发酵方法

专利名称：发酵方法
发酵方法
技术领域：
本发明涉及允许改善的细胞生长及原核生物宿主细胞中改善的多肽表达的发酵方法。尤其是，本发明涉及培养包含在甘露糖-诱导型启动子控制下编码多肽的表达载体的原核生物宿主细胞的发酵方法。
背景技术：
培养细胞的发酵方法在用于生物学和药学应用的活性物质的生产中非常重要。尤其是，该发酵方法应适合于以对于实际应用，诸如临床或商业用途足够的量产生期望的物质。已开发各种策略用于通过培养包含编码靶向多肽的可表达的核酸序列的原核生物宿主细胞达到靶向多肽的有效表达。表达效率强烈依赖于控制编码靶向多肽的核酸序列的表达的启动子。尤其是，期望允许产生高拷贝数的靶向多肽的具有高转录速度的启动子。而且，在发酵方法中，期望可控制靶向多肽表达。表达的控制可，例如，通过将编码靶向多肽的核酸序列可操作地连接到仅在适合的诱导物的存在下起始表达的诱导型启动子来达到。启动子是致使编码靶向多肽的核酸序列(结构基因)转录的核酸序列。尤其是，本发明涉及利用新载体的发酵方法，所述载体用于在包含可操作地连接到包含编码多肽的核酸序列的转录单元的甘露糖操纵子的启动子区的宿主中异源表达，然而所述核酸序列的表达被所述甘露糖操纵子的启动子区控制。通过适合的诱导，启动子活化及允许结构基因的转录。诱导可在负或正控制下。在负控制中，阻遏物结合到启动子及防止结构基因的转录。如果适合的诱导物存在，阻遏物被灭活及允许转录。在正诱导中，启动子在结合活化物之后活化，其中活化物结合到启动子由适合的诱导物介导。典型诱导物可为原核生物宿主代谢需要的底物，例如，不同类型的糖。本发明涉及正诱导性系统，其中在适合的底物，即诱导物的存在下，活化物结合到起始可操作地连接到所述启动子的基因的转录的启动子。迄今为止，原核生物宿主系统中的多数异源基因表达系统完全依赖于有限组的细菌启动子。因而，可用作诱导物的底物数也有限。而且，异源表达系统的产率依赖于可利用的转化的原核生物宿主数。由此，需要能生长到高细胞密度，即，允许细胞分裂中不释放载体地快速增殖的原核生物宿主系统。发明概述根据本发明，会自以下说明书明了的这些和其他目的已通过培养用新载体转化的原核生物宿主细胞的发酵方法来达到，所述新载体包含可操作地连接到包含对于所述宿主异源的核酸序列的转录单元，然而所述核酸序列的表达被所述甘露糖操纵子的启动子区控制的甘露糖操纵子的启动子区。根据特定方面，本发明提供培养细菌宿主细胞的方法，所述方法允许细菌宿主细胞生长到高细胞密度。也提供所述新载体在原核生物宿主中核酸序列的调控的表达中的用途；在包含甘露糖操纵子的启动子区的宿主中可表达的分离的及纯化的核酸序列；用所述载体或所述分离的及纯化的核酸序列转化的原核生物宿主；使用所述载体或所述分离的及纯化的核酸序列在宿主中产生多肽的方法；以及在发酵，尤其是在高细胞密度发酵中用所述载体或所述分离的及纯化的核酸序列转化的原核生物宿主的用途。其他目的和优势会对于本领域技术人员通过以下详述，以及参照附图，及随附的权利要求而显而易见。

其显示于图1来自manP启动子的转录起始位点的作图中使用的枯草芽胞杆菌 (B. subtilis)的核酸序列，亮显了在腺嘌呤核苷酸的转录起始位点，推导的-35和-10盒以斜体字显示，manR的结束和Iys基因的起始用箭标标记，和限制性位点BglII，XbaI，AflII 和NdeI加了下划线；图2包含manR启动子的启动子区的核酸序列，将在鸟嘌呤核苷酸的转录起始位点亮显，将推导的-10和-35盒以斜体字表示，通过箭标指示manR基因的起始，和HindIII 限制性位点和推定的ere序列加了下划线；图3自枯草芽胞杆菌(B.subtilis)获得的核酸序列，其包含如在pSU拟91， PSUN384. 1和pSUN385. 2中分别含有的manR启动子的启动子区，用箭标指示IacZ的起始， 和限制性位点加了下划线；图4根据本发明的表达载体pSUN279. 2的质粒图谱；图5根据本发明的分别含有质粒pSUN279. 2，pSUN 284. 1和pSUN 291的枯草芽胞杆菌(B. subtilis) 3NA的β -半乳糖苷酶活性；图6自枯草芽胞杆菌(B.subtilis)获得的核酸序列，其包含包括manR的C-端的自枯草芽胞杆菌(B. subtilis)的manP启动子的启动子区，manR和manP之间的基因间区，在这被报告基因IacZ取代，转录起始位点，-35和-10盒以粗体显示，通过箭标指示 manR的末端和IacZ的起始，和限制性位点加了下划线；图7含有质粒pSUN279. 2以及含有显示于图6的不同长度的核酸序列的片段的其他质粒的枯草芽胞杆菌(B. subtilis) 3NA的β -半乳糖苷酶活性；图8包含具有显示于图3的核酸序列的载体pSU拟91，pSUN384. 1和pSUN;345. 2 的枯草芽胞杆菌(B. subtilis) 3NA的β -半乳糖苷酶活性；图9根据本发明的表达载体ρ丽168.1的质粒图谱；图10枯草芽胞杆菌(B.subtilis) 3NA中ρ丽168. 1的质粒稳定性测试的结果的图，将含有质粒的细胞的procental部分对于代数标绘；图11 14对数性地显示对于发酵运行1 4的持续时间标绘的干生物质浓度的图，和对于发酵运行1 4的发酵的持续时间标绘的荧光信号(RFU)的图；以及
图15和16对于发酵运行5和6的发酵的持续时间标绘的荧光信号的图。发明详述如本文所用，提供以下定义以便有利于本发明的理解。“在宿主中可表达的载体”或“表达载体”是重组或合成产生的，允许宿主细胞中特定核酸序列的转录的一系列特定的多核酸元件的多核酸构建体。一般而言，此载体包括包含可操作地连接到启动子的待转录的特定核酸序列的转录单元。在宿主中可表达的载体可为例如自主或自身-复制质粒，粘粒，噬菌体，病毒或反转录病毒。术语“宿主”，“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文互换使用以指示已导入本发明的一种或更多载体或分离的及纯化的核酸序列的原核生物细胞。需知，该术语不仅指称特定受试者细胞，而且指称该细胞的后代或潜在后代。因为由于突变或环境影响，某些修饰可在后代发生，实际上，该后代可与亲本细胞不同，但仍包括在如本文所用的术语的范围之内。术语“包含”通常以包括的含义使用，其是说允许存在一种或更多其他特征或组分。如本文所用，“启动子”指称控制转录单元的表达的核酸序列。“启动子区”是能在细胞中结合RNA聚合酶及起始下游(3’方向)编码序列的转录的调控区。启动子区之内会发现负责RNA聚合酶诸如推定的-35盒和ft~ibnow盒(-10盒)的结合的蛋白结合结构域 (共有序列)。而且，启动子区可包含转录起始位点及调控蛋白的结合位点。“甘露糖操纵子”指称枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的甘露糖操纵子。在甘露糖操纵子中鉴定了 3种基因(Kunst F. N. et al.，"The complete genome sequence of gram-positive bacterium Bacillus subtilis，，，Nature 390, P249-256(1997))ο第1基因，manP，编码属于果糖-通透酶家族的甘露糖特定酶组分(转运子)。第2 基因，manA，编码甘露糖-6-磷酸异构酶，然而第3基因，yjdF的功能未知。调控基因，manR 位于这3种基因的上游及以相同的取向，其编码ManR，甘露糖操纵子的活化物。甘露糖操纵子，由3个基因manP-manA-yjdF (挨个连接，指称为“manP”)组成，在本身被正调控的manP启动子的控制下。另一启动子，manR启动子，负责manP-启动子的甘露糖-依赖性诱导必要的manR 的表达。manR启动子区还包含manR基因的分解代谢物调节物蛋白结合位点(分解代谢物响应元件(ere))。"Cre序列”指称位于分解代谢基因的上游(5’方向)的核酸序列。ere序列结合防止碳分解代谢物阻遏(CCR)中分解代谢基因的表达的分解代谢物控制蛋白(CCP)。“甘露糖操纵子的启动子区”意指调控manP以及含或不含ere序列的manR的表达的启动子区。“manP启动子”如本文所指称，包含至少-35区，Pribnow盒，及ManR结合位点。“manR启动子”如本文所指称，包含至少推定的-35区，Pribnow盒，ManR结合位点及，任选地，ere序列。也指称为“甘露糖”的D-甘露糖是葡萄糖的2-差向异构体，且存在于甘露聚糖和杂甘露聚糖多糖，糖蛋白和多种其他复合糖。“CcpA”是指“分解代谢物控制蛋白A”，其为全局调节物蛋白，且可活化或阻遏一些分解代谢操纵子的活化。在甘露糖操纵子的情况中，CcpA通过结合ere-序列来起到阻遏作用。“增强子”是独立于转录单元的识别，关于转录单元的序列位置，或序列取向而发挥增强转录单元的转录的作用的核酸序列。本发明的载体任选地可包括增强子。如本文所用，“转录单元”指称正常转录为单RNA分子的核酸序列。转录单元可含有编码功能性地相关的多肽分子的一个基因(单顺反子)或2个(二顺反子)或更多基因 (多顺反子)。核酸序列当与另一核酸序列放入功能关系时是“可操作地连接的”。例如，启动子可操作地连接到编码序列，如果其影响序列的转录；或转录起始区，诸如核糖体结合位点可操作地连接到编码例如多肽的核酸序列，如果其定位为辅助多肽的翻译。连接可通过在方便的限制性位点连接来实现。如果该位点不存在，根据常规实践使用合成寡核苷酸衔接子或接头。如在本发明中指称的“核酸”或“核酸序列”或“分离的及纯化的核酸或核酸序列” 可为DNA，RNA或DNA/RNA杂交体。在核酸或核酸序列位于载体的情况中，其通常为DNA。DNA 在本文可为任何聚脱氧核苷酸序列，包括，例如双链DNA，单链DNA，一条或两条链由2个或更多片段组成的双链DNA，一条或两条链具有未打断的磷酸二酯主链的双链DNA，含有一个或更多单链部分及一个或更多双链部分的DNA，DNA链完全互补的双链DNA，DNA链仅部分互补的双链DNA，环状DNA，共价闭合的DNA，线性DNA，共价交叉-连接的DNA，cDNA,化学-合成的DNA，半-合成DNA，生物合成DNA，天然地-分离的DNA，酶-消化的DNA，剪切的DNA， 标记的DNA，诸如放射性标记的DNA和荧光色素-标记的DNA，含有一种或更多非-天然存在的核酸种类的DNA。DNA序列可通过标准化学技术，例如，磷酸三酯方法或经自动化的合成方法和PCR方法合成。纯化的及分离的DNA序列也可通过酶促技术产生。RNA在本文可为例如单链RNA，cRNA,双链RNA，一条或两条链由2个或更多片段组成的双链RNA，一条或两条链具有未打断的磷酸二酯主链的双链RNA，含有一个或更多单链部分及一个或更多双链部分的RNA，RNA链完全互补的双链RNA，RNA链仅部分互补的双链 RNA,共价交联的RNA，酶-消化的RNA，剪切的RNA，mRNA，化学-合成的RNA，半-合成RNA， 生物合成RNA，天然地-分离的RNA，标记的RNA，诸如放射性标记的RNA和荧光色素-标记的RNA，含有一个或更多非-天然存在的核酸种类的RNA。“变体”或“序列变体”意指通过保守性核酸取代自参照序列改变的核酸序列，其中一个或更多核酸被具有相同的特征的另一个取代。变体还包括变质的序列，具有缺失和插入的序列，只要该修饰的序列与参照序列呈现相同的功能(功能性地相当体)。如本文所用，术语“多肽”，“肽”，“蛋白”，“多肽”和“肽”互换使用，以指定通过相邻残留物的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接的一系列氨基酸残基。术语“分离的及纯化的核酸序列”指称核酸序列会根据本发明所处于的状态。核酸序列会无或基本上无与它们天然地关联的物质，诸如见于它们的天然的环境，或制备(当该制备是通过重组技术体外或体内实践的时)它们的环境(例如细胞培养)的其他核酸。术语“转化”，“转化的”或“引导核酸进入宿主细胞”表示细胞外核酸如载体，有或无伴随物质，进入宿主细胞的任何过程。术语“转化的细胞”或“转化的细胞”是指已导入细胞外核酸而由此带有细胞外核酸的细胞或其后代。可将核酸导入细胞，从而核酸可作为染色体整合体或作为额外染色体元件复制。适当的宿主细胞用例如表达载体的转化可通过熟知的方法诸如微注射，电穿孔，粒子轰击或通过化学方法诸如磷酸钙-介导的转化实现，例如描述于 Maniatis et al. 1982,Molecular CloningiA laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory or in Ausubel et al. 1994，Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons0“异源核酸序列，，或“对于宿主异源的核酸序列，，是指编码例如表达产物诸如对于宿主外源的多肽(“异源表达”或“异源产物”)的核酸序列，即来源于不同于宿主的供体的核酸序列，或编码例如表达产物诸如对于宿主外源的多肽的化学合成的核酸序列，或源于宿主及编码由所述宿主天然地表达的多肽的核酸序列，其中核酸序列被插入载体及在本发明的甘露糖操纵子的启动子区的控制下。在宿主是特定原核生物物种的情况中，异源核酸序列可来源于生物的不同属或科，自不同目或纲，自不同门(部)或自不同域(界)。异源核酸序列可在将其导入宿主细胞之前，通过单核酸或一部分异源核酸序列的突变，插入，缺失或取代来修饰，只要该修饰的序列与参照序列呈现相同的功能(功能性地相当体)。异源核酸序列如本文所指称，还包括来源于生物诸如自真核生物的不同域(界) (真核起源)的序列，诸如例如已用于噬菌体展示库及已根据原核生物宿主的“密码子利用”修饰的单核酸或一部分核酸序列的人抗体。“转录起始区”是促进转录起始及包含核糖体结合位点的序列诸如Siine Dalgarno序列的信号区。一般，转录起始区位于转录起始位点的下游及可操作地连接到要表达的基因。“转录终止区”指称导致RNA聚合酶终结转录的序列。转录终止区通常是可避免其他附近基因的不需要的转录或自其他潜在启动子的转录的转录单元的部分，和可增加mRNA 的稳定性。“抗体”指称被抗原刺激之后，由免疫系统的B细胞产生的一类血浆蛋白。哺乳动物(即人)抗体是Ig G，M，A，E或D类的免疫球蛋白。为本发明的目的使用的术语“抗体” 包括，但不限于，多克隆抗体，单克隆抗体，抗-特应抗体和存在于自身免疫疾病，诸如糖尿病，多发性硬化和类风湿性关节炎的自体-抗体以及嵌合抗体。一方面，本发明利用在宿主中可表达的载体，所述载体包含可操作地连接到包含可对于该宿主异源的核酸序列的转录单元的甘露糖操纵子的启动子区，然而，所述核酸序列的表达被所述甘露糖操纵子的启动子区控制。本发明的载体优选为自主或自身-复制质粒，粘粒，噬菌体，病毒或反转录病毒。 在表达本发明的核酸序列中可采用广泛的宿主/载体组合。有用的表达载体，例如，可由染色体，非-染色体和/或合成核酸序列段组成。适合的载体包括具有特定宿主范围的载体，诸如特异于分别例如枯草芽胞杆菌 (B. subtilis)和大肠埃希氏菌(E.coli)的载体，以及具有广-宿主-范围的载体，诸如对于革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌有用的载体。可使用“低-拷贝”，“中等-拷贝”以及“高-拷贝”质粒。
例如，在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中，低拷贝质粒是pAMbetal，中等拷贝质粒是PBS72衍生物，高拷贝质粒是pUBllO。根据本发明，甘露糖操纵子的启动子区分别包含manR启动子区和manP启动子区。自枯草芽胞杆菌(B. subtilis)的核酸序列包括manR的C-端，manR和manP之间的基因间区，之后是作为报告基因的溶葡萄球菌酶基因lys，显示于图1。本发明的核酸序列包含manP的启动子区，优选包含图1自bp_80至Iys的起始密码子的核酸序列(SEQ ID NO 1)和更优选图1自bp-80和包括bp-Ι，即在bp+Ι的转录起始位点A的上游的核酸序列(SEQ ID NO :2)。自枯草芽胞杆菌(B. subtilis)的核酸序列包括manR的启动子区，在bp+Ι的转录起始位点G，推定的ere序列，bp+1和manR之间的转录起始区，以及manR的部分，显示于图 2和图3，其中manR被IacZ取代。本发明的核酸序列包含manR的启动子区，优选包含图3自bp_122至IacZ的起始密码子的核酸序列(SEQ ID NO 3)，更优选地，图3自bp-122及bp+7的核酸序列，即包括推定的ere-序列，(SEQ ID NO :4)，及，尤其是，图3自bp-122及bp-Ι，即在pb+Ι的转录起始位点G的上游的核酸序列(SEQ ID NO 5)。两个启动子区manP和manR包含ManR的结合位点。本发明也包括与SEQ ID NO 1 5之任何和其变体互补的序列。本发明中使用的甘露糖操纵子的启动子区，诸如manP启动子区，manR启动子区 (有或无ere序列)以及根据序列SEQ ID NO :1 5的启动子区，其序列互补或其变体通常来自枯草芽胞杆菌(B. subtilis)的甘露糖操纵子或自其他原核生物的功能相当体启动子区，尤其是芽孢杆菌科(Bacillaceae)生物。其他原核生物的功能相当体启动子区包括可被甘露糖诱导的启动子区，即在甘露糖存在下相比在甘露糖缺失下具有更高表达活性的启动子区。在许多原核生物，诸如硬壁菌门(Firmicutes)如枯草芽胞杆菌(B. subtilis)中， 甘露糖操纵子涉及D-甘露糖代谢。枯草芽胞杆菌(B. subtilis)可使用许多不同糖作为碳源。己糖诸如葡萄糖和 D-甘露糖主要经磷酸烯醇式丙酮酸碳水化合物磷酸转移酶系统(PTQ摄取。在PTS中， 相应己糖在摄取过程中被同时磷酸化及运输到细胞。特定糖底物的摄取和利用经历碳分解代谢物阻遏(CCR)。在葡萄糖的存在下，枯草芽胞杆菌(B. subtilis)的优选的糖底物，阻遏用于其他底物的摄取和利用的基因诸如甘露糖操纵子的转录。本领域已广泛研究及知道枯草芽胞杆菌(B. subtilis)中葡萄糖依赖性CCR的机理(Stiilke J. et al. , "Regulation of carbon catabolism in Bacillus species，，，in Annu. Rev. Microbiol. 54，2000，第 849 880 页)。根据本发明的转录单元通常还包含所述转录单元的翻译的起始点(起始密码子) 的翻译起始区上游，然而翻译起始区可操作地连接到核酸序列。翻译起始区通常位于与转录单元的翻译的起始点(其可为ATG，GTG或TTG)直接相邻的上游。翻译起始区可为甘露糖操纵子中manP基因或manR基因的转录单元的翻译起始区。甘露糖操纵子的manP或manR基因的翻译起始区可被其他翻译起始区部分或完全取代。可使用例如，均来自枯草芽胞杆菌(B. subtilis)的tufA(延伸因子Tu)和 gsiB (应激蛋白 Jurgen et al.，1998，Mol. Gen. Genet. 258，538-545)的翻译起始区。有转录起始区和相应基因的起始的tufA和gsiB的相应核酸序列示于下，将起始密码子以粗体显示，限制性位点加下划线，及将Shine-Dalgarno-序列亮显。tufA 5 ‘ -CttaaqGAGGATTTTAGA ATG GCTAAAGAAAAATTCggatcc-3 ‘AflII SD 起始密码子BamHIgsiB 5 ‘ -cttaagAATTAAAGGAGGAATTCAAA ATG GCAGACAATAACAAAggatcc-3 ‘AflII SD 起始密码子BamHI通过转录起始区的适合的选择，可增强mRNA的稳定性，这是基因表达中的重要特征。mRNA的稳定性特征在于其特定半衰期。除了转录起始区之外，也可取代翻译起始点，以及，任选地，起始点后的基因的许多密码子，例如约5 6个密码子，例如以上tufA和gsiB的核酸序列中分别显示的。翻译起始区可还包含可操作地连接到要表达的核酸序列的编码信号序列的序列。 信号序列通常位于与翻译起始点直接相邻的下游。在使用二顺反子或多顺反子转录单元的情况中，可应用可操作地连接到各顺反子的不同或同一信号序列。优选不同信号序列用于该情况。使用的信号序列可为原核生物或真核生物信号序列。通常应用原核生物信号序列。要在本发明的表达载体中采用的编码信号序列的DNA序列可商业上获得或化学合成。例如，信号序列可根据固相亚磷酰胺三酯法合成，例如描述于Beaucage & Caruthers,1981, Tetrahedron LeHs. 22，1859—1862 如描述于 Van Devanter et. Al.， Nucleic Acids Res. 12 :6159-6168 (1984)。寡核苷酸的纯化可通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或通过如描述于 Pearson & Reanier，J. Chrom. 255 137-149 (1983)的阴离子-交换 HPLC 进行。通常转录单元还包含转录终止区。优选地，使用强转录终止区来避免被启动子“通读”出转录单元而进入侧接质粒序列，以及自其他质粒启动子进入转录单元。在该转录终止区的存在下观察到mRNA的进一步稳定。用于强转录终止区的适合的例具有来自可商购的枯草芽胞杆菌(B. subtilis) 168 的 tufA 的 3，-区的核酸序列 5，-CGAGACCCCTGTGGGTCTCG-3，。根据本发明，可使用编码对于宿主外源的表达产物的异源核酸序列。在宿主是原核生物物种诸如枯草芽胞杆菌(B. subtilis)或大肠埃希氏菌(E.coli)的情况中，目的核酸序列可来自另一纲，如Y-蛋白杆菌，诸如自例如伯霍尔德杆菌属(Burlcholderia sp.)， 尤其是自不同门，诸如古细菌，或，最特定自真核生物，诸如哺乳动物，尤其是自人。但是，可根据宿主的“密码子利用”修饰异源核酸序列。本发明的异源序列通常是目的基因。目的基因优选包括异源多肽诸如结构，调控或治疗性蛋白，或结构，调控或治疗性蛋白与其他蛋白(“Tag”)诸如绿色荧光蛋白的N-或C-端融合物或其他融合蛋白。异源核酸序列还可编码可以RNA，诸如例如反义-RNA形式使用的转录物。蛋白可作为不溶性聚集物或作为存在于宿主细胞的细胞质或周质空间，和/或存在于细胞外培养基的可溶性蛋白产生。优选地，蛋白作为存在于宿主细胞的周质空间和/ 或存在于细胞外培养基的可溶性蛋白产生。目的异源蛋白可为人，哺乳动物或原核生物起源。其他蛋白是抗原，诸如自微生物病原体的糖蛋白和碳水化合物，病毒和抗细菌剂二者，及自肿瘤。其他蛋白是酶如凝乳酶， 蛋白酶，聚合酶，脱氢酶，核酸酶，葡聚糖酶，氧化酶，α -淀粉酶，氧化还原酶，脂肪酶，酰胺酶，腈水合酶，酯酶或腈水解酶。在本发明中，信号序列和异源核酸序列在表达载体之内排列的顺序及距离可改变。在优选的实施方式中，信号序列是5’(上游)到编码例如目的多肽的核酸序列。信号序列和编码例如目的多肽的核酸序列可隔0 约1000个氨基酸。在优选的实施方式中，信号序列和编码例如目的多肽的核酸序列彼此直接相邻，即隔0个核酸。优选地，本发明的载体包含根据序列SEQ ID NO :1 5之任何，其序列互补及其变体的甘露糖操纵子的启动子区。本发明也包括本发明的载体在本发明的用于原核生物宿主中核酸序列的调控的异源表达的发酵方法中的用途。在再一方面，本发明提供包含甘露糖操纵子的启动子区的分离的及纯化的核酸序列。优选地，分离的及纯化的核酸序列包含甘露糖操纵子的manP启动子和/或manR启动子。更优选地，分离的及纯化的核酸序列包含SEQ ID NO :1 5之任何。包含甘露糖操纵子的启动子区的分离的及纯化的核酸序列可可操作地连接到包含编码多肽的核酸序列的转录单元，其中编码多肽的核酸序列的表达在甘露糖操纵子的启动子区的控制下。本发明的分离的及纯化的核酸序列可根据标准PCR流程和本领域熟知的方法分离。纯化的及分离的DNA序列可还包含一个或更多调控序列，如本领域所知道，例如增强子，通常用于由核酸序列编码的产物的表达。为了选择用本发明的载体或分离的及纯化的核酸序列成功地和稳定地转化的宿主细胞，可将编码可选择的标记物(例如抗生素抗性)的基因随目的核酸序列导入宿主细胞。编码可选择的标记物的基因可位于载体或位于分离的及纯化的核酸序列或可任选地以分离的形式共导入，例如分离的载体。可使用的各种可选择的标记物包括赋予抗生素抗性的那些，诸如大观霉素，潮霉素，氨苄西林和四环素。可根据需要适应抗生素的量，以便创建选择性条件。通常使用一种可选择的标记物。在载体是穿梭载体的情况中，可使用对于适合的宿主常见的标记物。例如，在载体是在大肠埃希氏菌(E.coli)和枯草芽胞杆菌(B.subtilis)中可复制的穿梭载体的情况中，可使用赋予对于大观霉素的抗性的编码粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的大观霉素-腺苷酸转移酶的抗性标记物基因。可将其他报告基因诸如荧光蛋白随着目的核酸序列导入宿主细胞，以便测定转化效率。适合的报告基因是，例如，编码增强的绿色荧光蛋白(eGFP)的那些和编码β-半乳糖苷酶的lacZ。两种报告基因可商购及被广泛使用。
本发明的另一方面提供用本发明的载体转化的原核生物宿主，其中载体包含甘露糖操纵子的启动子区。优选载体包含SEQ ID NO :1 5之任何，其序列互补或其变体。广泛的原核生物宿主细胞有用于用本发明的甘露糖操纵子的甘露糖-诱导型启动子区转化。这些宿主可包括革兰氏阳性细胞株，诸如芽孢杆菌属(Bacillus)和链霉菌属 (Str印tomyces)。优选地，宿主细胞是硬壁菌门(Firmicutes)，更优选宿主细胞是芽孢杆菌属(Bacillus)。可使用的芽孢杆菌属(Bacillus)是例如枯草芽胞杆菌(B. subtilis)，解淀粉芽胞杆菌(B. amyloliquefacien),地衣芽孢杆菌(B. Iicheniformis),纳豆芽胞杆菌(B.natto)，巨大芽胞杆菌(B. megaterium)株，等。优选宿主细胞是枯草芽胞杆菌 (B. subtilis)，诸如枯草芽胞杆菌(B. subtilis) 3NA和枯草芽胞杆菌(B. subtilis) 168。可使用的大肠埃希氏菌(E. coli)是例如可商购的株TG1，W3110，DH1，XL1-Blue和 Origami。适合的宿主细胞是可商购的，例如，自保藏中心诸如DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig,德国)。例如，芽孢杆菌属(Bacillus)可自芽孢杆菌遗传保藏中心(Bacillus Genetic Stock Center)获得。宿主细胞可或可不代谢甘露糖。可将通常能摄取及代谢甘露糖的宿主细胞如枯草芽胞杆菌(B. subtilis)修饰为在与甘露糖的摄取和/或代谢相关的一种或更多功能上缺陷。在与甘露糖的摄取和/或代谢相关的一种或更多功能上的缺乏可通过例如抑制或阻断编码蛋白的基因诸如编码甘露糖-6-磷酸-异构酶的manA基因的表达来达到。此可通过知道的技术诸如转座子支持的诱变或敲除突变来进行。通常，原核生物宿主对应于选择的信号序列，例如在使用芽孢杆菌属(Bacillus) 的信号序列的情况中，宿主细胞通常是芽孢杆菌科(Bacillacea)的相同的家族的成员，更优选宿主细胞是芽孢杆菌属(Bacillus)株。优选，使用具有磷酸烯醇式丙酮酸碳水化合物磷酸转移酶系统(PTS)的宿主。尤其是，具有PTS系统的宿主是芽孢杆菌目(Bacillales)，尤其是芽孢杆菌属 (Bacillus)的微生物和更优选物种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或肠杆菌目 (Enterobacteriales)，优选埃希氏菌属Escherichia)的微生物和更优选物种大肠埃希氏菌(E. coli)。CCR的主要原件是分解代谢物控制蛋白A (CcpA)，其能结合ere-序列，诸如SEQ ID NO :3和4中的推定的ere序列。在CcpA的结合的状态中，阻遏相应基因，在本文中manR的转录。在葡萄糖的缺失下及在诱导物诸如D-甘露糖的存在下，无通过CcpA的结合的阻遏，以及通过调控蛋白(ManR)与甘露糖操纵子的启动子区的相应结合位点的结合起始甘露糖操纵子的基因的转录。意外地，本发明人发现，ManR不仅是manP启动子区的调控蛋白，而且是manR本身的自调节物。本发明提供培养包含载体的原核生物宿主细胞的发酵方法，所述载体包含可操作地连接到包含编码多肽的核酸序列的转录单元的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的甘露糖操纵子的甘露糖诱导型启动子，其中在第1步骤中，将原核生物宿主细胞在不同于诱导型启动子的诱导物的第1碳源的存在下培养，且在第2步骤中，将原核生物宿主细胞在所述诱导物的存在下培养。不同于诱导物的碳源一般是宿主细胞的主要碳源，然而诱导物一般是宿主细胞的次要碳源。主要碳源是被宿主细胞优选消耗的及，由此，作为发酵方法中的底物有用。对于许多原核生物宿主细胞而言，葡萄糖是主要碳源，且可在那些原核生物细胞的发酵方法中作为底物适宜地使用。本发明还提供在宿主细胞中产生多肽的方法，其包括下列步骤(a)构建载体，(b)用所述载体转化原核生物宿主，(C)使所述多肽在适合的条件下在细胞培养系统中表达，(d)自细胞培养系统回收所述多肽。使用的载体，以及其构建和原核生物宿主的转化如以上定义，然而载体包含的异源核酸序列编码多肽。作为细胞培养系统，可在培养管，振摇瓶或细菌发酵罐中应用连续或非连续培养诸如分批培养或补料分批培养。本发明的优选发酵方法是补料分批发酵。补料分批过程的特征在于不撤出溶液地底物向培养肉汤的限时补给。补给可为连续或间隔。一般而言，补料分批过程包含分批期， 期间细胞起初生长到期望的浓度。在此期间，细胞生长高，且通常无靶向多肽产生，除非添加诱导物。在达到期望的细胞浓度之后，补给底物的补给期开始。一般而言，诱导物在补给期期间添加。对于培养宿主细胞而言，可使用如本领域所知道的常规培养基，诸如复合培养基如“营养酵母肉汤培养基”，Kortz et al. 1995，J. Biotechnol. 39，59-65描述的含有甘油的培养基，Kulla et al.，1983，Arch. Microbiol, 135，1 描述的矿物质盐培养基，Wilms et al.，2001，Biotechnol. Bioeng. 73,95-103 描述的用于枯草芽胞杆菌(B. subtilis)发酵的分批培养基或 Bertram et al，1051，J. Bacteriol. 62，四3_300 描述的 LB-培养基。培养基包含适合的碳源，例如糖诸如葡萄糖作为待生长的宿主细胞的底物。作为底物使用的碳源不同于诱导物。可根据适当修饰培养基，例如通过添加进一步成分诸如本领域技术人员通常知道的缓冲剂，盐，维生素，氨基酸，抗生素或其他微量营养素。同样，细胞培养期间可使用不同培养基或培养基的组合。优选地，作为基础培养基使用的培养基应不包括诱导物，以便达到甘露糖启动子区的紧密调节。在本发明的发酵方法中，通过添加适合的诱导物开始表达。甘露糖操纵子的诱导物是甘露糖。此外，可使用能诱导甘露糖操纵子的manR启动子区或manP启动子区的甘露糖的衍生物。表达可通过原核生物宿主可利用的诱导物的量来调控。可在培养达到测定参数之后起始诱导物的添加。该测定参数的例是指示培养的细胞浓度或不同于诱导物的底物诸如碳源的浓度的光密度(OD)。
例如，在本方法中，诱导物可在培养达到适当的OD之后添加，依赖于特定培养系统。对于分批培养，在振摇瓶中，作为测定参数的典型0D_是约0. 3或更高。在分批期中，根据本发明的补料分批培养的一实施方式，当在培养基中仅主要碳源是可利用时，细胞生长到20 300D·之间的细胞密度及，然后，培养随着主要碳源和诱导物的混合物的添加而切换到补给期。在补给期中，主要碳源诱导物的比可改变，适合的比是3 1至1 3。通过主要碳源诱导物的比的改变，可控制表达速度。可依赖于发酵的特定条件选择添加的诱导物的量。可根据特定培养系统选择诱导物的添加模式(诱导方案)。通过添加模式，可进一步调控宿主细胞的生长速率和表达速度。例如，可经适合的时期不连续地或连续添加诱导物。在非连续模式(冲击诱导)中，添加可为仅在诱导点一次，或以适合的间隔两次或甚至几次。适合的模式依赖于培养系统和可由本领域技术人员容易测定。例如，在连续模式中，可以恒定速度或降低/增加速度添加诱导物。连续添加可进一步在培养的选择的时间间隔，例如培养的指数生长期间的选择的时间间隔之内。而且，非连续和连续诱导方案的组合是可能的。如果以2个或更多部分添加诱导物，进一步诱导物的添加可在培养达到第2测定参数之后起始。第2测定参数可为，例如，光密度0D，表达的多肽的浓度，溶液中的诱导物浓度或报告基因的表达的信号强度。通常，将原核生物宿主的培养的培养基中诱导物的量调至约10g/l，优选约5g/l， 更优选约2g/l。补料期间添加的诱导物的量可经补给时期改变。如上所述，主要碳源诱导物的比的变化允许表达速度，即细胞密度的调节。适当的pH范围是，例如，6-8优选7-7. 5，适当的培养温度在10和40°C之间，优选在30和37°C之间。通常温育细胞，直到蓄积了最大量的表达的产物和/或生物质，优选1小时和20 天之间，更优选5小时和3天之间。作为生物质的产率，表达的产物量也依赖于使用的培养系统。在振摇瓶中，用经本发明的载体转化的宿主可产生通常以0.5g/l培养基的量表达产物的培养物。使用发酵罐，以分批和/或补料分批模式，可获得以通常大于0. 5g/l发酵肉汤，优选大于lg/Ι，尤其是大于1. 3g/l的量表达产物的培养物。而且，在使用宿主细胞的本发明的发酵方法中，可得到至少10 300D·，尤其是至少500D6(1(1，500D_和更大之间，更优选至少5000D·和最优选的至少10000D·的高细胞密度。尤其是，在根据本发明的补料分批方法中，可获得500D·和大于10000D·之间的细胞密度。为例证，IOD600对应于平均约0. 322g干质量/1。因而，100的OD6tltl值对应于32. 2g 干质量/g和5000D_161g干质量/1。通过本发明的特定诱导方案，根据需求分别考虑到生物质，表达产物和诱导物消费，发酵聚焦可以最大化输出改变。例如，与第1冲击诱导的组合的诱导方案和以指数速度的诱导物的额外的补给导致相对于生物质浓度的靶向多肽高表达，其使进一步处理，诸如纯化步骤等更有效，及，由此，节省时间及成本。此外，本发明的宿主细胞的发酵允许无载体损失的高复制速度。根据本发明的发酵方法的一实施方式，培养宿主细胞诸如芽孢杆菌属 (Bacillus)，其包含携带可操作地连接到编码靶向多肽的核酸序列的甘露糖操纵子，PmanR 或PmanP的启动子的载体。对于芽孢杆菌属(Bacillus)，优选的底物是葡萄糖。而且，甘露糖操纵子的启动子的诱导物是甘露糖。优选，发酵以补料分批模式进行。更优选地，如上所述，通过仅添加葡萄糖，宿主细胞在分批期期间生长，直到约20 30的OD6tltl的细胞密度。 随后补给期期间，可添加葡萄糖和诱导物甘露糖的混合物。也如上所述，在混合物中，葡萄糖与甘露糖的比可改变，例如自3 1至1 3。此夕卜，也可能仅补给甘露糖。优选地，除了甘露糖启动子之外，载体也可包含调控基因manR的完全或部分序列。发酵和在宿主细胞中表达之后，表达的产物诸如目的多肽则可自宿主细胞的培养回收。为了获得表达的产物的最大产率，通常在培养末了收获细胞，及诸如通过溶菌酶处理，超声处理或弗压碎器裂解来裂解。由此，多肽通常作为宿主细胞的粗裂解物首次获得。 它们可然后通过本领域知道的标准蛋白纯化过程纯化，其可包括差异沉淀，分子筛层析，离子-交换层析，等电聚焦，凝胶电泳，亲和性及免疫亲和性层析。这些熟知的和常规实践的方法描述于，例如 Ausubel et al. , supra. , and Wu et al. (eds. ) ,Academic Press Inc., N. Y. ；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology。例如，重组产生的免疫球蛋白的纯化，它们可用免疫亲和性层析通过含有结合有表达的免疫球蛋白可特异性结合的靶分子的树脂的柱来纯化。本发明也涉及在原核生物宿主中编码例如多肽的核酸的细胞内异源表达的方法和手段。尤其是，本发明涉及载体和该载体用于使用本发明的载体在原核生物宿主中异源多肽的细胞内表达的用途。在细胞内表达中，多肽在细胞质之内表达及不自细胞质运输到非-细胞质位置。 多肽会以包含体形式或以可溶性形式在细胞质之内表达。也熟知用于自细胞，尤其是自细胞提取物分离及纯化多肽的方法。本发明的甘露糖启动子有利，它们可通过常见的和非-毒性及由此工业上有用的化合物紧密调控，诱导。而且，本发明的甘露糖启动子以及包含该甘露糖启动子的载体在细胞之内稳定， 及甚至在多次细胞复制之后不失。由此，根据本发明转化的宿主细胞可有利地生长至非常高的细胞密度。本领域技术人员会同意，本文所述的本发明对除了那些特别描述的之外的变异和修饰灵敏。需知，本发明在不离开精神或其必要的特征的情况下包括全部该变异和修饰。本发明也包括此说明书中，个别或共同指称或指出的全部步骤，特征，组合物和化合物，及任何和全部组合或任何2种或更多所述步骤或特征。本公开因此应被认为是在全部方面例证且是非限制性的，通过随附的权利要求指示的本发明的范围，及相当的含义及范围之内的全部变化旨在包括在本文中。贯穿此说明书引用了各种参考文献，各通过引用整体并入本文。上述描述将参照下列实施例更完全地明晰。但是，该例仅为实行本发明的方法的例示，及不旨在限制本发明的范围。
实施例1甘露糖操纵子的manR启动子和manP启动子的启动子区的分离和鉴定如果不另外陈述，使用下列材料和方法细菌株和生长条件将大肠埃希氏菌(E.coli)JM109 (Yanisch-Perron C. et al.，Gene33,1985， 103-119)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subti 1 is) 3NA (Michel J. F. et al.，J. App 1. Bacteriol. 33,1970, 220-227)用作用于克隆及表达的主要宿主。使大肠埃希氏菌 (E. coli)在 LB 液体培养基(Luria S. E. et al.，Virology 12，1960，348-390)和补充了 100μ g/ml氨苄西林或大观霉素的LB琼脂板中于37°C生长。使枯草芽胞杆菌(B. subtilis) 在LB液体培养基和C或S最小培养基中于37 °C生长(Martin-Verstraete I.et al.， J. Mol. Biol. 214，1990,657-671)。液体培养基和琼脂板分别补充了 100 μ g/ml大观霉素， 10 μ g/ml卡那霉素或5 μ g/ml红霉素。为诱导甘露糖启动子，以0. 2% (w/v)的终浓度添加无菌过滤的或高压灭菌的D-甘露糖。材料全部化学品从Sigma-Aldrich (Taufkrichen，德国)，Fluka (Buchs,德国)或 Merck (Darmstadt，德国)得到。合成 DNA 寡核苷酸购自 Eurofins MWG Operon (Ebersberg, 德国)。限制酶和DNA修饰酶购自 Roche Applied Science (Mannheim，德国)或New England Biolabs。 (Frankfurt am Main,iIH ) 。 PCR M 自 Fermentas (ST. Leon-Rot, H )的真度-DNA聚合酶在自Biozym的MiniCycler上运行。DNA的制备和转化用Qiagen (Hilden，Gemrany)或 Roche (Mannheim，德国)的 DNA 制备试剂盒如制造商所描述进行自大肠埃希氏菌(E. coli)和枯草芽胞杆菌(B. subtilis)或自琼脂糖凝胶的DNA-分离。贯穿实施例使用标准分子技术。如Chung C. T. et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86，1989，2172-2175所述将大肠埃希氏菌(E. coli)用质粒DNA转化。将枯草芽胞杆菌(B. subtilis)用质粒DNA根据修饰的“巴黎方法，，转化(Harwood C. R. Molecular Biological Methods for Bacillus, 1990, John Wiley & Sons Ltd. , England)。β-半乳糖苷酶活性测量将要在0. 9ml Z-缓冲剂中检查的0. Iml的细胞于37°C用10 μ 1甲苯处理30min。 用ο-硝基苯基-β -吡喃半乳糖苷于22°C根据Miller氏方法测定β -半乳糖苷酶活性 (Miller J. H. , 1972, experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor, NY)。使用的寡核苷酸表1
权利要求
1.培养原核生物宿主细胞的方法，其中将原核生物宿主细胞用表达载体转化，所述表达载体包含可操作地连接到包含编码多肽的核酸序列的转录单元的枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)的甘露糖操纵子的诱导型启动子，其中诱导型启动子的诱导物是能诱导启动子的甘露糖或其衍生物， 其中，在第1步骤中，将原核生物宿主细胞在不同于诱导物的第1碳源的存在下培养，且在第2步骤中，将原核生物宿主细胞在所述诱导物的存在下培养。
2.权利要求1的方法，其中诱导物的添加在培养达到测定参数之后开始。
3.权利要求1或2的方法，其中测定参数是选自光密度(OD)和碳源浓度的至少一种。
4.权利要求3的方法，其中测定参数是在600nm处的光密度。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中方法是补料分批方法。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中经时连续添加全部或部分诱导物。
7.权利要求1 6中任一项的方法，其中以一份加入至少部分诱导物。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中以经时指数地增加的速度加入至少部分诱导物。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中在诱导物的首次添加之后，在培养达到第2测定参数之后，又添加至少一次诱导物。
10.权利要求9的方法，其中第2测定参数选自光密度0D，溶液中的诱导物浓度，产生的多肽浓度或宿主细胞中包含的报告基因的信号强度。
11.权利要求1 10中任一项的方法，其中启动子选自manP启动子和manR启动子
12.权利要求1 11中任一项的方法，其中将第1碳源和诱导物的混合物补给发酵培养基，其中第1碳源与诱导物的比是3 1至1 3。
13.前述权利要求中任一项的方法，其中载体包含调控基因manR的完全或部分序列。
14.前述权利要求中任一项的方法，其中载体包含选自SEQID N0:1,SEQ ID NO :2,SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5的序列，与它们互补的序列或其变体。
15.前述权利要求中任一项的方法，其中不同于诱导物的碳源是葡萄糖。
16.前述权利要求中任一项的方法，其中编码多肽的核酸序列是异源核酸序列。
17.在原核生物宿主细胞中产生多肽的方法，其包括下列步骤构建在原核生物宿主细胞中可表达的载体，所述载体包含可操作地连接到包含编码多肽的核酸序列的转录单元的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的甘露糖操纵子的诱导型启动子，将原核生物宿主细胞用所述载体转化，以及通过在权利要求1 16之任一项中所述的培养条件下培养转化的宿主细胞来使所述多肽表达。
18.权利要求15的方法，其还包括下列步骤自细胞或自细胞培养物回收多肽。
19.重组体原核生物宿主细胞，其包含表达载体，所述表达载体包含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的甘露糖操纵子的甘露糖诱导型启动子、或所述甘露糖操纵子的诱导型启动子的纯化的及分离的核酸序列， 其中所述载体或所述甘露糖操纵子的诱导型启动子的纯化的及分离的核酸序列可操作地连接到包含编码多肽的核酸序列的转录单元。
20.权利要求19的重组体原核生物宿主细胞，其中甘露糖操纵子的诱导型启动子是根据权利要求11 13中任一项的一种，或者其中分离的及纯化的核酸是根据权利要求14的一种。
21.重组体原核生物宿主细胞，其中宿主细胞选自硬壁菌门(Firmicutes)。
22.权利要求19 21中任一项的重组体原核生物宿主细胞在权利要求1 18中任一项的方法中的用途。
全文摘要
本发明涉及培养宿主细胞的发酵方法，所述细胞包含载体，所述载体包含甘露糖操纵子的诱导型启动子，其中甘露糖操纵子的诱导型启动子控制编码多肽的核酸序列的表达，尤其是，本发明涉及在多肽生产中包含甘露糖操纵子的诱导型启动子的原核生物宿主细胞的高细胞密度发酵。
文档编号C12N15/63GK102471773SQ201080035375
公开日2012年5月23日 申请日期2010年8月2日 优先权日2009年8月10日
发明者C·基茨亚克, J·埃尔滕布克纳, M·文泽尔, M·西曼赫茨伯格 申请人:龙沙股份公司