一种发酵方法
【技术领域】
[0001] 本发明总体涉及通过微生物发酵提高微生物生长效率和产物例如醇类和酸类生 产效率的方法。更具体地，本发明涉及通过对含有一氧化碳的底物进行微生物发酵产生醇， 尤其是乙醇的方法。
【背景技术】
[0002] 乙醇正迅速地成为全世界的主要富含氢的液体运输燃料。2002年全球范围内的乙 醇消耗量估计为108亿加仑。由于欧洲、日本、美国和几个发展中国家对乙醇兴趣增加，燃 料乙醇工业的全球市场也被预测会在未来急剧增长。
[0003] 例如，在美国，乙醇用于生产E 10, 一种乙醇在汽油中的10%的混合物。在E 10掺 合物中，乙醇组分作为氧合剂起作用，提高燃烧效率并且降低空气污染物的产生。在巴西， 乙醇作为混合在汽油中的氧合剂或其自身作为纯燃料，满足了约30%的运输燃料需求。同 样，在欧洲，围绕温室气体（GHG)排放后果的环境问题已经成为欧盟（EU)为成员国设置消 费可持续运输燃料（例如生物质衍生的乙醇）的强制目标的动力。
[0004] 绝大部分燃料乙醇通过传统的基于酵母发酵的方法生产，所述方法使用源自作物 的碳水化合物（例如从甘蔗提取的蔗糖或从谷类作物提取的淀粉）作为主要的碳源。然而， 这些碳水化合物原料的成本受到它们作为人类食物或动物饲料的价值的影响，而栽培用于 乙醇生产的产淀粉或产蔗糖作物并不是在所有的地理区域中都是经济上可持续的。因此， 需要开发将更低成本的和/或更充足的碳源转化为燃料乙醇的技术。
[0005] CO是有机材料（例如煤或油和油衍生产品）不完全燃烧的主要免费的、富含能量 的副产物。例如，有报道称澳大利亚的钢铁工业每年产生并向大气中排放超过500, 000吨 的CO0
[0006] 长期以来，人们认为催化方法可用于将主要由CO和/或CO和氢（H2)构成的气体 转化成多种燃料和化学制品。然而，微生物可也用于将这些气体转化为燃料和化学制品。 这些生物学方法，尽管通常比化学反应慢，但与催化方法相比具有多个优势，包括更高特异 性、更高产率、更低能量消耗和对中毒的更强抗性。
[0007] 微生物将CO作为其唯一碳源生长的能力于1903年被首次发现。后来确定这是使 用自养生长的乙酰辅酶A (乙酰CoA)生物化学途径（也被称作Woods-Ljungdahl途径和一 氧化碳脱氢酶/乙酰CoA合酶（C0DH/ACS)途径）的生物的特性。已表明包括一氧化碳营 养生物、光合生物、产甲烷生物和产乙酸生物在内的大量厌氧生物可将CO代谢为多种终产 物，即C0 2、H2、甲烷、正丁醇、乙酸盐和乙醇。当使用CO作为唯一碳源时，所有这类生物都产 生至少两种这些终产物。
[0008] 已证明厌氧细菌（例如来自梭菌属（Clostridium)的那些）可通过乙酰CoA生物 化学途径从〇)、0) 2和!12产生乙醇。例如，10 00/684074? 117309、美国专利号5，173,429、 5, 593, 886和6, 368, 819、WO 98/00558和WO 02/08438中记载了从气体产生乙醇的多个 扬氏梭菌（Clostridium Ijunedahlii)菌株。还已知细菌自产乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum sp)可从气体生产乙酉享（Aribini et al·，Archives of Microbiology 161，pp 345-351(1994))。
[0009] 然而，由微生物通过发酵气体生产乙醇通常伴随着同时产生乙酸盐和/或乙酸。 由于一些可用的碳被转化为乙酸盐/乙酸而不是乙醇，使用这样的发酵方法产生乙醇的效 率可能低于所期望的。并且，除非所述乙酸盐/乙酸副产物可被用于一些其他目的，否则还 将引起废物处理的问题。乙酸盐/乙酸可被微生物转化为甲烷，因此可能会增加温室气体 的排放。
[0010] 本领域已经认识到控制用于发酵的生物反应器中用于培养细菌或微生物的液体 营养培养基的参数的重要性。具体地，2007年7月18日提交的并以引用的方式纳入本文的 NZ 556615,描述了对所述液体营养培养基的pH和氧化还原电位的控制。例如，在厌氧产乙 酸细菌的培养物中，通过将所述培养物的pH提高至高于约5. 7,同时将培养物的氧化还原 电位保持在低水平（_400mV或更低），与在更低pH的条件下相比，细菌以高得多的速度将作 为发酵副产物产生的乙酸盐转化为乙醇。NZ 556615还认为，不同的pH水平和氧化还原电 位可用于优化条件，该条件取决于所述细菌正在进行的主要功能（即，生长、从乙酸盐和含 有CO的气态底物产生乙醇、或从含有气体的底物产生乙醇）。
[0011] US 7078201和WO 02/08438也描述了通过改变其中进行发酵的液体营养培养基 的条件（例如，pH和氧化还原电位）改进产乙醇的发酵方法。
[0012] 液体营养培养基的pH可以通过向培养基中加入一种或多种pH调节剂或缓冲液调 节。例如，碱如NaOH和酸如硫酸可被用于根据需要提高或降低pH。氧化还原电位可以通过 加入一种或多种还原剂（例如，甲基紫精（methyl viologen))或氧化剂调节。
[0013] 对于本领域技术人员显而易见的是，类似的方法可被用于生产其他醇如丁醇。
[0014] 不考虑用于为所述发酵反应进料的来源，当供给中断时会出现问题。更具体地，所 述中断可对用于反应的微生物的效率不利，并且在一些情况下，可对其有害。例如，当工业 废气流中的CO气体被用于发酵反应以生产酸/醇时，可能存在不产生所述流的时候。此 时，用于该反应的微生物可能进入休眠（hibernation)。当所述流再次可用时，可能在该微 生物达到进行所需反应的最大生产活力前存在滞后。
[0015] 硫源例如半胱氨酸和/或硫化物也可被用于在接种前获得所需的所述厌氧培养 基的0RP。然而，这类还原剂较慢并具有有限的还原能力。另外，当这些含硫化合物被用于 降低发酵培养基的ORP时，其自身被氧化。例如，半胱氨酸被氧化成二聚胱氨酸。考虑到这 些化合物的还原形式比其氧化形式具有实质上更高的作为硫源被微生物培养物消耗的生 物可用性。因此，当硫源被用于降低发酵反应的ORP时，可被微生物培养物利用的硫的实际 浓度会降低。因此，鉴定一种改进的或者替代性的与使用含有一氧化碳气体作为原料的厌 氧发酵系统一同使用的还原剂，是保证高醇产率和低过程操作成本的关键内容。
[0016] 与主要营养素例如氮和磷一起，硫在厌氧微生物自产乙醇梭菌的发酵中具有重要 作用。硫对微生物来说至关重要并且是一系列化合物和酶所必需的，所述化合物和酶使得 自产乙醇梭菌能够将CO发酵成乙酸、乙醇和丁二醇并产生ATP用于生物质增长。硫是一类 被称为铁氧化还原蛋白（ferredoxin)的生物化合物的一部分，并且是多种可将气态CO固 定至乙酰-CoA的Wood-Ljundgahl酶的组成部分。通常，完全还原形式的硫被同化到功能 性蛋白中。所述微生物可以直接摄取H 2S或其硫氢根离子形式并将其同化至所需要的蛋白 质中。许多所述微生物的含硫的酶也含有过渡金属离子如Fe2+、Zn2+、Co2+和Μη 2+。由于这 些金属的硫化物在中性PH值附近具有溶解度非常低的产物，因此游离H2S和/或游离过渡 金属通常在这样的环境中非常少见，因为大部分所述金属离子被固定在不溶的金属硫化物 中并因此不能被所述微生物获得。
[0017] 本发明的目的是提供一种系统和/或方法，所述系统和/或方法至少在一定程度 克服上述缺陷，或至少为公众提供可用的选择。
【发明内容】
[0018] 在一大方面，本发明提供了一种提高细菌培养物生长效率的方法，所述方法包括 向所述培养物提供替代性硫源的步骤。
[0019] 在第二大方面，本发明提供了一种保持或提高由微生物培养物产生的一种或多种 产物的生产速度的方法，所述方法包括向所述培养物提供替代性硫源的步骤。
[0020] 在第三大方面，本发明提供了一种提高细菌培养物发酵效率的方法，所述方法包 括向培养物提供替代性硫源的步骤。
[0021] 第四方面，本发明提供了一种通过微生物发酵生产一种或多种产物的方法，所述 方法包括：
[0022] i.向生物反应器提供含CO的气态底物，该生物反应器包含在液体营养培养基中 的一种或多种一氧化碳营养微生物的培养物；
[0023] ii.厌氧发酵所述底物，以产生一种或多种选自醇、酸及其混合物的产物；和
[0024] iii.回收一种或多种产物。
[0025] 在一个实施方案中，所述液体营养培养基包含至少一种选自S02、H2S0 3、Na2S204、S8、 Na2S、NaHS、半胱氨酸、NH4HSO3或（NH 4) 2S03的硫源。
[0026] 依据本发明的一个实施方案，本发明提供了提高微生物发酵包含CO的底物的效 率的方法，所述方法包括向营养培养基提供替代性硫源，使得硫可被一种或多种微生物利 用。
[0027] 在以上方面的具体实施方案中，所述替代性硫源选自亚硫酸（H2SO3)、Na 2S204、S8、 Na2S、NaHS、SO2、半胱氨酸、順碑03或（NH4) 2SO3。在具体的实施方案中，所述替代性硫源是 亚硫酸。
[0028] 在上述方面的具体实施方案中，所述硫源是工业过程的废弃产物。所述工业过程 包括但不限于发电厂的煤炭燃烧或油燃烧。
[0029] 在具体的实施方案中，所述一种或多种含硫物质可被微生物培养物利用。
[0030] 在另一个大方面，本发明提供了一种通过微生物发酵生产一种或多种酸和/或醇 的方法，所述方法包括以下步骤：
[0031] i.提