br>[0165] 5.由900c 0002基因的异源表达进行的酶活性的确认
[0166] 将从假丝酵母菌(Candida bomb i co I a) KSM36株中提取的基闵组DNA作为樽板，伸 用引物 AOX F(5'_gaaggagatatacatatgactgacgcagttatcctc_3'）（序列号 14)、以及 AOX R( 5'_agtgcggccgcaagctagcttagtttgaagcttag_3'）（序列号 15)，用 PCR 法扩增 900c 0002 基 因的DNA片段。另外，将质粒pET21a (Novagen公司制造）作为模板，并使用引物pET21F (5'-gcttgcggccgcactcgag-3'）（序列号 16)、以及 pET21R(5'_atgtatatctccttcttaaag_3'）（序 列号17)，用PCR法扩增了 DNA片段。将得到的两个DNA片段使用In-Fusion HD Cloning Kit(TAKARA BIO INC.制造）进行融合，得到质粒pET-AOX。
[0167] 将质粒 pET-AOX 导入到大肠杆菌 BL21 (DE3) (Funakoshi Corp oration 制造）， 得到BL21 (DE3)-pET-AOX株。另外，作为对照菌株，制作了将质粒pET21a导入到大肠杆菌 BL21 (DE3)而得到的 BL21 (DE3)-pET 株。
[0168] 将这些重组菌株在含有IOOppm的氨苄青霉素钠盐的LB培养基（和光纯药工业公 司制造）中37°C、250rpm下培养12小时之后，接种1%至含有IOOppm的氨苄青霉素钠盐 的LB培养基中，在37°C、250rpm下培养2. 5小时。接下来，添加 IM IPTG溶液至最终浓度 为0.1 mM，并在25°C、250rpm下培养16小时。将5mL培养后的菌体在15000rpm、4°C下离心 2min收集菌体之后，用ImL的生理盐水清洗2次菌体。向菌体中加入500 yL的1/15M磷酸 缓冲液（PH7. 4)悬浊，并用多珠振荡器（安井器械公司制造）以及0.1 mm玻璃珠进行破碎。 将破碎液在4°C、15000rpm下离心5分钟，除去了未破碎的菌体。回收残留的上清液，进行 蛋白质浓度分析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析（SDS-PAGE)和醇氧化酶活性的测定。
[0169] 蛋白质浓度分析使用Bio-Rad蛋白定量试剂盒（Bio-Rad Protein Assay Kit) (Bio-Rad公司制造），且作为标准物质使用牛血清白蛋白（Bio-Rad公司制造），SDS-PAGE 使用 Mini-PROTEAN TGX GEL Anyk D (Bio-Rad 公司制造）在 Mini-PROTEAN 3Ready Gel Cell (Bio-Rad公司制造）中进行。样品使用Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad公司制造） 稀释成3倍，在KKTC下保持5分钟时间使之热改性之后，提供给凝胶。将预混缓冲液 (IOXTris-甘氨酸-SDS(Bi 〇-Rad公司制造））用脱离子水稀释至10倍并做成电泳液，并 且对每片凝胶以200V的恒电压进行约30分钟电泳。将电泳之后的凝胶用Bio-Safe CBB G-250着色剂（Bio-Rad公司制造）进行了染色。
[0170] 电泳的结果示于图4。在图4中，分别是第1泳道（lane 1)显示作为对照菌株的 BL21(DE3)-pET 株，第 2 泳道（lane 2)显示导入了 900c 0002 基因的 BL21(DE3)-pET-A0X 株。
[0171] 醇氧化酶活性的测定和上述4.同样来进行。另外，作为活性测定的基质是用了 1-十二烷醇。结果示于图5中。
[0172] 从图4可知，在导入了 900c 0002基因的BL21(DE3)-pET-A0X株中，在75kDa的位 置检测出条带（band)，确认了 900c 0002基因的表达。另一方面，在未导入900c 0002基因 的BL21 (DE3)-pET株中，在该位置没有确认到条带。
[0173] 另外，从图5可知，在导入并表达了 900c 0002基因的BL21(DE3)-pET-A0X株中， 确认到醇氧化酶活性。但在BL21 (DE3) -pET株中，没有确认到醇氧化酶活性。
[0174] 从这些结果可知，在上述1.中分离的900c 0002基因为作用于长链醇的新型醇氧 化酶基因。
[0175] 6. KSMAAOX株的糖脂质生产率
[0176] 用YPD培养基，在30 °C、250rpm下预培养KSM Δ ura-ura株和KSM Δ AOX株5分钟。 将预培养液接种2 %至加入了 30mLAG生产培养基的500mL坂口烧瓶（Sakaguchi flask)， 并在30°C、120rpm下培养48小时之后，作为基质添加1-十四烷醇至10g/L。
[0177] 将从添加基质开始培养72小时之后的培养液提供给下述的LC-MS分析和GC分 析。
[0178] [LC-MS 分析]
[0179] 装置使用UFLC 20A-LCMS 2020(岛津制作所公司制造），作为柱使用L-column ODS 4. 6 X 150_，5 μ m (化学物质评价研宄机构）。在洗脱液A中使用0.0 lM醋酸铵水溶液、 在洗脱液B中使用0.0 lM醋酸铵甲醇溶液，以流量ImL/分、柱温箱温度40°C，进行时间程序 50% (5分钟）一20% /min - 90% - 95% (5分钟）一100% (30分钟）。检测在负离子 模式下进行。
[0180] LC-MS分析的结果，在KSM Λ ura-ura株中没有确认到与十二烷基麦芽糖苷相近迀 移率（mobility)的峰（10. 06分）。另一方面，在KSMΛ AOX株中在与十二烷基麦芽糖苷相 近的迀移率处确认有峰（10. 06分），在负模式下10. 068分的峰的分子量为579. 5 [M-H]， 11. 275分的峰的分子量为621. 5 [M_H]。
[0181] 这些峰认为是，乙酰基十四烷基麦芽糖苷的分子量为580. 3、2_乙酰基十四烷 基麦芽糖苷的分子量为622. 5，以及由S. Fleurackers 等Eur·J·LipidSci·Technol· (2010)，112，p. 655-662判断10. 068分的峰为下述结构式所表示的乙酰基十四烷基槐糖苷 (1-0-十四烷基-(2' -O-β -D-吡喃葡萄糖基-β -D-吡喃葡萄糖苷）6'醋酸酯）、11. 275 分的峰为下述结构式所表示的乙酰基十四烷基槐糖苷（1-0-十四烷基_(2' -O-β-D-吡喃 葡萄糖基-β -D-吡喃葡萄糖苷）6'，6"二醋酸酯）。
【主权项】
1. 一种转化体，其中， 在具有编码下述（a)~（c)中任一种蛋白质的基因的宿主中，该基因缺失、变异或者表 达抑制，并且与该宿主相比醇氧化酶活性降低， (a) 由序列号1所表示的氨基酸序列构成的蛋白质； (b) 由与序列号1所表示的氨基酸序列具有50%以上的同一性的氨基酸序列构成，并 且具有醇氧化酶活性的蛋白质； (c) 由在序列号1所表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、置换、插入、或者附加 而成的氨基酸序列构成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白质。
2. 如权利要求1所述的转化体，其中， 所述宿主为微生物。
3. 如权利要求2所述的转化体，其中， 所述微生物为酵母。
4. 如权利要求3所述的转化体，其中， 所述酵母为属于假丝酵母(Candida)属的菌类。
5. 如权利要求4所述的转化体，其中， 所述属于假丝酵母(Candida)属的菌类选自假丝酵母菌(Candidabomb i col a)、峰生假丝酵母菌(Candidaapicola)、假丝酵母菌(Candidabatistae)、叶牛壳假丝酵母菌 (Candidafloricola)、假丝酵母菌(Candida riodocensis)和星形假丝酵母菌(Candida stellata)〇
6. 如权利要求1~5中任一项所述的转化体，其中， 转化体的醇氧化酶活性相对于宿主的醇氧化酶活性为70%以下。
7. 如权利要求1~6中任一项所述的转化体，其中， 所述（b)的蛋白质是由与序列号1所表示的氨基酸序列具有80%以上的同一性的氨基 酸序列构成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白质。
8. 如权利要求1~7中任一项所述的转化体，其中， 所述（c)的蛋白质是由在序列号1所表示的氨基酸序列中1~10个氨基酸缺失、置换、 插入、或者附加而成的氨基酸序列构成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白质。
9. 一种包括下述（1)和（2)的工序的糖脂质的制造方法，其中， (1) 在含有醇和糖的培养基中培养权利要求1~8中任一项所述的转化体的工序；以 及 (2) 从所得到的培养物中采集糖脂质的工序。
10. 如权利要求9所述的制造方法，其中， 所述醇是碳原子数为10以上且22以下的伯醇或者仲醇。
11. 如权利要求9或10所述的制造方法，其中， 所述糖脂质为烷基葡萄糖苷或者槐糖脂。
12. -种编码下述（a)~（c)中任一种蛋白质的基因，其中， (a) 由序列号1所表示的氨基酸序列构成的蛋白质； (b) 由与序列号1所表示的氨基酸序列具有50%以上的同一性的氨基酸序列构成，并 且具有醇氧化酶活性的蛋白质； (C)由在序列号1所表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、置换、插入、或者附加 而成的氨基酸序列构成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白质。
13. -种下述（a)~（C)中任一种蛋白质，其中， (a) 由序列号1所表示的氨基酸序列构成的蛋白质； (b) 由与序列号1所表示的氨基酸序列具有50%以上的同一性的氨基酸序列构成，并 且具有醇氧化酶活性的蛋白质； (c) 由在序列号1所表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、置换、插入、或者附加 而成的氨基酸序列构成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白质。
【专利摘要】本发明提供下述(a)～(c)中任一种蛋白质、编码该蛋白质的基因、该基因缺失、变异或者表达抑制的转化体、以及使用该转化体的糖脂质的制造方法，其中，(a)由序列号1所表示的氨基酸序列构成的蛋白质；(b)由与序列号1所表示的氨基酸序列具有50％以上的同一性的氨基酸序列构成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白质；(c)由在序列号1所表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、置换、插入、或者附加而成的氨基酸序列构成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白质。
【IPC分类】C12N9-04, C12N1-19, C12P19-00, C12N5-10, C12N15-09
【公开号】CN104736705
【申请号】CN201380054186
【发明人】高桥史员
【申请人】花王株式会社
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2013年10月3日
【公告号】EP2910631A1, US20150267235, WO2014061459A1