糖脂质的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及新型醇氧化酶以及编码该醇氧化酶的基因。另外，本发明涉及使该醇 氧化酶缺失等而得到的转化体以及使用该转化体的糖脂质的制造方法。
【背景技术】
[0002] 作为糖脂质的一种的烷基葡萄糖苷或者槐糖脂（sophorose lipid)是作为表面活 性剂而配合于各种洗涤剂等中。
[0003] 烷基葡萄糖苷或者槐糖脂的工业生产主要是以糖和醇作为原料通过化学合成来 进行，但是存在需要大量原料醇，并且由于进行高温?高压下的反应而原料葡萄糖会改性等 的问题。
[0004] 从这样的实际情况出发，寻求更高效率的生产方法，探讨了使用微生物的糖脂质 的制造技术。例如，已知如果在含有糖和醇的培养基中培养作为酵母的1种的假丝酵母菌 (Candida bombicola),则作为产物可以得到烷基槐糖苷(alkyl sophoroside)或者槐糖脂 (参照专利文献1和非专利文献1)。
[0005] 现有技术文献
[0006] 专利文献1 :美国专利第6433152号说明书
[0007] 非专利文献 I 〖Biotechnology Letters, Volume 20, No. 3, 1998, PP. 215-218
【发明内容】
[0008] 然而，使用上述微生物的制造方法虽然能够进行常温?常压下的糖脂质制造，但是 存在糖脂质相对于原料醇的收率非常低的问题。
[0009] 在此，本发明的课题在于，提供在常温?常压下能够生产率良好地制造糖脂质的微 生物转化体、以及使用该转化体的糖脂质的制造方法。
[0010] 本发明者们针对使用微生物的糖脂质的制造技术进行了专门探讨，结果发现：在 假丝酵母菌(Candida bomb i col a)的醇代谢路径中，有新型的醇氧化酶参与。进一步发现， 用使该醇氧化酶基因的功能降低的转化体会显著提高糖脂质的生产率。本发明是基于这些 发现完成的。
[0011] 即，本发明涉及一种转化体（以下也称为"本发明的转化体"），其在具有编码下述 (a)~（c)中任一种蛋白质的基因的宿主中，该基因缺失、变异或者表达抑制，并且与该宿 主相比醇氧化酶活性降低。
[0012] (a)由序列号1所表示的氨基酸序列构成的蛋白质；
[0013] (b)由与序列号1所表示的氨基酸序列具有50%以上的同一性的氨基酸序列构 成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白质；
[0014] (c)由在序列号1所表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、置换、插入、或者 附加而成的氨基酸序列构成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白质。
[0015] 另外，本发明涉及包括下述（1)和（2)的工序的糖脂质的制造方法（以下也称为 "本发明的糖脂质的制造方法"）。
[0016] (1)在含有醇和糖的培养基中培养上述转化体的工序；以及
[0017] (2)从所得到的培养物中采集糖脂质的工序。
[0018] 另外，本发明涉及编码上述（a)~（c)中任一种蛋白质的基因（以下也称为"本发 明的基因"）。
[0019] 另外，本发明涉及上述（a)~（c)中任一种蛋白质（以下也称为"本发明的蛋白 质"）。
[0020] 根据本发明，可以提供对糖脂质的高效生产有用的新型醇氧化酶以及编码该醇氧 化酶的基因。另外，根据本发明，可以提供糖脂质的生产能优异的转化体。进一步，根据本 发明，可以提供生产率优异且对糖脂质的工业生产有用的糖脂质的制造方法。
[0021] 本发明的上述以及其它特征和优点通过参照适当的附图，从下述的记载更明确。
【附图说明】
[0022] [图1]是将实施例中制作的KSM36株、NBRC10243株、KSMAura3株中ura3基闵 区域的序列的一部分进行比较的图。
[0023] [图2]是表示将实施例中制作的KSM Δ ura-ura株和KSM Δ AOX株改变碳源进行培 养，每段培养时间的活菌数的图。
[0024] [图3]是表示在实施例中制作的KSM Δ ura-ura株和KSM Δ AOX株中醇氧化酶活性 的图。
[0025] [图4]是表示在实施例中制作的BL21 (DE3)-pET-AOX株和BL21 (DE3)-pET株中， 表达蛋白质的检测结果的图。
[0026] [图5]是表示在BL21 (DE3)-pET-AOX株和BL21 (DE3)-pET株中醇氧化酶活性的 图。
[0027] [图6]是表示将在实施例中制作的KSMA ura-ura株和KSMAAOX株用1-十四醇 作为基质进行培养的培养液的GC分析结果的图。
【具体实施方式】
[0028] 1.醇氧化酶
[0029] 本发明的蛋白质是以下的（a)~（c)中任一种蛋白质（以下也称为"本发明的醇 氧化酶"）。
[0030] (a)由序列号1所表示的氨基酸序列构成的蛋白质；
[0031] (b)由与序列号1所表示的氨基酸序列具有50%以上的同一性的氨基酸序列构 成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白质；
[0032] (c)由在序列号1所表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、置换、插入、或者 附加而成的氨基酸序列构成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白质。
[0033] 由上述（a)的序列号1所表示的氨基酸序列构成的蛋白质是来自假丝酵母菌 (Candida bomb i col a)的新型醇氧化酶。
[0034] 在微生物的醇氧化酶中，有醇氧化酶（alcohol oxidase)(以下，也简记为"A0X"） 或醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase) (ADH)，并且催化将醇氧化为醛的反应。对于假丝酵 母菌(Candida bomb i col a)的醇氧化酶，至今没有详细了解，本次由本发明者们首次鉴定 了醇氧化酶及其基因。该蛋白质如后述的实施例所示，具有醇氧化酶活性。将假丝酵母菌 (Candida bombicola)的醇氧化酶的氨基酸序列示于序列号1中，将基因的碱基序列示于 序列号2中。
[0035] 本发明的蛋白质中，在上述（a)的蛋白质之外，作为与该蛋白质功能均等的蛋白 质包含上述（b)和（C)的蛋白质。
[0036] 在上述（b)中，氨基酸序列的同一性从糖脂质的生产率提高的观点出发，优选为 80%以上，进一步优选为90%以上，更加优选为95%以上。
[0037] 在本发明中，氨基酸序列的同一性是指将比较的2个氨基酸序列根据需要导入 间隙来进行排列（比对（alignment))，所得到的最大的氨基酸序列的同一性（％ )。氨基 酸序列的同一性可以通过通常的方法进行分析，例如可以通过安装有BLAST算法的NCBI BLAST (http: //blast, ncbi. nlm. nih. gov/)的 blastp 或者安装有Genetyx Win 的 Homology search等来计算。
[0038] 另外，上述（c)中，从糖脂质的生产率提高的观点出发，"1个或者多个氨基酸"优 选为1~10个氨基酸，进一步优选为1~5个氨基酸，更加优选为1~3个氨基酸。
[0039] 另外，这些蛋白质具有醇氧化酶活性，这可以通过破坏编码该蛋白质的基因来测 定菌体内的醇氧化酶活性的方法、或者用大肠杆菌等生产该蛋白质，并且测定该醇氧化酶 活性的方法等来确认。在醇氧化酶活性的测定中，可以使用在后述的实施例中使用的方法 等。
[0040] 对于本发明的蛋白质的获取方法不特别限定，可以通过通常进行的化学或者基因 工程的方法等来获得。例如，可以通过从假丝酵母菌(Candida bombicola)等的微生物中 分离、精制等获得来自天然产物的蛋白质。另外，还可以基于序列号1所示的氨基酸序列信 息进行人工合成等，也可以通过化学合成来进行蛋白质合成，也可以通过基因重组技术制 作重组蛋白质。在制作重组蛋白质的情况下，可以使用后述的本发明的醇氧化酶基因。
[0041] 2.醇氧化酶基因
[0042] 本发明的基因是编码上述（a)~（c)中任一种蛋白质的基因（以下也称为"本发 明的醇氧化酶基因"）。
[0043] 作为编码上述（a)~（c)中任一种蛋白质的基因的具体例子，可以列举由下述 (d)~（f)中任一种DNA构成的基因。
[0044] (d)由序列号2所表示的碱基序列构成的DNA ;
[0045] (e)由与序列号2所表不的喊基序列具有50%以上的同一性的喊基序列构成，并 且编码具有醇氧化酶活性的蛋白质的DNA ;
[0046] (f)与由序列号2所表示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件 (stringent condition)下进行杂交的DNA，并且编码具有醇氧化酶活性的蛋白质的DNA。
[0047] 在上述（e)中，从糖脂质的生产率提高的观点出发，碱基序列的同一性优选为 80%以上，进一步优选为90%以上，更加优选为95%以上。
[0048] 在本发明中，碱基序列的同一性是指将比较的2个碱基序列根据需要导入间隙来 进行排列（比对），所得到的最大的碱基序列的同一性（％)。碱基序列的同一性可以通过通 常的方法进行分析，例如可以通过安装有BLAST算法的NCBI BLAST (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/)的 blastp 或者安装有 Genetyx Win 的 Homology search 等来计算。
[0049] 另外，在上述（f)中，作为"严格的条件"，可以列举Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITI0N[Joseph Sambrook，David W. Russell.，美国冷泉港实 验室出版社]中记载的Southern杂交法等，例如可以列举在含有6 X SSC (I X SSC的组成 为：0· 15M氯化钠 ，(λ 015M柠檬酸钠，ρΗ7· 0)、0· 5% SDS、5XDenhardt 溶液以及 100mg/mL鲱 鱼精子DNA的溶液中，以探针且在42°C下恒温8~16小时使杂交进行的条件。
[0050] 作为本发明的醇氧化酶基因的获取方法，不特别限定，可以通过通常的基因工程 的方法获得。例如，可以基于序列号1所示的氨基酸序列或者序列号2所示的碱基序列， 通过人工合成获得本发明的醇氧化酶基因。基因的人工合成例如可以利用Invitrogen公 司等的服务。另外，也可以通过从假丝酵母菌(Candida bomb i col a)等的微生物克隆来 获得，例如，可以通过 Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITI0N[Jos印h Sambrook，David W. Russell，美国冷泉港实验室出版社（2001)]中记载的方法等来进行。
[0051] 在序列号1所示的氨基酸序列或者序列号2所表示的碱基序列中导入变异的 情况下，例如可以列举部位特异性变异导入法。作为