酶的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及性质改善的酶，以及适用于生产食品、饮料（啤酒）、饲料或生物燃料 (例如在酿造工艺中）的包含所述的酶的组合物。
【背景技术】
[0002] 在啤酒生产中使用酶是公知的。将酶应用于糖化步骤中以改善糖化醪的过滤性并 增加提取产率在WO 97/42302中有所描述。
[0003] W02005118769和W02005059084涉及啤酒生产工艺中的糖化和过滤步骤，并涉及 用于该工艺中的酶组合物。
[0004] W01999057325涉及绳状青霉（Penicillium funiculosum)菌株，由该菌株得到的 新的酶混合物以及其核心序列。
[0005] 但是，仍需要改善的酶，以及用于食品和饮料产品的生产（例如酒精饮料（例如啤 酒或威士忌）生产中的糖化、烹饪和过滤步骤）中的酶的组合。
[0006] 发明目的
[0007] 本发明的实施方案的目的是提供适用于食品和饮料产品的生产的酶，例如酒精或 非酒精饮料（例如与基于谷物或麦芽的饮料类似的啤酒或威士忌）的生产。所提供的酶具 有与酿造用途有关的改善的性质。这些种类多样的改善的性质包含例如改善的最适温度， 改善的对可溶的（WE-AX)与不可溶的（WU-AX)阿拉伯木聚糖底物的活性比，在酿造工艺的 滤除和/或过滤步骤中形成的总压力降低，以及经酶处理的材料的过滤性增加。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明人发现一种或多种酶以及酶的某些组合相对于已知的酶和酶的组合具有 改善的性质，特别是与酿造工艺中的用途有关，其中在所述的酿造工艺中使用所述一种或 多种酶处理含淀粉的材料，产生酿造糖化醪。
[0010] 因此，在第一个方面中，本发明涉及表现出内切-1，4-β -木聚糖酶活性的酶，该 酶包含与选自以下的任意一者具有至少80%的一致性的氨基酸序列，或它们的任何功能片 段：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID Ν0:6、 SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO:20,SEQ ID N0:2USEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25。 toon] 如本文所用，"功能片段"是指截短形式的酶，其具有与未截短的参照酶基本相同 的或者至少为有效程度的酶活性。
[0012] 在第二个方面中，本发明涉及表现出内切-1，3 (4)-β-葡聚糖酶活性的酶，该酶 包含与选自以下的任意一者具有至少80%的一致性的氨基酸序列，或它们的任何功能片 段：SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10,和 SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16。
[0013] 在第三个方面中，本发明涉及DNA构建体，其包含编码根据本发明的酶的DNA序 列。
[0014] 在另一个方面中，本发明涉及包含DNA构建体的重组表达载体，其中所述的DNA构 建体包含编码根据本发明的酶的DNA序列。
[0015] 在另一个方面中，本发明涉及使用DNA构建体转化的细胞，其中所述的DNA构建体 包含编码根据本发明的酶的DNA序列。
[0016] 在另一个方面中，本发明涉及包含根据本发明的酶、DNA构建体、载体或细胞的制 备物。
[0017] 在另一个方面中，本发明涉及组合物，其包含根据本发明的表现出内 切-1，4- β -木聚糖酶活性的酶、以及任意一种或多种β -葡聚糖酶。
[0018] 在另一个方面中，本发明涉及组合物，其包含根据本发明的表现出内 切-1，3 (4) - β -葡聚糖酶活性的酶、以及任意一种或多种木聚糖酶。
[0019] 在另一个方面中，本发明涉及根据本发明的酶、或根据本发明的制备物或根据本 发明的组合物在食品、饲料或麦芽饮料产品（例如啤酒或威士忌）生产中的用途。
[0020] 在另一个方面中，本发明涉及根据本发明的酶、或根据本发明的制备物或根据本 发明的组合物在生面团或烘焙产品的生产中的用途。
[0021] 在另一个方面中，本发明涉及根据本发明的酶、或根据本发明的制备物或根据本 发明的组合物在纸浆或纸的制备中的用途。
[0022] 在另一个方面中，本发明涉及根据本发明的酶、或根据本发明的制备物或根据本 发明的组合物在谷物成分的制备中的用途。在一些实施方案中，谷物为黑麦、小麦或大麦。
[0023] 在另一个方面中，本发明涉及根据本发明的酶、或根据本发明的制备物或根据本 发明的组合物在啤酒生产或酿造工艺副产物的改性中的用途。
[0024] 在另一个方面中，本发明涉及根据本发明的酶、或根据本发明的制备物或根据本 发明的组合物在葡萄酒或果汁的生产中的用途。
[0025] 在另一个方面中，本发明涉及根据本发明的酶、或根据本发明的制备物或根据本 发明的组合物在一代或二代生物燃料例如生物乙醇的生产中的用途。
[0026] 在另一个方面中，本发明涉及改变含淀粉材料的过滤性的方法，该方法包括使用 根据本发明的酶、制备物或组合物来处理所述的含淀粉材料的步骤。
[0027] 在另一个方面中，本发明涉及降低在酿造应用的滤除过程中产生的压力的方法， 该方法包括使用根据本发明的酶、制备物或组合物来处理酿造糖化醪的步骤。
[0028] 在另一个方面中，本发明涉及食品、饲料或饮料产品（例如酒精或非酒精饮料，例 如与基于谷物或麦芽的饮料类似的啤酒或威士忌）的生产方法，该方法包括使用根据本发 明的酶、制备物或组合物来处理含淀粉材料的步骤。
[0029] 在另一个方面中，本发明涉及用于生产酿造糖化醪的方法，该方法包括使用根据 本发明的酶、制备物或组合物来处理含淀粉材料的步骤。
[0030] 在另一个方面中，本发明涉及用于生产一代或二代生物燃料例如生物乙醇的方 法，该方法包括使用根据本发明的酶、制备物或组合物来处理含淀粉材料的步骤。
[0031] 在另一个方面中，本发明涉及通过根据本发明的方法获得的产物。
[0032] 在另一个方面中，本发明涉及组合物，其包含通过根据本发明的方法获得的产物， 例如其中所述的产物为〇. 1% -99. 9%。
[0033] 图例
[0034] 图I :试验室规模和中试规模酿造中使用的糖化图谱。糖化是以IOmin糖化期为 开始，其后加入酶。
[0035] 图2 :中试规模的酿造应用产生于葡聚糖酶和木聚糖酶筛选的证实。针对空白和 UltraFlo max来检验枯草芽胞杆菌（B. sub)葡聚糖酶S和A. tub木聚糖酶。收集的数据为 平均流速（L/h)，经过滤除过程的形成的总压力（mm WC，其中Imm WC = 9. 80665 Pa)以及 在滤除过程中的最大压力（mm WC)。
[0036] 33图3 :酿造中木聚糖酶的功能性。
[0037] 34图4 :滤除流速，其中施加多种木聚糖酶的候选物。
[0038] 35图5 :啤酒过滤-重复过滤的平均值。
[0039] 36图6 :啤酒过滤-重复过滤的平均值。
[0040] 图7 :实施例3的糖化克数。
[0041] 本发明的详细公开
[0042] 在传统上，啤酒是指由麦芽（例如由大麦粒得到的麦芽）、和可任选的附属物（例 如含淀粉的植物材料（例如谷物谷粒）和可任选的加入风味剂（例如可加入啤酒花）得到 的酒精饮料。
[0043] 就本发明而言，术语"啤酒"是指包含通过发酵/酿造含淀粉的植物材料而生产的 任何发酵的麦芽汁，因此也特别包含专门由附属物、或者麦芽和附属物的任何组合所生产 的啤酒。
[0044] 就本发明而言，术语"发酵"是指通过使微生物在培养物中生长来生产诸如乙醇之 类的物质。通常诸如酵母之类的微生物可用于发酵。
[0045] 如本文所用，术语"麦芽"可理解为任何发芽的谷物谷粒，例如发芽的大麦。"附属 物"可定义为并非为麦芽或大麦麦芽的任何含淀粉的植物材料。
[0046] "含淀粉的植物材料"可以为例如一种或多种谷物，例如大麦、小麦、玉米、黑麦、高 粱、小米或大米和它们的任意组合。含淀粉的植物材料可以被加工，例如研磨的、发芽的、部 分发芽的或未发芽的。未发芽的谷物也称为"天然谷粒"。非谷物的含淀粉植物材料的实例 包括例如块茎，例如马铃薯和木薯。
[0047] 如本文所用，术语"饮料"和"饮料产物"包括形成泡沫的发酵的饮料，例如全麦啤 酒、在"纯净法（Reinheitsgebot) "下酿造的啤酒、爱尔啤酒、干啤酒、淡啤酒、清淡啤酒、低 醇啤酒、低热量啤酒、波特啤酒、博克啤酒、黑啤酒、麦芽酒、无醇啤酒、无醇麦芽酒等。此外， 术语"饮料"或"饮料产物"还包括不起沫的啤酒和备选的麦芽饮料，例如果味的麦芽饮料， 例如柑橘风味的，例如柠檬、橙子、青柠或浆果风味的麦芽饮料；酒味的麦芽饮料，例如伏特 加、朗姆或龙舌兰风味的麦芽酒；或者咖啡风味的麦芽饮料，例如咖啡因风味的麦芽酒等。 [0048] 可以通过基本相同的工艺由多种含淀粉的植物材料来制得啤酒，其中所述的淀粉 主要由葡萄糖均聚物组成，在该均聚物中，葡萄糖残基通过α-1,4-或α-1,6-键连接，并 且主要为α-1,4-键。
[0049] 制造发酵的饮料（例如啤酒）的工艺通常称为酿造。在制造这些饮料中使用的传 统的原材料为水、啤酒花和麦芽。此外或者代替麦芽，诸如普通玉米粒、精制玉米渣、酿造 者的酵母粉、大米、高粱、精制玉米淀粉、大麦、大麦淀粉、脱壳大麦、小麦、小麦淀粉、烘焙谷 物、谷物片、黑麦、燕麦、马铃薯、木薯粉、糖浆（例如玉米糖浆、甘蔗糖浆、转化糖浆、大麦和 /或小麦糖浆）等之类的附属物可以用作淀粉的来源。淀粉最终通过酶促而转化成可发酵 的糖。
[0050] 关于主要由麦芽（例如至多达到15-20%附属物）制造的啤酒，由于多种原因，使 得麦芽（主要由所选种类的大麦生产）对啤酒的整体特征和品质产生最大的影响。首选， 麦芽是啤酒中主要的风味剂。第二，麦芽提供了可发酵的糖的主要部分。第三，麦芽提供了 蛋白质，这有助于啤酒的主体和泡沫特征。第四，麦芽提供了糖化过程中必须的酶活性。
[0051] 此外，啤酒花还极其有助于啤酒的品质，包含风味。具体而言，啤酒花（或啤酒花 的构成部分）将所需的苦味物质加入到啤酒中。此外，啤酒花起到了蛋白质沉淀剂的作用， 形成了防腐剂，并有助于泡沫的形成和稳定。并非所有的啤酒都是使用啤酒花生产的。诸 如蛋白酶（例如木瓜蛋白酶）之类的其他稳定剂也可以使用。
[0052] 不想解释为限宙本发明，以下描沭传统的酿诰工艺：
[0053] 用于制造啤酒的工艺是本领域公知的，但是简言之，该工艺涉及5个步骤：(a)糖 化和/或附属物的烹饪；(b)麦芽汁的分离和提取；(C)麦芽汁的煮沸并加入啤酒花；（d)冷 却、发酵和储存；以及（e)成熟、加工和包装。通常，在第一个步骤中，将研磨或压碎的麦芽 与水混合，在受控的温度下保持一段时间，从而使麦芽中存在的酶将麦芽中存在的淀粉转 化成可发酵的糖。
[0054] 在第二个步骤中，糖化醪被转移至"过滤桶"或糖化醪过滤器中，在此，液体与谷粒 残余物分离