在极端井况下水解瓜尔胶压裂流体的纤维素酶的编码基因的制作方法
【专利说明】在极端井况下水解瓜尔胶压裂流体的纤维素酶的编码基因
[0001] 相关申请
[0002] 本申请根据35U.S.C. § 119(e)规定要求2012年3月30日提交的美国临时申请 61/618, 610和2012年6月15日提交的美国临时申请61/660, 556的优先权，其全部内容均 被引入本文作为参考。 发明领域
[0003] 提供编码纤维素酶的多核苷酸序列。具体地，提供的序列可提供特异性的、热稳定 的、耐热的、压力稳定的纤维素酶，如用于在极端井况下水解瓜尔胶压裂流体的纤维素酶的 表达增加。
[0004] 序列表
[0005] 本申请通过在MPEP § 502. 05中授权和提出的USPTO EFS-WEB服务器进行电子提 交，并且该电子提交包括电子提交的序列表；该序列表的全部内容被引入本申请的说明书 作为参考。序列表在电子提交的ASCII (.txt)文档上被确定，如下：
[0006]
【主权项】
LSEQ ID NO: 1的核苷酸序列。
2. 权利要求1所述的核苷酸序列，其中所述序列编码蛋白质。
3. 核苷酸序列，编码衍生自海栖热袍菌（Thermotoga maritima)的纤维素酶，其包括 选自下列的至少 1 个突变：T6C、T9C、T15G、A22C、G24T、A33C、A39C、A40C、A42C、A54C、A57C、 T66C、G81A、A84C、A6C、G6C、A9C、G9C、A15G、C15G、T22C、G22C、A24T、C24T、T33C、G33C、T39C、 G39C、T40C、G40C、T42C、G42C、T54C、G54C、T57C、G57C、A66C、G66C、C81A、T81A、T84C、G84C、 或其任意组合。 4. SEQ ID N0:3的核苷酸序列，包括选自下列的至少1个突变：T6C、T9C、T15G、A22C、 G24T、A33C、A39C、A40C、A42C、A54C、A57C、T66C、G81A、A84C、A6C、G6C、A9C、G9C、A15G、C15G、 T22C、G22C、A24T、C24T、T33C、G33C、T39C、G39C、T40C、G40C、T42C、G42C、T54C、G54C、T57C、 G57C、A66C、G66C、C81A、T81A、T84C、G84C、或其任意组合。
5. 权利要求3或4所述的核苷酸序列，其中至少1个突变是沉默的。
6. 权利要求3或4所述的核苷酸序列，其中至少1个突变导致具有至少1个突变的所 述核苷酸序列指导所述纤维素酶以高于缺少至少1个突变并且不以其他方式区别于权利 要求3或4所述的核苷酸序列的核苷酸序列的水平表达。
7. 来自海栖热袍菌的核苷酸序列，具有至少1个突变，所述至少1个突变使由所述核苷 酸序列编码的蛋白质的表达水平与海栖热袍菌基因组序列相比增加。
8. 权利要求7所述的核苷酸序列，其中所述突变是沉默的。
9. 第一核苷酸序列，编码SEQ ID N0:2的多肽，其中所述核苷酸序列已相对于编码SEQ ID N0:2的第二序列被突变，使得所述蛋白质的表达水平相对于由所述第二核苷酸序列编 码的所述蛋白质增加。
10. 核苷酸序列，编码与 SEQ ID NO: 2 具有至少 50%，60%，70%，80%，90%，95%， 97%，98%，99%或100%同一性的蛋白质，或其片段，其中所述核苷酸序列包括选自下列的 至少 1 个突变：T6C、T9C、T15G、A22C、G24T、A33C、A39C、A40C、A42C、A54C、A57C、T66C、G81A、 A84C、A6C、G6C、A9C、G9C、A15G、C15G、T22C、G22C、A24T、C24T、T33C、G33C、T39C、G39C、T40C、 G40C、T42C、G42C、T54C、G54C、T57C、G57C、A66C、G66C、C81A、T81A、T84C、G84C、或其任意组 合。
11. 权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9或10所述的核苷酸序列，其编码具有纤维素酶活性 的多肽，其中所述多肽在重组的细菌表达系统中生成。
12. 权利要求11所述的核苷酸序列，其中所述细菌表达系统是革兰氏阴性细菌表达系 统。
13. 权利要求12所述的革兰氏阴性细菌表达系统，其中所述革兰氏阴性细菌是假单胞 菌（Pseudomonas)、大肠杆菌（E. coli)、青枯菌（Ralstonia)、或柄杆菌（Caulobacter)表达 系统。
14. 权利要求12所述的革兰氏阴性细菌表达系统，其中所述假单胞菌表达系统是荧光 假单胞菌（Pseudomonas fluorescens)表达系统。
15. 权利要求12所述的表达系统，其中所述纤维素酶生成至少I. 0g/L、2. 0g/L、3. Og/ L、4. 0g/L、5. 0g/L、6. 0g/L、7. 0g/L、8. 0g/L、9. 0g/L、10.0 g/L、ll. 0g/L、12. 0g/L、13. Og/ L、14.0g/L、15.0g/L、16.0g/L、17.0g/L、18. 0g/L、19. 0g/L、20. 0g/L、21. 0g/L、22. Og/L、 23.0g/L、24.0g/L、25. 0、g/L、26.0g/L、27. 0g/L、28. 0g/L、29. 0g/L、30. 0g/L、31. Og/L、 32. 0g/L、33. 0g/L、34. Og/L、或 35. Og/L。 16. SEQ ID N0:2的多肽，其中所述氨基酸序列不包含信号序列、前蛋白序列、启动子序 列、或其任意组合。 17. SEQ ID N0:2的多肽，其中所述序列进一步包括异源序列。
18. 权利要求17所述的多肽，其中所述异源序列选自：信号序列、标签、表位、启动子序 列、N端延伸、C端延伸、和其任意组合。
19. 组合物，包含SEQ ID NO:2的多肽，并且进一步包括第二酶。
20. 权利要求所述19的组合物，其中所述第二酶选自：乳糖酶、脂酶、蛋白酶、过氧化氢 酶、木聚糖酶、纤维素酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、酰胺酶、环氧化物水解酶、酯酶、磷 脂酶、转氨酶、胺氧化酶、纤维二糖水解酶、氨裂解酶、或其任意组合。
21. 分离的、重组的或合成的核苷酸，具有包含SEQ ID NO: 1的核酸序列，其中所述核酸 序列编码具有纤维素酶活性的多肽。
22. 分离的、重组的或合成的核苷酸，包含SEQ ID NO: 1的核酸序列，其中所述核酸序列 编码具有纤维素酶活性的多肽，并且所述多肽包含SEQ ID N0:2的氨基酸序列、或其酶活性 片段。
23. 分离的、重组的或合成的核酸序列，包含SEQ ID N0:1，其编码具有纤维素酶活性的 多肽，其中所述多肽包含SEQ ID N0:2的氨基酸序列，并且所述多肽在重组荧光假单胞菌表 达系统中生成。
24. 组合物，包括聚合物增粘剂、表面活性剂、热稳定剂和酶分解剂，所述酶分解剂包括 衍生自超嗜热细菌的野生型纤维素酶或其突变变体。
25. 权利要求24所述的组合物，其中所述增粘剂是瓜尔胶，包括线性瓜尔胶、交联瓜尔 胶、或其混合物。
26. 权利要求25所述的组合物，其中所述酶分解剂特异性地水解所述瓜尔胶中的 0-1，4糖苷键。
27. 权利要求25所述的组合物，其中所述酶分解剂不特异性地水解所述瓜尔胶中的 a-1，6糖苷键。
28. 权利要求24-27中任一项所述的组合物，其中所述酶分解剂在上至约275 °F温度下 保持其水解所述瓜尔胶中的0 -1，4糖苷键的能力。
29. 权利要求24-28中任一项所述的组合物，其中所述酶分解剂在上至约11的pH下保 持其水解所述瓜尔胶中的0-1，4糖苷键的能力。
30. 权利要求24-29中任一项所述的组合物，其中所述酶分解剂是包括相对于所述野 生型纤维素酶的12个突变的突变变体。
31. 权利要求30所述的组合物，其中所述12个突变选自F38Y、Y61Q、M69E、D70P、R71S、 I94Q、I166V、S183R、S191A、E212P、L231V、M276A、E277S、R280G、T297P 和 T301Q。
32. 权利要求24所述的组合物，其中所述酶分解剂具有SEQ ID. NO. 2。
33. 权利要求24所述的组合物，其中所述酶分解剂由具有SEQ ID. NO. 1的多核苷酸编 码。
34. 权利要求24-29中任一项所述的组合物，其中所述酶分解剂是所述野生型纤维素 酶的突变变体，并且具有如下熔融温度：在约pH 6. 5下高于所述野生型纤维素酶的熔融温 度至少20°F，和在约pH 10. 5下高于所述野生型纤维素酶的熔融温度至少KTF。
35. 权利要求24所述的组合物，其中所述酶分解剂是由SEQ ID NO:3编码的纤维素酶 的突变变体。
36. 降低包含0-1，4糖苷键的多糖凝胶的粘度的方法，所述方法包括使所述多糖凝胶 在允许条件下接触纤维素酶变体，并且接触时间足以使所述纤维素酶水解所述多糖凝胶中 的0 -1，4糖苷键，从而降低所述瓜尔胶的粘度，其中所述纤维素酶变体与衍生自超嗜热细 菌的野生型纤维素酶相比包含至少12个突变，并且其中所述纤维素酶变体呈现与所述野 生型纤维素酶相比增加的温度和pH耐受性。
37. 权利要求36所述的方法，其中至少12个突变通过基因位点饱和诱变生成，所述基 因位点饱和诱变包括还原性重配、重组和选择的重复循环。
38. 权利要求36所述的方法，其中所述多糖凝胶包括线性瓜尔胶、交联瓜尔胶、或其混 合物。
39. 权利要求36所述的方法，其中所述纤维素酶变体具有SEQ ID NO: 2。
40. 权利要求36所述的方法，其中所述纤维素酶变体由具有SEQ ID. NO. 1的多核苷酸 编码。
41. 权利要求36所述的方法，其中允许条件包括约180°F至约275 °F的温度范围。
42. 权利要求36所述的方法，其中允许条件包括约9至约11的pH范围。
43. 处理地下地层的方法，包括： 向所述地下地层引入压裂流体，所述压裂流体包括多糖凝胶和纤维素酶变体；和使所 述凝胶和所述纤维素酶变体在允许条件下反应，并且反应时间足以使所述纤维素酶变体水 解所述凝胶中的至少一些0-1，4糖苷键，而不水解a-1，6糖苷键，从而生成粘度降低的压 裂流体；其中所述纤维素酶变体与衍生自超嗜热细菌的亲本野生型纤维素酶相比包括至少 12个突变，并且其中所述纤维素酶变体呈现与所述野生型纤维素酶相比增加的温度和pH 耐受性。
44. 权利要求36所述的方法，其中通过所述纤维素酶变体生成的所述粘度降低的压裂 流体，相对于通过化学分解剂生成的相当的粘度降低压裂流体，包括较少残留物，其中纤维 素酶变体和化学分解剂的剂量提供基本上相同的粘度降低。
【专利摘要】提供编码热稳定的纤维素酶并导致其表达增加的多核苷酸序列，和包括这种热稳定的纤维素酶的水力压裂组合物。公开的组合物包括聚合物增粘剂、表面活性剂、热稳定剂和酶分解剂，所述酶分解剂包括衍生自超嗜热细菌的野生型纤维素酶或其突变变体。在一些实施方式中，增粘剂是瓜尔胶，包括线性瓜尔胶、交联瓜尔胶或其混合物。在一些实施方式中，酶分解剂特异性地水解所述瓜尔胶中的β-1,4糖苷键。在一些实施方式中，酶分解剂不特异性地水解所述瓜尔胶中的α-1,6糖苷键。在一些实施方式中，酶分解剂在上至约275℉温度下保持其水解所述瓜尔胶中的β-1,4糖苷键的能力。
【IPC分类】C12N9-42
【公开号】CN104736701
【申请号】CN201380028620
【发明人】X·谭, K·E·巴雷特, A·H·达文波特, L·E·惠普尔, H·D·厄比纳, B·张, M·A·沃尔
【申请人】巴斯夫酶有限责任公司(美国)
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2013年3月12日
【公告号】CA2869024A1, EP2831257A2, US20150087029, WO2013148167A2, WO2013148167A3