026]提供了能够使宿主细胞成熟的步骤的实例并包括:
(1)使宿主细胞接受PH休克；
(2)孵育宿主细胞，任选无补料添加，在高于0°C，高于10°C，高于20°C或高于23°C至少5分钟，至少10分钟，至少30分钟，至少I小时或至少2小时。
[0027](3)使宿主细胞接受低于O °C的温度至少I小时、2小时、5小时、12小时、24小时、
I天、2天或5天。
[0028]用于细菌类毒素的周质表达的方法的步骤b)可以包括这些步骤的任意一个，或这些步骤的两个或三个的组合。
[0029]短语“从宿主细胞提取重组蛋白”指能够从宿主细胞释放重组蛋白(例如细菌类毒素)的任何方法，典型地，重组蛋白存在于周质。短语“从宿主细胞提取细菌类毒素”指能够从宿主细胞释放细菌类毒素的任何方法，典型地，细菌类毒素存在于周质。这些技术是本领域技术人员熟知的，并且包括例如渗透压休克或酶学方法。任选地，酶学方法包括使用溶菌酶、消解酶或溶葡球菌酶消化。[0030]短语“周质信号序列”指能够引导表达的蛋白(例如细菌类毒素)到周质的信号序列，这可以在翻译期间(共翻译信号序列)或翻译后(翻译后信号序列)发生。在革兰氏阴性细菌中多肽翻译期间或之后，如果当其附着到目的多肽时，信号序列能够引导表达的蛋白到周质，比不存在信号序列的情况下，在革兰氏阴性细菌的周质中发现更多的所述多肽。在一个实施方案中，当在革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌中表达时，至少50、60、70、80、90或100%的目的多肽导向周质。可以使用报告蛋白进行测定以测试是否信号序列能够引导周质表达。例如周质信号序列可以插入到编码绿色荧光蛋白的基因上游，此蛋白可以在本发明的宿主细胞中表达。可以使用显微镜判断绿色荧光蛋白在细胞质和周质中比较的水平。在一些实施方案中，所述重组蛋白可以被分泌。
[0031]编码周质信号序列的多核苷酸可操作地连接编码重组蛋白(例如细菌类毒素)的序列。[0032]在一个实施方案中，所述方法进一步包括诱导重组蛋白(例如细菌类毒素)表达的步骤a(i))。术语“蛋白的诱导表达”指向培养物添加诱导剂例如IPTG(异丙基硫代-β -D-半乳糖苷)，或改变培养物的温度导致多肽以增加的速率表达的方法。术语“蛋白的诱导表达”进一步涵盖在合适的条件下孵育培养物以允许在方法的下一步骤之前诱导发生一定时期。起始表达(通过添加诱导剂或改变温度)和允许表达发生(在合适的条件下孵育)花费的整个时期在本文中称为“诱导期”。根据本发明的一个实施方案，诱导期可以持续5分钟到 72小时，从30分钟到 48小时，从I到36小时，从6到26小时或12到24小时,例如约6、12、18、24、26、36、48或72小时。根据本发明的一个方面，重组蛋白诱导表达的步骤a (i))在步骤a)之后和步骤b)之前发生，并且在下文称作步骤a (i))。
[0033]在一个实施方案中，步骤b)包括使宿主细胞接受pH休克。出于本发明的目的，短语“使宿主细胞接受PH休克”指升高或降低发酵培养基的pH。pH休克可以在发酵罐中对宿主细胞进行，或者PH休克可以对已浓缩的(例如通过离心)宿主细胞进行。pH休克可以通过向宿主细胞在其中悬浮的溶液添加酸或碱进行。
[0034]在一个实施方案中，pH休克包括将发酵培养基的pH改变多于0.2个pH单位，多于0.3个pH单位，多于0.4个pH单位，多于0.5个pH单位，或多于0.6个pH单位。通常，“改变发酵培养基的pH”包括升高或降低发酵培养基的pH，并且这可以通过向发酵培养基添加组分进行，例如向发酵培养基添加酸或碱。
[0035]在一个实施方案中，pH休克包括将发酵培养基的pH升高多于0.2个pH单位，多于0.3个pH单位，多于0.4个pH单位，多于0.5个pH单位,或多于0.6个pH单位。这可以例如通过向发酵培养基添加碱化剂(例如碱)进行。
[0036]在一个实施方案中，pH休克包括将发酵培养基的pH降低多于0.2个pH单位，多于0.3个pH单位，多于0.4个pH单位，多于0.5个pH单位,或多于0.6个pH单位。这可以例如通过向发酵培养基添加酸化剂(例如酸)进行。
[0037]在进一步的实施方案中，所述pH休克包括将发酵培养基的pH改变0.1-2.0个pH单位，0.1-2.0个pH单位，0.1-1.5个pH单位，0.2-2.0个pH单位，0.2-1.5个pH单位，0.2-1.0 个 pH 单位，0.5-2.0 个 pH 单位，0.5-1.5 个 pH 单位，0.5-2.0 个 pH 单位或 0.7-1.5个pH单位。
[0038]在进一步的实施方案中，所述pH休克包括将发酵培养基的pH升高0.1-2.0个pH单位，0.1-2.0个pH单位，0.1-1.5个pH单位，0.2-2.0个pH单位，0.2-1.5个pH单位，0.2-1.0 个 pH 单位，0.5-2.0 个 pH 单位，0.5-1.5 个 pH 单位，0.5-2.0 个 pH 单位或 0.7-1.5个pH单位。
[0039]在进一步的实施方案中，所述pH休克包括将发酵培养基的pH降低0.1-2.0个pH单位，0.1-2.0个pH单位，0.1-1.5个pH单位，0.2-2.0个pH单位，0.2-1.5个pH单位，0.2-1.0 个 pH 单位，0.5-2.0 个 pH 单位，0.5-1.5 个 pH 单位，0.5-2.0 个 pH 单位或 0.7-1.5个pH单位。
[0040]在一个实施方案中，所述pH休克通过添加碱实现。在一个实施方案中，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化铵、碳酸钠、磷酸钠和碳酸氢钠。在进一步的实施方案中，所述碱是氢氧化铵(NH4OH)或氢氧化钠(NaOH)。在进一步的实施方案中，所述碱是氢氧化铵。在进一步的实施方案中，所述碱是氢氧化钠。
[0041]在一个实施方案中，所述pH休克通过添加酸实现。在一个实施方案中，所述酸选自盐酸、硫酸、碳酸、磷酸、醋酸和乳酸。在一个实施方案中，所述酸是磷酸(H3PO4)tj
[0042]在一个实施方案中，步骤b)包括孵育步骤，其中所述孵育步骤包括孵育宿主细胞至少5分钟，至少10分钟，至少30分钟，至少I小时或至少2小时，在高于O V、高于5 °C、高于10°C、高于15°C、高于20°C或高于23°C的温度下。在一个实施方案中，所述孵育步骤包括在 1(TC -50°C>15°C -45°C>20°C -40°C>22°C -38°C>15°C -50°C>15°C -40°C>20°C -38°C>20 °C -50 °C、22 °C -50 °C、22 °C -45 °C 22 °C -40 °C、23 °C -50 °C、23 °C -45 °C、23 °C -40 °C、23 °C -38 °C >23 °C -30 °C >25 °C -50 °C >25 °C -45 V、25 V -40 °C >25 °C -38 °C >25 °C -30 V 的温度孵育宿主细胞。
[0043]在一个实施方案中，所述孵育步骤包括在23°C左右或37°C左右的温度孵育宿主细胞。
[0044]在一个实施方案中，所述孵育步骤包括孵育宿主细胞至少5分钟，至少7分钟，至少10分钟，至少15分钟，至少30分钟，至少I小时，至少90分钟，至少2小时，至少3小时，至少5小时，至少24小时或至少2天。在进一步的实施方案中，所述孵育步骤包括孵育宿主细胞5分钟-2年，5分钟-1年，5分钟-6个月，5分钟-3个月，5分钟-1个月，5分钟-2周，5分钟-1周，5分钟-24小时，5分钟-12小时，5分钟-6小时，5分钟-3小时，5分钟-2小时，5分钟-1小时，5分钟-30分钟5分钟-15分钟，10分钟-1年，10分钟-6个月，10分钟-3个月，10分钟-1个月，10分钟-2周，10分钟-1周，10分钟-24小时，10分钟-12小时，10分钟-6小时，10分钟-3小时，10分钟-2小时，10分钟-1小时，10分钟-30分钟，10分钟-15分钟，30分钟-1年，30分钟-6个月，30分钟-3个月，30分钟-1个月，30分钟-2周，30分钟-1周，30分钟-24小时，30分钟-12小时，30分钟-6小时，30分钟-3小时，30分钟-2小时，30分钟-1小时，I小时-1年，I小时-6个月，I小时-3个月，I小时-1个月，I小时-2周，I小时-1周，I小时-24小时，I小时-12小时，I小时-6小时，I小时-3小时或I小时-2小时。
[0045]在一个实施方案中，孵育步骤的补料速率低于步骤a)的补料速率。补料速率(或基质供应速率)是基质添加的速率(ml min—1)，其中基质包括用于培养的宿主细胞的食物来源。在一个实施方案中，孵育步骤期间的补料速率是低于步骤a)中使用的补料速率的75%、50%、35%、25%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1%。在进一步的实施方案中，在孵育步骤期间没有补料添加，通常这意味着在孵育步骤期间没有添加基质。
[0046]在一个实施方案中，培养基的pH在孵育步骤期间允许波动。在一个实施方案中，pH改变0.1个单位左右。在进一步的实施方案中，在孵育步骤期间没有pH控制。这意味着，在孵育步骤期间没有进一步的添加酸或碱，以维持恒定pH。
[0047]在进一步的实施方案中，步骤b)包括使宿主细胞接受低于O °C的温度至少30分钟、I小时、2小时、5小时、12小时、24小时、I天、3天、4天、5天、15天、I个月、6个月、12个月、I年或2年。在一个实施方案中，所述宿主接受低于(TC、-5 °C、-10°C、-20°C、-40°C、-60°C、-70°C 或-80°C。在进一步的实施方案，所述宿主细胞接受 0—100O、0—80O、0—20O、0—18O、-5—80O、-10—80°C> -20—80O或-25-80O的温度，例如约 0°C、-5°C、-10°C、-15°C、-18°C、-22°C、-25°C、-30°C、-40°C、-50°C、-60°C、 -70°C或_80°C的温度。在一个实施方案中，所述宿主细胞接受低于0°C的温度5分钟-10年、15分钟-10年、40分钟-10年、I小时-10年、15分钟-5年、30分钟-5年、I小时-5年、15分钟-3年、30分钟-3年、I小时-3年、15分钟-2年、30分钟-2年、I小时-2年、15分钟-1年、30分钟-1年、I小时-1年、I小时-15天、2小时-10天、12小时-7天或2_5天、例如约30分钟、I小时、2小时、5小时、12小时、I天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、15天、I个月、6个月或12个月。
[0048]在进一步的实施方案中，步骤b)包括冷冻宿主细胞至少30分钟、I小时、2小时、3小时、5小时、12小时、24小时、I小时、2天、5天、15天、I个月、3个月、6个月、I年、2年、5年或10年。在进一步的实施方案中，步骤b)包括冷冻宿主细胞5分钟-10年、5分钟-5年、5分钟-2年、30分钟-10年、30分钟-5年、30分钟-2年、I小时-10年、I小时-5年或I小时-2年。术语“冷冻”指使宿主细胞暴露到低于0°C的温度。在进一步的实施方案中，步骤 c)包括在低于 0°C、-5°C、-1O0C、-200C、-300C、-40°C、-50°C、_70°C或-80°C 的温度下冷冻宿主细胞。冷冻宿主细胞可以导致产生冰晶，但是将宿主细胞的温度降低到低于(TC而不导致冰晶的产生也被认为是“冷冻宿主细胞”。
[0049]在一个实施方案中，步骤b)进一步包括融化所述细胞。术语“融化所述细胞”指升高宿主细胞的温度到高于0°C、10°C或20°C。通常，“融化所述细胞”将在细胞已被冷冻之后但在步骤c)之前发生。
[0050]在一个实施方案中，步骤b)包括使宿主细胞接受pH休克随后孵育步骤，其中所述孵育步骤包括孵育宿主细胞至少5分钟，至少10分钟，至少30分钟，至少I小时或至少2小时，在高于0°C、高于10°C或高于20°C的温度下。
[0051]在进一步的实施方案中，步骤b)包括孵育步骤，其中所述孵育步骤包括孵育宿主细胞至少5分钟，至少10分钟，至少30分钟，至少I小时或至少2小时，在高于0°C、高于10°C或高于20°C的温度下，随后使宿主细胞接受pH休克。
[0052]在进一步的实施方案中，步骤b)包括孵育步骤，其中所述孵育步骤包括孵育宿主细胞至少5分钟，至少10分钟，至少30分钟，至少I小时或至少2小时，在高于0°C、高于10°C或高于20°C的温度下，随后冷冻宿主细胞至少I小时、2小时、5小时、12小时、24小时、I天、2天或4天。
[0053]在进一步的实施方案中，步骤b)包括使宿主细胞接受pH休克随后冷冻宿主细胞至少I小时、2小时、5小时、12小时、24小时、I天、2天或4天。[0054]在进一步的实施方案中，步骤b)包括使宿主细胞接受pH休克随后是孵育步骤，其中所述孵育步骤包括孵育宿主细胞至少5分钟，至少10分钟，至少30分钟，至少I小时或至少2小时，在高于0°C、高于10°C或高于20°C的温度下，随后冷冻宿主细胞至少I小时、2小时、5小时、12小时、24小时、I天、2天或4天。
[0055]在进一步的实施方案中，步骤b)包括孵育步骤，其中所述孵育步骤包括孵育宿主细胞至少5分钟，至少10分钟，至少30分钟，至少I小时或至少2小时，在高于0°C、高于10°C或高于20°C的温度下，随后使宿主细胞接受pH休克再随后冷冻宿主细胞至少I小时、2小时、5小时、12小时、24小时、I天、2天或4天。
[0056]步骤b)可以是在全液体培养基内(步骤a)的产物)直接对细胞进行，和/或步骤a) (i))，可选地细胞可以在步骤b)之前从发酵罐移出，在进一步的实施方案中，在步骤
b)之前，细胞从发酵罐移出并浓缩，例如使用离心。
[0057]在一个实施方案中，宿主细胞是革兰氏阴性宿主细胞，例如革兰氏阴性细菌。在进一步的实施方案中，所述革兰氏阴性宿主细胞选自大肠杆菌，不动杆菌属(Acinetobacter),放线杆菌属(Actinobacillus),博代氏杆菌属{Bordetella)、布氏杆菌属(Brucella)，弯曲菌属{Campylobacter),蓝细菌{Cyanobacteria)，肠杆菌属(Bnterobacter),欧文氏菌属(Brwinia),弗朗西斯氏菌属(Franciscella),螺杆菌属Qlelicobacter'),嗜血杆菌(Hemophilus)，克雷伯氏菌属(Klebsiella),军团菌属{Legionella),莫拉氏菌属(Moraxella),奈瑟氏菌属(Neisseria、,巴氏杆菌属(Pasteurella),假单胞菌属iPsoudomorms'),变形杆菌属(Proteus),沙门氏菌属(5^7^9/7(9773),沙雷氏菌属(5krraiia),志贺氏菌属(免2><977<3),螺旋体属(Jreponema),弧菌属(Κ/^rio),和耶尔森氏菌属{Yersinia)。在进一步的实施方案中,所述革兰氏阴性宿主细胞选自大肠杆 菌、假单胞菌属和莫拉氏菌属。在进一步的实施方案中，所述革兰氏阴性宿主细胞是大肠杆菌。
[0058]在一个实施方案中，步骤c)包括渗透压休克。
[0059]在一个实施方案中，所述细胞在步骤b)之前不被杀死。在进一步的实施方案中，步骤b)在活的宿主细胞上进行。如果宿主细胞的培养物内大部分细胞能够复制这认为宿主细胞是“活的”。已知“杀死”细胞的方法的实例包括将宿主细胞暴露于乙醇或高温。在一个实施方案中，宿主细胞在步骤b)之前不接受高于40°C、高于50°C或高于60°C的温度。在进一步的实施方案中，在步骤b)之前不向宿主细胞的培养物中添加乙醇。
[0060]术语“在步骤b)期间是活的”指宿主细胞的培养物内大部分细胞在整个成熟步骤
b)期间或其基本上部分是活的。
[0061]在一个实施方案中，所述重组蛋白是细菌、病毒或癌症抗原。在一个实施方案中，所述重组蛋白是原核蛋白。在一个实施方案中，所述重组蛋白不是生长激素。在一个实施方案中，所述重组蛋白不是人生长激素。在一个实施方案中，所述重组蛋白不是CRM197。在一个实施方案中，所述重组蛋白不是CRM197,并且所述周质信号序列不是flgl。在一个实施方案中，所述重组蛋白是可溶蛋白。在进一步的实施方案中，所述重组蛋白是表面缔合蛋白。在进一步的实施方案中，所述重组蛋白是类毒素，例如细菌类毒素。在进一步的实施方案中，所述重组蛋白是衍生自白喉杆菌{C.diphtheriae)、肺炎链球菌(5:pneumoniae),流感嗜血杆菌(/Z influenzae),莫拉氏菌属，脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningi tidis),金黄色葡萄球菌CS aureus),粪肠球菌(B.faecalius),屎肠球菌(万.faecium),沙门氏菌属，沙眼衣原体(C iracAoffiaiis),或表皮葡萄球菌〈S.epidermidis)的蛋白。在进一步的实施方案中，所述重组蛋白是CRM197。
[0062]在一个实施方案中，所述周质信号序列是异源信号序列。
[0063]术语“异源”指来自两种不同来源的两种组分，例如多肽或多核苷酸序列。 例如，异源蛋白是一种由衍生自不同来源的多核苷酸或核酸编码的蛋白，包括来自不同来源的多核苷酸或核酸序列的人工组合，或是一种对其从中表达的细胞类型不天然的蛋白。例如，这指正常不与重组蛋白缔合的信号序列，例如在其天然状态下引导不同蛋白到周质的信号序列。例如flgl在其天然状态下引导flgl蛋白到周质，从而如果其引导flgl之外的蛋白到周质，则可以被认为是异源信号序列。
[0064]在一个实施方案中，周质信号序列包括
a)任一SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24 或 26 ;
b)SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24 或 26 包含 1、2 或 3 个点突变、插入或缺失的变体；或
c)SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24 或 26 的至少 10 个氨基酸的片段。
[0065]任选地，所述 周质信号序列包括任一 SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26，或任一SEQ ID NO:2、4、10、12、14、16、18、20、22、24或26，或任一SEQ ID N0:2、
4、10、12、14、16、18、20、22 或 24，或 SEQ ID NO: 24 或任一 SEQ ID NO: 2、4 或 24，或任一 SEQID NO: 2、10 或 24，或任一 SEQ ID NO: 2、12 或 24，或任一 SEQ ID NO: 2、14 或 24，或任一 SEQID NO: 4、10 或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、12 或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、16 或 24，或任一 SEQID NO: 4、18 或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、20 或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、22 或 24，或任一 SEQID NO: 10、12 或 24，或任一 SEQ ID NO: 10、14 或 24，或任一 SEQ ID NO: 10、16 或 24，或任一SEQ ID NO: 10、18 或 24，或任一 SEQ ID NO: 10、22 或 24，或任一 SEQ ID NO: 12、14 或 24，或任一 SEQ ID NO: 12、16 或 24，或任一 SEQ ID NO: 12、18 或 24，或任一 SEQ ID N0:12、20 或24 或任一 SEQ ID N0:12、22 或 24，或任一 SEQ ID NO: 14、16 或 24，或任一 SEQ ID NO: 14、18 或 24，或任一 SEQ ID NO: 14、20 或 24，或任一 SEQ ID NO: 14、22 或 24，或任一 SEQ IDNO: 16、18 或 24，或任一 SEQ ID NO: 16、20 或 24，或任一 SEQ ID NO: 16、22 或 24，或任一 SEQID N0:18、20 或 24，或任一 SEQ ID NO 18、22 或 24。
[0066]在进一步的实施方案中，所述周质信号序列包括(变体包含)如下序列的1、2或3 个点突变、插入或缺失:任一 SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 或 26，或任一 SEQ ID N0:2、4、10、12、14、16、18、20、22、24 或 26，或任一 SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22 或 24，或 SEQ ID NO: 24 或任一 SEQ ID NO: 2、4 或 24，或任一 SEQ ID NO: 2、10 或24，或任一 SEQ ID NO: 2、12 或 24，或任一 SEQ ID NO: 2、14 或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、10 或24，或任一 SEQ ID NO: 4、12 或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、16 或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、18或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、20 或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、22 或 24，或任一 SEQ ID NO: 10、12 或 24，或任一 SEQ ID NO: 10、14 或 24，或任一 SEQ ID NO: 10、16 或 24，或任一 SEQ IDNO: 10、18 或 24，或任一 SEQ ID NO: 10、22 或 24，或任一 SEQ ID NO: 12、14 或 24，或任一 SEQID NO: 12、16 或 24，或任一 SEQ ID NO: 12、18 或 24，或任一 SEQ ID NO: 12、20 或 24，或任一SEQ ID N0:12、22 或 24，或任一 SEQ ID NO: 14、16 或 24，或任一 SEQ ID NO: 14、18 或 24，或任一 SEQ ID N0:14、20 或 24，或任一 SEQ ID NO: 14、22 或 24，或任一 SEQ ID NO: 16、18 或24，或任一 SEQ ID N0:16、20 或 24，或任一 SEQ ID NO: 16、22 或 24，或任一 SEQ ID NO: 18、
20或 24，或任一 SEQ ID NO 18,22 或 24。
[0067]在进一步的实施方案中，所述周质信号序列包括如下序列的至少10、12、15，18或 20 个氨基酸的片段:任一 SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 或 26，或任一SEQ ID N0:2、4、10、12、14、16、18、20、22、24或26，或任一SEQ ID NO:2、4、10、12、14、16、18、20、22 或 24，或 SEQ ID NO: 24，或任一 SEQ ID NO: 2、4 或 24，或任一 SEQ ID NO: 2、10 或 24，或任一 SEQ ID NO: 2、12 或 24，或任一 SEQ ID NO: 2、14 或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、10 或24，或任一 SEQ ID NO: 4、12 或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、16 或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、18或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、20 或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、22 或 24，或任一 SEQ ID NO: 10、12 或 24，或任一 SEQ ID NO: 10、14 或 24，或任一 SEQ ID NO: 10、16 或 24，或任一 SEQ IDNO: 10、18 或 24，或任一 SEQ ID NO: 10、22 或 24，或任一 SEQ ID NO: 12、14 或 24，或任一 SEQID NO: 12、16 或 24，或任一 SEQ ID NO: 12、18 或 24，或任一 SEQ ID NO: 12、20 或 24，或任一SEQ ID N0:12、22 或 24，或任一 SEQ ID NO: 14、16 或 24，或任一 SEQ ID NO: 14、18 或 24，或任一 SEQ ID N0:14、20 或 24，或任一 SEQ ID NO: 14、22 或 24，或任一 SEQ ID NO: 16、18 或24，或任一 SEQ ID N0:16、20 或 24，或任一 SEQ ID NO: 16、22 或 24，或任一 SEQ ID NO: 18,20或24，或任一 SEQ ID NO 18、22或24，其能够引导蛋白运输到细菌周质。
[0068]在进一步的实施方案中，所述信号序列包括SEQ ID N0:24。
[0069]在一个实施方案中所述周质信号序列由任一下列序列编码:SEQ ID N0:l、3、5、7、
9、11、13、15、17、19、21或23。在进一步的实施方案中所述周质信号序列由SEQ ID NO:23编码。
[0070]在一个实施方案中，所述多核苷酸包括可诱导的启动子。
`[0071]在一个实施方案中，步骤b`)包括通过离心浓缩宿主细胞的步骤。任选地，这涉及在5000xg-8000xg、6000xg-7000xg或6500xg左右离心细胞。任选地，细胞离心30分钟-2小时,任选地,细胞离心I小时左右。
[0072]在一个实施方案中步骤a)在 ρΗ4.5-8.5、5.0-8.0、5.5-7.5、5.0-7.0、4.5-6.5 或
6.0-7.0，或约pH 6.0下进行。
[0073]在一个实施方案中步骤a)在20°〇-401:、251:-351:、271:-321:或281:左右的温度下进行。
[0074]在一个实施方案中对于步骤a)的大部分，培养物内溶氧水平是5%_40%、10%_30%、15%-25% 或 20% 左右。
[0075]在一个实施方案中步骤a)在10-1000 IT1的Kla下进行。KLa是对进入培养物的氧气量的度量。KLa越高，则引入培养物的氧气速率越高。
[0076]可以如下测量KLa。该方法涉及设定测量KLa采用的发酵罐的培养基体积、温度、压力、搅动和通气条件，其通过用氮气取代空气来吹出气体，通过恢复通入空气来吹进气体，并测量P02回到其稳态水平时的速率。
【权利要求】
1.用于细菌类毒素的周质表达的方法，其包括步骤: a)在发酵培养基中培养革兰氏阴性宿主细胞的培养物，其中所述宿主细胞用多核苷酸转化，并且其中所述多核苷酸编码细菌类毒素和周质信号序列； a(i))诱导所述细菌类毒素的表达； b)使所述宿主细胞成熟，其中所述成熟步骤包括: I)使宿主细胞接受PH休克； II)无补料添加孵育所述宿主细胞；和/或 III)使宿主细胞接受低于_20°C的温度；和 c)从所述宿主细胞提取细菌类毒素，其中所述提取方法包括渗透压休克。
2.用于细菌类毒素的周质表达的方法，其包括步骤: a)提供革兰氏阴性宿主细胞，其中所述宿主细胞用多核苷酸转化，并且其中所述多核苷酸编码细菌类毒素和周质信号序列并且其中所述革兰氏阴性宿主细胞包括在周质中表达的细菌类毒素； b)使所述宿主细胞成熟，其中所述成熟步骤包括: I)使宿主细胞接受PH休克； II)无补料添加孵育所述宿主细胞；和/或 III)使宿主细胞接受低于_20°C的温度；和 c)从所述宿主细胞提取细菌类毒素，其中所述提取方法包括渗透压休克。
3.权利要求1或2的方法，其中所述pH休克包括使发酵培养基的pH升高或降低多于0.2个pH单位或多于0.5个pH单位或0.1-2.0个pH单位或0.2-1.0个pH单位。
4.前述权利要求任一项的方法，其中所述孵育步骤包括孵育宿主细胞10分钟-1年、10分钟-6个月、10分钟-12小时、10分钟-6小时或10分钟-2小时，任选地在20°C -40°C的温度，例如23°C左右的温度下。
5.前述权利要求任一项的方法，其中步骤b)包括使宿主细胞接受低于-20 V、-40 V、-60 V、-70 V或-80 V的温度至少I小时、2小时、5小时、12小时、24小时、I天、2天或5天。
6.前述权利要求任一项的方法，其中步骤b)包括通过冷冻并然后融化宿主细胞的步骤。
7.前述权利要求任一项的方法，其中步骤b)包括: -使宿主细胞接受PH休克，随后在无补料添加的条件下孵育宿主细胞； -在无补料添加的条件下孵育宿主细胞，随后使宿主细胞接受PH休克； -在无补料添加的条件下孵育宿主细胞，随后使宿主细胞接受低于_20°C的温度； -使宿主细胞接受PH休克，随后使宿主细胞接受低于-20°C的温度； -使宿主细胞接受PH休克，随后在无补料添加的条件下孵育宿主细胞，随后使宿主细胞接受低于_20°C的温度；或 -在无补料添加的条件下孵育宿主细胞，随后使宿主细胞接受PH休克，随后使宿主细胞接受低于_20°C的温度。
8.前述权利要求任一项的方法，其中所述革兰氏阴性宿主细胞选自大肠杆菌 co7i)、假单胞菌属 iPseudomonas')和莫拉氏菌属(MoraxelIa)。
9.前述权利要求任一项的方法，其中所述革兰氏阴性宿主细胞在步骤b)期间是活的。
10.前述权利要求任一项的方法，其中细菌类毒素是白喉类毒素，例如CRM197。
11.权利要求1任一的方法，其中所述周质信号序列是:
a)任一SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24 或 26 ； b)SEQID NO: 2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24 或 26 包含 1、2 或 3 个点突变、插入或缺失的变体；或 c)SEQID NO: 2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24 或 26 的至少 10 个氨基酸的片段。
12.前述权利要求任一项的方法，其进一步包括纯化细菌类毒素的步骤d)。
13.前述权利要求任一项的方法，其进一步包含将细菌类毒素缀合糖的步骤e)，例如源自肺炎链球菌Cs pneumoniae),流感嗜血杆菌(/Z influenzae),脑膜炎奈瑟氏菌(JV.meningi tidis),金黄色葡萄球菌(51 aureus),粪肠球菌(/?.faecalius),屎肠球菌(β.faecium),沙门氏菌属{Salmonella、,或表皮葡萄球菌(51 epidermidis),例如选自1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F 的肺炎链球菌荚膜糖或B型流感嗜血杆菌(Hib)多糖或寡糖。
14.前述权利要求 任一项的方法，其中所述方法在发酵罐中进行。
15.前述权利要求任一项的方法，其进一步包括将细菌类毒素与进一步的抗原混合的步骤f)。
16.通过前述权利要求任一项的方法可获得的或者获得的细菌类毒素。
17.免疫原性组合物，其包括根据权利要求16的细菌类毒素和药学可接受赋形剂和/或佐剂。
18.疫苗，其包括权利要求17的免疫原性组合物。
19.权利要求17的免疫原性组合物或权利要求18的疫苗，用于疾病的预防或治疗。
20.权利要求17的免疫原性组合物或权利要求18的疫苗在用于疾病的预防或治疗的药物的制造中的用途。
21.预防或治疗疾病的方法，其包括向患者施用权利要求15的免疫原性组合物或权利要求17的疫苗。
【文档编号】C12P21/00GK103620050SQ201280028718
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2012年4月12日 优先权日:2011年4月13日
【发明者】P.M.H.德霍泰, P.戈芬 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司