序 列，结果是KSM36株的ura3基闵序列与NBRC10243株的ura3基闵序列(基因库登录号 NO.DQ916828)相同。然而，在KSMAura3株中，通过一个碱基变异，从而54位的半胱氨酸 (Cys)变为酪氨酸（Tyr)(图1)。
[0138] KSM Δ ura3株在最小培养基中不能繁殖，在添加有5-氟乳清酸的YH)培养基、以及 添加有尿喃啶的最小培养基中可以繁殖。另外，在通过上述IAN Van Bogaert等的方法将 来自NBRC10243株的野牛塑ura3基闵导入到KSMAura3株，结果是在最小培养基中能够繁 殖。另外，本菌株在向培养基中添加了尿嘧啶的情况下，槐糖脂生产能与作为亲株的KSM36 株相等同。
[0139] (2) 900c 0002基因缺失用质粒的构筑
[0140] 用下述方法构筑900c 0002基因缺失用质粒pUC-ΔΑΟΧ。
[0141] 将pUC-Δ AOX设计为具有与900c 0002基因的上游约lOOObp、以及下游约1000 bp 的区域互补的序列，并在该区域之间插入_基因。
[0142] 将假丝酵母菌(Candida bomb i co I a) KSM36株中提取的基闵组DNA作为樽板，作为 PCR 引物使用 AOXl US in Fl(5'-AGCTTGCATGCCTGCTTTAAATCCAGAAAGAACTG-3'）（序列号 3)以及 AOXl US-ura R(5' -CGAAAAATATGTACTGATAACTGCGTCAGTCATTG-3'）（序列号 4)、Pu ra3F (5' -AGTACATAiriTTCGAAACAGCTCGCAA-3'）（序列号 5)以及 ura3R (5' -CTAAGAAACTCATC TTGACTGAACTITTC-3'）（序列号 6)、ura-A0Xl LS F(5' -AGATGAGTTTCTTAGAAGCCTTATATCGAA TACAC-3'）（序列号 7)、A0X1 LS in Rl(5' -ATTCGAGCTCGGTACGACACTTCTCAGGAACCCTC-3'） (序列号8)，扩增了 900c 0002基因的上游约1000 bp的区域、肛迫基因、900c 0002基因的 下游约1000 bp的区域的DNA片段。
[0143] 接下来，将质粒pUC118作为模板，使用PCR引物pUC in F2(5' -GTACCGAGCTCGAATTCGT-3'）（序列号 9)以及 pUC in R2(5' -GCAGGCATGCAAGCTTGGC-3'）（序列号 10)扩增质粒区域，并将其用 Infusion HD Cloning Kit(Clontech公司制造）结合于上述DNA片段。将得到的质粒导入至大肠杆菌 DH5 α，并且在含有IOOppm的氨苄青霉素钠盐的LB琼脂培养基上进行培养、繁殖，将由此得 到的菌落作为转化体分离，从得到的转化体中提取质粒，得到标靶的900c 0002基因缺失 用质粒pUC-ΔΑ0Χ。
[0144] (3)假丝酵母菌(Candida bomb i col a) 900c 0002基因缺失株的构筑
[0145] 根据 M. D. DE. Backer 等，Yeast (1999)，15, ρ· 1609 - 1618.的方法，使用 pUC-ΔΑΟΧ将KSMAura3株进行转化。具体而言，将KSMAura3株接种至5mL的添加有 300ppm的尿嘧啶的YH)培养基中，并且在30°C、250rpm下进行预培养48小时。将0. 5mL培 养液接种至50mL的添加有300ppm的尿嘧啶的YH)培养基中，在30°C、120rpm下培养约6 小时。将繁殖的菌体收集之后，用20mL冰冻的灭菌水清洗2次。将菌体悬浊于冰冻的ImL 的IM山梨糖醇溶液中，在5000rpm下离心5分钟，去除上清液之后，加入400 yL的IM山梨 糖醇进行悬浊。将菌体悬浊液以每份50yL进行分配，并加入2. 5ygpUC-AA0X。将菌体 悬浊液使用BIO-RAD GENE PULSER II (Bio-Rad公司制造）进行电穿孔之后，散布至含有IM 山梨糖醇的最小培养基中，在30°C下培养1周。
[0146] 从得到的转化体中，通过PCR法选出了由900c 0002基因的上游和下游区域中的 双交换而产生同源重组的菌株。从得到的转化体提取基因组DNA，并使用引物AOXl US in Fl(5'-AGCTTGCATGCCTGCTTTAAATCCAGAAAGAACTG-3'）（序列号 3)以及 AOXl LS in Rl(5'_ ATTCGAGCTCGGTACGACACTTCTCAGGAACCCTC-3'）（序列号 8)进行了 PCR。其结果以每得到的 转化体70 %的概率进行双交换得到同源重组菌株，并将其作为KSMAA0X株。
[0147] (4)假丝酵母菌(Candida bomb i col a)尿喃啶基因导入株的构筑
[0148] 将900c 0002基因缺失株作为对照菌株，以在KSM Aura株中不缺失900c 0002基 因的方式制作了在KSMAura株的变异ura3厌域中导入了野牛塑ura3基闵的菌株。
[0149] 将从假丝酵母菌(Candida bombicola) KSM36株中提取的基因组DNA作为 模板，使用引物 Pura3F(5' -AGTACATATTTTTCGAAACAGCTCGCAA-3'）（序列号 5)、以及 ura3R2 (5' -TTCATCATCGTCACTATA-3'）（序列号 11)，通过 PCR 法扩增 ura3 区域的 DNA 片 段。将得到的 DNA 片段使用 Mighty Cloning Reagent Set Blunt End(TAKAR A BIO INC. 制造）插入到 PUC118DNA HincII/BAP(TAKARA BIO I NC.制造），并得到了质粒 pUC-ura3。
[0150] 使用质粒pUC_ura3，用与上述（3)同样的方法导入至KSMAura株 中。从得到的转化体提取基因组DNA，并使用在质粒区域中设计过的引物pUC seq 1 (5 ' -GGCGAAAGGGGGATGTGC-3 '）（序列号 12)以及 pUC seq 2 (5 ' -GCACCCCAGGCTTTACAC-3 '） (序列号13)，通过PCR进行了重组的确认。其结果以每得到的转化体11 %的概率进行双交 换得到同源重组菌株，并将其作为KSM Λ ura-ura株。
[0151] 3. KSMΔ AOX 株的醇同化能（utilizing ability)
[0152] 将假丝酵母菌(Candida bombicola) KSM Δ ura-ura 株以及 KSM Δ AOX 株在 YPD 培 养基中在30°C、250rpm下进行预培养48小时。将预培养液分别接种0. 01 %至作为碳源含 有D-葡萄糖、1-十四烷醇、1-十六烷醇以及2-十四烷醇中任一种的醇同化培养基、或者 不含碳源的培养基中，在30°C、250rpm下进行培养，测定了活菌数。在图2中示出培养时 间和活菌数的关系。在图2中分别是，glc表示使用了 D-葡萄糖作为碳源，CHol表示使 用了 1-十四烷醇作为碳源，C16ol表示使用了 1-十六烷醇作为碳源，2-C14ol表示使用了 2_十四烷醇作为碳源。
[0153] 从图2中可知，KSMAura-ura株和KSMAAOX株均在不含碳源的培养基中不繁殖， 而在添加葡萄糖的培养基中繁殖。这表示KSM Λ ura-ura株和KSM Λ AOX株这两者都能够利 用葡萄糖作为碳源。
[0154] 在使用醇作为碳源的情况下，KSMAura-ura株的情况下，在含有1-十四烷醇、 1-十六烷醇或者2-十四烷醇的培养基中繁殖。然而，在KSMAA0X株的情况下，在含有 1-十四烷醇、1-十六烷醇以及2-十四烷醇中任一种的培养基中都不繁殖。
[0155] 从该结果可知，KSM Δ ura-ura株能够将醇氧化为醛作为碳源来利用，但是 KSM Λ AOX不能将醇作为碳源利用，醇同化能消失了。
[0156] 4.醇氧化酶活性的测定
[0157] 将假丝酵母菌(Candida bombicola) KSM Δ ura-ura 株以及 KSM Δ AOX 株在 YPD 培 养基中在30°C、250rpm下进行预培养48小时。将预培养液分别接种1%至作为碳源分别添 加了 l〇g/L的D-葡萄糖、以及1-十六烷醇的醇同化培养基中，在30°C、250rpm下进行培养 48小时。从培养后的菌体中调制微粒体膜蛋白质成分，并测定醇氧化酶活性（AOX活性）。 另外，已知微生物的醇氧化酶局部存在于膜蛋白质成分中。
[0158] 微粒体膜蛋白质成分的调制、以及醇氧化酶活性的测定按照文献G. D. Kemp等， Appl. Microbiol. Biotechnol. (1988)，29, P. 370-374 中记载的方法来进行。
[0159] [微粒体膜蛋白质成分的调制]
[0160] 将20mL培养后的菌体在8000rpm、4°C下离心10min收集菌体之后，将菌体用IOmL 的生理盐水清洗2次。将菌体加入500 μ L的1/15M磷酸缓冲液（pH7. 4)悬浊，并用多珠振 荡器（Multi-beads Shocker)(安井器械公司制造）以及媒介使用0. 5mm玻璃珠进行破碎。 添加500 μ L的1/15M磷酸缓冲液（pH7. 4)并混合，将破碎液在4°C、3000g下离心5分钟， 除去了未破碎的菌体。将上清液在4°C、20000g下离心60分钟，并除去线粒体和过氧物酶 体成分。回收残留的上清液，在4°C、1000 OOg下离心分离90分钟，回收沉淀并添加200 μ L 的1/15Μ磷酸缓冲液（ρΗ7. 4)悬浊。将该悬浊液作为微粒体膜蛋白质成分用于以下的醇氧 化酶活性的测定中。
[0161] [醇氧化酶活性的测定]
[0162] 将100 μ L的0· IM的磷酸缓冲液（ρΗ7· 4)、50 μ L的2. 8g/L的2, 2' -联氮双（3-乙 基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS)溶液、30 μ L的辣根过氧化物酶47units/mL溶液、 以及IOuL的微粒体膜蛋白质成分，在30°C下培养5分钟。之后，添加 IOyL的5mM的 1-十二烷醇DMSO溶液，并测定了 0分钟、以及5分钟之后的405nm下的吸光度。醇氧化酶 氧化1 μ mol的醇并产生2 μ mol的自由基离子。ImM的自由基离子型ABTS在405nm下显示 18. 4的吸光度，这与0. 5mM的氧化后的基质为相同含义。在此，将1分钟内0. 0368的吸光 度变化定义为醇氧化酶活性的IU。
[0163] 将每Ig微粒体膜蛋白质的醇氧化酶活性示于图3中。
[0164] 从图3可知，缺失了 900c 0002基因的KSM Δ AOX株与KSM Δ ura-ura株相比，醇氧 化酶活性大幅度降低。由该结果可知，上述1.中分离的900c 0002基因是作用于长链醇的 新型醇氧化酶基因。<