酶的制作方法

专利名称：酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于饲料添加剂的酶领域。更具体地，本发明涉及可用于增强食物和动物饲料中磷酸酯消化的肌醇六磷酸酶。
背景技术：
和现有技术肌醇六磷酸(phytate)为谷物和豆类中磷的主要存储形式。然而，单胃动物如猪、家禽和鱼不能代谢或吸收肌醇六磷酸(或植酸(phytic acid))，并且因此将其排泄，导致家畜高产区的磷污染。而且，肌醇六磷酸也通过螯合金属制剂如钙、铜和锌而在单胃动物中作为抗营养剂。
为了提供给这些动物生长和健康足够的磷酸酯，向其饮食中添加无机磷酸酯。这种添加是昂贵的，并且进一步增加污染问题。
通过肌醇六磷酸酶的作用，肌醇六磷酸通常由其水解，而产生低级肌醇磷酸酯和无机磷酸酯。肌醇六磷酸酶可用作动物饲料的添加剂，在其中改善动物对有机磷的利用率，并且减少环境的磷酸盐(酯)(phosphate)污染(Wodzinski RJ，Ullah AH.Adv Appl Microbiol.42，263-302(1996))。
许多真菌(Wyss M.等.Appl.Environ.Microbiol.65(2)，367-373(1999)Berka R.M.等.Appl.Environ.Microbiol.64(11)，4423-4427(1998)；Lassen S.等.Appl.Environ.Microbiol.67(10)，4701-4707(2001))和细菌(Greiner R.等.Arch.Biochem.Biophys.303(1)，107-113(1993)；Kerovuo等.Appl.Environ.Microbiol.64(6)，2079-2085(1998)；Kim H.W.等.Biotechnol.Lett.25，1231-1234(2003)；Greiner R.等.Arch.Biochem.Biophys.341(2)，201-206(1997)；Yoon S.J.等.Enzyme andmicrobial technol.18，449-454(1996)；Zinin N.V.等.FEMS Microbiol.Lett.236，283-290(2004)))来源的肌醇六磷酸酶已在文献中描述。
然而迄今为止，这些肌醇六磷酸酶没有一种呈现有效用作动物饲料补充物所需的特性。尤其，真菌肌醇六磷酸酶倾向于是蛋白水解不稳定的(Igbasan F.A.等.Arch.Anim.Nutr.53，353-373(2000))，并且因此易受降解，而大多数细菌肌醇六磷酸酶仅对肌醇六磷酸具有窄的底物特异性，并且很难降解中间程度磷酸化的肌醇磷酸酯(Greiner R.等.，Arch.Biochem.Biophys.303(1)，107-113(1993)；Kerovuo J等.Biochem.J.352，623-628(2000))。
因此存在对改进的肌醇六磷酸酶的需求。
发明概要在宽泛的方面，本发明涉及源自细菌的肌醇六磷酸酶以及其修饰的形式。本发明尤其涉及源自细菌布丘氏菌属(Buttiauxella sp.)的肌醇六磷酸酶，以及其变体/修饰形式，所述变体/修饰形式针对与野生型(亲本)酶相比的改进特性进行选择和/或改造。
本发明因为提供新的肌醇六磷酸酶而是有益的，所述新的肌醇六磷酸酶具有使其作为饲料酶特别有用和有效的特性。本发明尤其涉及如本文所述的分离的和/或纯化的新肌醇六磷酸酶多肽，或其功能片段，或变体，或其修饰形式，或其修饰形式。本发明还提供编码所述肌醇六磷酸酶的核酸序列。
为了有效用作食物或动物饲料的酶添加剂，该肌醇六磷酸酶必须组合许多不同的特性。为了能降解动物胃的酸性环境中的植酸，其必须在低pH有活性，优选在大范围的pH值中有活性。此外，其必须具有高的特异性活性和优选高的热稳定性，以使得蛋白质经得住在饲料如饲料团粒的制备中常用的高温。
同样重要的是酶具有广泛的底物特异性，所述底物特异性允许其不仅水解肌醇六磷酸，而且水解肌醇六磷酸降解的中间产物，如肌醇五磷酸、肌醇四磷酸和肌醇三磷酸。对猪中肌醇六磷酸降解的研究表明这些肌醇寡磷酸酯另外在小和大肠中基本上维持不溶，并且因此难以被该动物和肠道微生物群落产生的碱性磷酸酶接近(Schlemmer U.等.Arch.Anim.Nutr.55，255-280(2001))。已鉴定了不同酶在底物特异性谱上的变化。例如，由来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的肌醇六磷酸酶产生的肌醇三磷酸基本上耐受该酶的进一步水解[Kerovuo J.等.Biochem J.352，623-628(2000)]。
在本发明的另一个方面，提供了质粒或载体系统，或转化的或转基因生物体，其包括如本文所述的新肌醇六磷酸酶或其修饰形式。
本发明的另一个方面涉及转基因生物体，其被修饰以表达如本文所述的新肌醇六磷酸酶或其修饰形式，并且因此能产生肌醇六磷酸酶。本发明进一步提供用于肌醇六磷酸酶生物技术生产的手段和方法，以及其作为饲料添加剂的用途。
本发明的各方面存在于权利要求和下列注释中。
为便于参考，本发明的这些和更多方面将在合适的章节标题下论述。然而，每一章节下的教导并不一定限于每一特定的章节。
如参照本发明所用的，术语“生产”(“produce”)、“产生”(“producing”)、“生产的”(“produced”)、“可生产的”(“produceable”)、“产物”(“production”)与相应的术语“制备”(“prepare”)、“制备”(“preparing”)、“制备的”(“prepared”)、“制备”(“preparation”)、“生成的”(“generated”)、“生成”(“generation”)和“可制备的”(“preparable”)同义。
如参照本发明所用的，术语“表达”(“expression”)、“表达”(“expresses”)、“表达的”(“expressed”)、“可表达的”(“expressable”)与相应的术语“转录”(“transcription”)、“转录”(“transcribes”)、“转录的”(“transcribed”)和“可转录的”(“transcribable”)同义。
如参照本发明所用的，术语“转化”(“transformation”)和“转染”(“transfection”)指将核酸序列导入宿主、宿主细胞、组织或器官的方法。
涉及可用于本发明的核苷酸序列的其他方面包括包括本发明序列的构建体；包括用于本发明的序列的载体；包括用于本发明的序列的质粒；包括用于本发明的序列的转化细胞；包括用于本发明的序列的转化组织；包括用于本发明的序列的转化器官；包括用于本发明的序列的转化宿主；包括用于本发明的序列的转化生物体。本发明还包括利用其表达用于本发明的核苷酸序列的方法，如在宿主细胞中表达；包括转移其的方法。本发明进一步包括分离该核苷酸序列，如从宿主细胞分离的方法。
涉及可用于本发明的氨基酸序列的其他方面包括编码用于本发明的氨基酸序列的构建体；编码用于本发明的氨基酸序列的载体；编码用于本发明的氨基酸序列的质粒；表达用于本发明的氨基酸序列的转化细胞；表达用于本发明的氨基酸序列的转化组织；表达用于本发明的氨基酸序列的转化器官；表达用于本发明的氨基酸序列的转化宿主；表达用于本发明的氨基酸序列的转化生物体。本发明还包括利用其纯化用于本发明的氨基酸序列的方法，如在宿主细胞中表达；包括转移所述序列，且随后纯化所述序列的方法。
附图简述

图1显示了通过DEAE-琼脂糖层析从布丘氏菌属(Buttiauxella)P1-29纯化的重组肌醇六磷酸酶的SDS PAGE分析。该图呈现了包含布丘氏菌属肌醇六磷酸酶样品的泳道的数字照相图像的扫描图。
图2显示了来自布丘氏菌属P1-29的肌醇六磷酸酶的pH谱。
图3显示了来自布丘氏菌属P1-29的纯化的重组肌醇六磷酸酶对不同磷酸化程度的肌醇磷酸酯组分和模式底物的底物特异性。缩写IP6-肌醇六磷酸，IP5，IP4和IP3-分别指同分异构肌醇五磷酸、肌醇四磷酸和肌醇三磷酸的混合物。Fru P2-果糖1，6-二磷酸，Fru P1-果糖6-磷酸。
SEQ ID NO1列出获得用于细菌菌株鉴定的序列。
SEQ ID NO2列出包括来自布丘氏菌属P1-29的肌醇六磷酸酶基因的多核苷酸序列。
SEQ ID NO3列出来自布丘氏菌属P1-29的肌醇六磷酸酶基因的氨基酸序列。
发明详述本发明的特征为包括对应于布丘氏菌属肌醇六磷酸酶或其修饰形式、同源物、变体、功能等同物或有效片段的氨基酸序列的酶。
术语“肌醇六磷酸酶”指能催化磷酸酯，包括肌醇六磷酸水解并且释放无机磷酸酯的蛋白质或多肽。除肌醇六磷酸外，某些肌醇六磷酸酶能水解至少一些中间程度磷酸化的肌醇磷酸酯。
术语“对应于布丘氏菌属的肌醇六磷酸酶”指不必从布丘氏菌属来源获得的酶。反而该酶优选必须具有布丘氏菌属肌醇六磷酸酶的相同的功能特征或序列。例如，布丘氏菌属肌醇六磷酸酶可能为源自布丘氏菌属的变体，但其并不天然存在于布丘氏菌属物种中。
布丘氏菌属包括，Buttiauxella agrestis、Buttiauxella brennerae、Buttiauxella ferragutiae、Buttiauxella gaviniae、Buttiauxella izardii、Buttiauxellanoackiae、Buttiauxella warmboldiae。布丘氏菌属物种的菌株可从DSMZ(German National Resource Centre for Biological Material)得到。肌醇六磷酸酶优选通过本文所述的方法从布丘氏菌属鉴定，例如与SEQ ID No 2杂交。优选的用于分离本发明的多肽和/或多核苷酸的布丘氏菌属菌株列于实施例中。
本发明的术语“野生型肌醇六磷酸酶”或“野生型”描述了具有在自然界中找到的氨基酸序列的肌醇六磷酸酶。
本发明的术语“肌醇六磷酸酶酶变体”、“肌醇六磷酸酶变体”或“变体”描述了具有源自亲本肌醇六磷酸酶氨基酸序列的氨基酸序列、但由于一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失而不同的肌醇六磷酸酶，所述氨基酸取代、插入和/或缺失总称为“突变”。设想对于进一轮制备肌醇六磷酸酶变体的方法，如分子进化，肌醇六磷酸酶变体可能也是亲本肌醇六磷酸酶。
根据本发明，术语“一个或多个同源多肽”，在此也描述为“同源物”，描述了多肽，优选肌醇六磷酸酶(即“同源肌醇六磷酸酶”或“同源酶”)，其与第一多肽/肌醇六磷酸酶/酶的氨基酸序列相比具有超过75％序列同一性，优选具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性。
术语“其功能等同物”指该酶必须具有与布丘氏菌属肌醇六磷酸酶的几乎相同的功能特征。术语“修饰形式”或“变体”指该酶已从其原来的形式被修饰，但保留与布丘氏菌属肌醇六磷酸酶的相同的酶促功能特征。尤其，术语“变体”或“修饰形式”包括具有源自亲本/野生型肌醇六磷酸酶氨基酸序列的氨基酸序列、并且具有一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失的肌醇六磷酸酶，所述氨基酸取代、插入和/或缺失总称为突变。修饰形式或变体与亲本酶相比可能呈现改变的酶特征。优选，修饰形式或变体具有一种或多种下列增强的表型提高的热稳定性和/或；提高的蛋白水解(例如胃蛋白酶)稳定性和/或；提高的比活和/或；更广的底物特异性和/或；更广pH范围的活性。术语“功能”或“有效”片段指保留几乎相同的酶促功能或作用的布丘氏菌属肌醇六磷酸酶的片段或部分。
优选本发明这方面的肌醇六磷酸酶具有与布丘氏菌属肌醇六磷酸酶相同的序列或至少75％同一的(同源的)序列。
适当地，该酶包括如SEQ ID NO3所示的氨基酸序列、或具有其至少75％同一性(同源性)的序列、或其功能片段。在一优选的实施方案中，本发明提供如SEQ ID NO3所示氨基酸序列或具有与其至少75％同一性(同源性)的序列或其有效片段的分离和/或纯化的多肽。当涉及SEQ ID No 3和包括SEQ ID No 3的多肽时，设想这也指表达期间共加工的或翻译后加工的的多肽，所述加工例如通过信号肽裂解。翻译后裂解也可能发生在C-末端。因此在一优选的实施方案中，其有效片段(也称为其功能片段)为由天然宿主或相配的合适表达宿主产生的成熟多肽。
在另一实施方案中，肌醇六磷酸酶的特征在于其源自以登录号NCIMB41248保藏的布丘氏菌属菌株P1-29。
在一优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明第一个方面的任何实施方案的肌醇六磷酸酶，其包括在下列位点(根据SEQ ID No.3的编号而编号)的一个或多个突变59、70、122、125、167、193、197、204、209、211、221、223、225、240、242、244、268、281、289、294、303、336、351。
这些位点的特征在于该酶在这些位点的诱变导致所需酶特征的改良。
下列取代可以是优选的变体K59A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YT70A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或YA122C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YD125A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YT167A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或YH193A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YF197A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y
T204A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或YT209A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或YA211C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YG221A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YI223A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YS225A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或YK240A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YA242C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YD244A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YA268C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YL281A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YQ289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或YA294C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YN303A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或YI336A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YN351A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y“保守突变”指根据氨基酸特征，与所示的氨基酸残基相比，对氨基酸残基的突变为保守的突变。氨基酸特征包括残基的大小、疏水性、极性、电荷、pK-值和本领域已知的其他氨基酸特征。优选的保守突变作为保守取代在下面列出。
尤其优选的实施方案中，突变位于一个或多个下列位点K59；T167；K240；T167；K240；D244；Q289；T209和F197。
这些特定位点的优选突变如上所列，更优选的突变包括K59E；T167V；K240T；T167I；K240E；D244C；Q289Y；T209K和F197S。
另外优选的实施方案中，提供包括选自以下的突变组合的肌醇六磷酸酶D125E/H193R；A294E/N303K；T167I/K240T；D223E/K240E/N351D；T167I/K240T/A294E/N303K；T167I/K240E/A242S/A294E/N303K；A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A294E/N303K；A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K；A122T/D125E/H193R/F197S/T209K/A211P/S221N/G225A/K240E/A294E/N303K；D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K；A122T/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K/I336F和N70Y/D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K。
因此，根据本发明优选的肌醇六磷酸酶为一种变体，其包括如SEQ IDNO3所列的氨基酸序列或其有效片段，(或其同源物，优选该肌醇六磷酸酶的特征为其源自以登录号NCIMB 41248保藏的布丘氏菌属菌株P1-29或其同源物)，只是另外具有一种或多种上面所列的氨基酸突变或一种上面所列的突变组合。
这些实施方案中，命名法表明了包括SEQ ID NO3所示的氨基酸序列的肌醇六磷酸酶，其具有通过引用SEQ ID NO3中氨基酸位点表明的突变。该命名法在底下更详细地描述。
适当地，这些变体显示对于下列任何一项的改良的特征温度稳定性、pH范围、胃蛋白酶稳定性、比活、底物特异性和更广的底物特异性。在此公开了用于确定这些特征的合适方法。
尤其，肌醇六磷酸酶特征的改良是针对食物和饲料加工条件下的酶稳定性，在胃运送期间的酶稳定性和在人或动物胃和/或肠道中的酶活性和稳定性，使得该改良的变体尤其适于用作饲料添加剂。因此，除其他参数之外，所述改良包括在提高的温度下稳定性的提高，优选65℃以上的温度，抗蛋白水解消化的稳定性的提高，优选消化道的蛋白酶如胃蛋白酶，在低pH下催化活性的提高，优选pH5.5以下的催化活性，和从肌醇六磷酸，且优选此外肌醇磷酸酯，释放磷酸盐(酯)基团的总效率。
命名法在本说明书和权利要求中使用了常规的氨基酸残基一字母和三字母代码。为了易于参照，利用下述命名法描述酶变体中的突变亲本酶的氨基酸；位点；取代的一个或多个氨基酸。根据该命名法，例如用甘氨酸残基取代第20位的丙氨酸表示为Ala20Gly或A20G。在相同位点处缺失丙氨酸表示为Ala20*或A20*。插入另一个氨基酸残基(例如甘氨酸)表示为Ala20AlaGly或A20AG。缺失连续的一段氨基酸残基(例如位点20的丙氨酸和位点21的甘氨酸之间)表示为Δ(Ala20-GlY21)或Δ(A20-G21)。当亲本酶序列与用于编号所述位点插入的酶序列相比含有“缺失”(例如在缺失的位点20插入丙氨酸)时，表示为*20Ala或*20A。多个突变由加号或斜杠隔开。例如，A20G+E21S或A20G/E21S分别表示在第20和21位丙氨酸和谷氨酸分别由甘氨酸和丝氨酸取代的两个突变。当给定位点的氨基酸残基用两个或更多可选择的氨基酸残基取代时，这些残基由逗号或斜杠隔开。例如，位点20的丙氨酸用甘氨酸或谷氨酸取代表示为A20G，E或A20G/E或者A20G、A20E。当在此鉴定出适于修饰的位点，而没有暗示任何具体的修饰时，应理解为任何氨基酸残基可取代该位置存在的氨基酸残基。因此，例如当提到修饰第20位的丙氨酸但未具体说明时，应理解为丙氨酸可以缺失，或用任何其它氨基酸取代(即R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V中的任何一个)。
适当地，本发明的肌醇六磷酸酶或功能等同物的特征为所述肌醇六磷酸酶具有至少100U/mg或200U/mg，优选至少300U/mg的比活，其中所述比活通过将所述肌醇六磷酸酶如实施例1中详述的溶液在中温育而测定，所述溶液包含pH3.5的含有2mM肌醇六磷酸，0.8mM CaCl2的200mM乙酸钠缓冲液。本发明的肌醇六磷酸酶或其功能等同物也适合表征为所述肌醇六磷酸酶在约pH4-4.5具有活性最大值，其中所述活性通过将所述肌醇六磷酸酶在溶液中温育而测定，所述溶液包含含有2mM肌醇六磷酸，0.8mMCaCl2的200mM乙酸钠缓冲液。本发明的肌醇六磷酸酶也可适当地表征为所述肌醇六磷酸酶具有在pH2.5和5.5观察到的40％或以上的最大活性，其中甘氨酸盐酸盐缓冲液用于测定在pH2.5时的活性。
适当地，在一个实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶或功能等同物表征为所述肌醇六磷酸酶具有330U/mg或更高的比活，其中所述比活通过将所述肌醇六磷酸酶在溶液中温育而测定，所述溶液为包含2mM肌醇六磷酸，0.8mM CaCl2的pH3.5的200mM乙酸钠缓冲液。在另一实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶或其功能等同物也可适当地表征为所述肌醇六磷酸酶在约pH3和pH 4-4.5具有两个活性最大值，其中所述活性通过将所述肌醇六磷酸酶在在溶液中温育而测定，所述溶液为包含2mM肌醇六磷酸，0.8mMCaCl2的200mM乙酸钠缓冲液。
另一个方面，本发明提供分离和/或纯化的核酸分子或核苷酸序列，其编码包括对应布丘氏菌属肌醇六磷酸酶或其同源物的氨基酸序列的酶。适当地，所述分离和/或纯化的核酸分子编码包括如SEQ ID NO3所示的氨基酸序列或与其具有至少75％同一性(同源性)的序列或其有效片段的多肽。在一个实施方案中，该核酸分子编码包括SEQ ID NO3并且在包含本文所列的优选位点的突变或本文所列的任何特定的突变或突变组合的多肽。在另一实施方案中，本发明提供分离和/或纯化的核酸分子，其包括与SEQ ID NO2相同或互补、或包含SEQ ID NO2的任何合适的密码子取代、或包括与SEQ ID NO2具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性序列的核苷酸序列。
仍进一步的方面中，本发明涉及显示为以下的核苷酸序列以及核苷酸序列的用途(a)以SEQ ID No.2呈现的核苷酸序列，(b)核苷酸序列，其为以SEQ ID No.2呈现的核苷酸序列的变体、同源物、衍生物或片段；(c)核苷酸序列，其为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的补体；(d)核苷酸序列，其为以SEQ ID No.2呈现的核苷酸序列的变体、同源物、衍生物或片段的补体；(e)核苷酸序列，其能与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列杂交；(f)核苷酸序列，其能与以SEQ ID No.2呈现的核苷酸序列的变体、同源物、衍生物或片段杂交；(g)核苷酸序列，其与能杂交SEQ ID No.2所示核苷酸序列的核苷酸序列互补；(h)核苷酸序列，其是能与以SEQ ID No.2呈现的核苷酸序列的变体、同源物、衍生物或片段杂交的核苷酸序列的补体；(i)核苷酸序列，其能与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的补体杂交；(j)核苷酸序列，其能与以SEQ ID No.2呈现的核苷酸序列的变体、同源物、衍生物或片段的补体杂交；核苷酸如果能在中等严谨度，更优选高严谨度，更优选很高严谨度条件下杂交，则认为其杂交至上述核苷酸(e)、(f)、(g)、(h)、(i)或(j)中的一种。
为了制备杂交斑点，可利用用于印迹的标准分子生物学方案(例如用于DNA杂交的Southern印迹)。靶DNA的量取决于靶序列的相对丰度。如果利用纯的靶序列，每千碱基对多核苷酸优选1-5pg的DNA。通常，对于具有109dpm/mg比活的放射性探针，检测极限为约0.5pg DNA，相当于复杂基因组(例如人)的3.3mg基因组DNA中500bp长度的单拷贝基因。实际上将利用约10mg基因组DNA—例如为了筛选生物体，如微生物，其包含本发明编码肌醇六磷酸酶的多核苷酸。如果靶DNA为细菌的或例如质粒，为了避免过度曝光将因此需稀释DNA。靶DNA例如通过点印迹或经从电泳凝胶印迹而印迹。优选的条件在Membrane Transfer and DetectionMethods，Amersham International plc，UK.-PI/162/85/1中描述。优选利用Hybond N+带阳电荷的尼龙膜(Amersham Life Science)。优选根据Pharmacia的Ready to Go DNATM标记试剂盒制备探针以制备＞1×109dpm/μg的探针。该探针以每毫升杂交缓冲液1×106dpm的浓度用于杂交缓冲液。印迹优选在杂交缓冲液(6xSSC，5xDenhardt溶液和0.5％SDS，以及100mg/ml缓冲液的变性的鲑精DNA)中65℃预杂交1小时，随后在包含变性的标记探针的杂交缓冲液中在65℃振荡杂交12小时。随后用在2xSSC，0.1％SDS中的合适体积的洗涤缓冲液(通常50ml)在65℃洗涤一个或多个印迹30分钟，随后为在合适体积的洗涤缓冲液(通常50ml)中进行第二次洗涤，所述洗涤缓冲液对于中等严谨度洗涤是相同的洗涤缓冲液(2xSSC，0.1％SDS)，或0.1％xSSC，0.1％SDS在65℃10分钟(高严谨度)，对于很高的严谨度洗涤，第二次洗涤可在70℃重复。
本发明的核苷酸序列可包括编码SEQ ID No.3或其有效片段或变体、修饰形式、同源物或其衍生物的序列。
尤其，本发明提供包括如本文所述的肌醇六磷酸酶或其同源物或衍生物的质粒或载体系统。优选，该质粒或载体系统包括如SEQ ID No2所示的核酸序列、或与其至少75％同源的序列、或其有效片段。适当地，该质粒或载体系统为用于任何下述酶在微生物中表达的表达载体，所述酶由SEQ ID No2所示的核酸序列或与其至少75％同源的(同一的)序列编码。在此描述了合适的表达载体。此外，本发明提供了用于表达本文所述的任何修饰的酶或变体或功能片段的质粒或载体系统。在此描述了合适的表达载体。
肌醇六磷酸酶变体本发明涉及通过亲本肌醇六磷酸酶的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基的修饰对亲本肌醇六磷酸酶的特性的改良。
用作本发明亲本酶的肌醇六磷酸酶包括来自细菌的野生型肌醇六磷酸酶，优选获自或源自布丘氏菌属的肌醇六磷酸酶，其具有Seq ID No.3中所给出的氨基酸序列或其有效片段，或与Seq ID No 3具有超过75％，优选超过80％，更优选超过90％，更优选超过95％、96％、97％、98％，优选超过99％同一性的氨基酸序列(即同源多肽)，或其有效片段。
本发明改良的肌醇六磷酸酶变体优选具有与Seq ID No 3或其有效片段的同一性或超过75％、优选超过80％、更优选超过90％、更优选超过95％、96％、97％、98％，优选超过99％的同一性。然而，也可以设想那些变体可以是与SEQ ID No 3异源的(即不同源)。例如通过重组技术(如外介导的重组，或家族改组)产生的变体可产生变体，虽然利用本发明的亲本肌醇六磷酸酶制备的变体也可具有小于75％的同源性。
序列比对以及序列同一性的测定可通过本领域已知的计算机程序如GCG程序包提供的GAP而合适地进行(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal ofMolecular Biology，48，p.443-453)。可以利用GAP按照下述设置进行多肽序列比较3.0的GAP产生罚分和0.1的GAP延伸罚分。例如利用序列比对测定同源多肽中的相应位点。
在一种或多种下列表达宿主中异源表达后，鉴定肌醇六磷酸酶大肠杆菌K12；枯草芽孢杆菌；酿酒酵母。也可利用其他的表达宿主。
本发明肌醇六磷酸酶特性的改良针对在食物和饲料加工中的用途，以及用作食物和饲料产品添加剂的用途。尤其，改良针对在食物和饲料加工条件下的稳定性，在胃运送期间的稳定性，和在人或动物胃和/或肠道中的活性和稳定性。除其他参数之外，所述改良包括在提高的温度下稳定性的提高，优选65℃以上的温度，抗蛋白水解消化的稳定性的提高，优选消化道的蛋白酶如胃蛋白酶，在低pH下催化活性的提高，优选pH 5.5以下的催化活性，和从肌醇六磷酸释放磷酸盐(酯)基团的总效率。
提高的温度下稳定性的提高通过该酶的失活温度定量。失活温度定义为肌醇六磷酸酶在该温度温育一定的持续时间、并且随后冷却至室温后，残留活性为同样的肌醇六磷酸酶在室温下、在相同的条件温育相同的持续时间后残留活性的50％时的温度。热稳定性差异为以℃表示的两种酶失活温度之间的差异。
通过野生型肌醇六磷酸酶的序列和结构分析以及通过亲本酶的诱变，尤其通过将突变引入Seq ID No 3中所给出的野生型氨基酸序列中，并且筛选具有改良特性的酶变体，而找到所要突变以获得改良特性的位点和/或区域。因此，已鉴定了对改良肌醇六磷酸酶特性是重要的亲本酶内的某些区域以及位点。
因此，本发明涉及具有改良特性的肌醇六磷酸酶变体，其与亲本肌醇六磷酸酶相比，包括在一个或多个下列位点(根据Seq ID No 3编号的编号)的突变59，70，122，125，167，193，197，204，209，211，221，223，225，240，242，244，268，281，289，294，303，336，351和/或在与Seq ID No 3的氨基酸序列所示的肌醇六磷酸酶同源的肌醇六磷酸酶中相应位点的突变。这些位点的特征为这些位点的诱变导致酶特性的改良。
K59E；T167V；K240T；T167I；K240E；D244C；Q289Y；T209K和F197S或每一位点的保守突变。
具体的优选突变组合包括D125E/H193R；A294E/N303K；T167I/K240T；D223E/K240E/N351D；T167I/K240T/A294E/N303K；T167I/K240E/A242S/A294E/N303K；A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A294E/N303K；A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K；A122T/D125E/H193R/F197S/T209K/A211P/S221N/G225A/K240E/A294E/N303K；D125E/T167I/H193R/197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K；A122T/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K/I336F和N70Y/D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K。
制备肌醇六磷酸酶变体的方法本发明广泛的实施方案中提供制备一个或多个肌醇六磷酸酶变体的方法。
在一优选的实施方案中制备肌醇六磷酸酶变体的方法包括下列连续的步骤a)选择至少一种亲本肌醇六磷酸酶，其中该至少一种亲本肌醇六磷酸酶选自i)包括如本文所述的对应于布丘氏菌属肌醇六磷酸酶的氨基酸序列的多肽或其修饰形式、同源多肽、变体、功能等同物或有效片段，或ii)如本文所述的至少一种肌醇六磷酸酶变体；b)通过引入所述亲本肌醇六磷酸酶的至少一种改变以获得至少一种肌醇六磷酸酶变体而产生至少一种肌醇六磷酸酶变体，其中所述改变为所述亲本肌醇六磷酸酶氨基酸残基的插入、缺失或取代或其组合；c)筛选所述的至少一种肌醇六磷酸酶变体以鉴定改良的肌醇六磷酸酶变体，其与亲本肌醇六磷酸酶相比具有选自以下的一个或多个改良特性i.更高的热稳定性和/或ii.比活和/或iii.蛋白水解的稳定性d)制备所述改良的肌醇六磷酸酶变体，优选产生分离和/或纯化的肌醇六磷酸酶变体。
在一优选的实施方案中，步骤b)期间产生肌醇六磷酸酶变体的群体，并且在步骤c)中筛选至少部分所述的肌醇六磷酸酶变体群体。
在一优选的实施方案中步骤a)包括将权利要求11至13的编码亲本肌醇六磷酸酶的核苷酸序列进行突变，并且步骤b)包括在宿主细胞中表达步骤(a)中获得的突变核苷酸序列，以及步骤c)包括筛选宿主细胞或其提取物中具有所述一个或多个改良特性的改良的肌醇六磷酸酶变体。
另外的实施方案中，步骤c)以及可选择的d)后，进一步包括步骤a)至c)以及可选择的d)的至少一轮重复，其中优选在所述的随后一个或多个循环中，针对步骤a)的至少一种亲本肌醇六磷酸酶选择根据该方法制备的所述至少一种肌醇六磷酸酶变体和/或改良的肌醇六磷酸酶变体。
在进一步优选的实施方案中，步骤c)包括筛选表达改良肌醇六磷酸酶变体的宿主细胞，该变体与i)所述亲本肌醇六磷酸酶和/或ii)包括SEQ IDNo 3的多肽或其功能片段相比，具有至少2.5的热稳定性差异。
在另外的实施方案中，步骤c)包括筛选表达改良肌醇六磷酸酶变体的宿主细胞，该变体与i)所述亲本肌醇六磷酸酶和/或ii)包括SEQ ID No 3的多肽或其功能片段相比，具有至少30的胃蛋白酶稳定性。
在另外的实施方案中，步骤c)包括筛选表达改良的肌醇六磷酸酶变体的宿主细胞，该变体与i)所述亲本肌醇六磷酸酶和/或ii)包括SEQ ID No3的多肽相比，具有与由SEQ ID No 3编码的肌醇六磷酸酶相比至少110的比活比率。
本发明还提供制备肌醇六磷酸酶变体的方法，其包括a)选择亲本肌醇六磷酸酶，其中该亲本肌醇六磷酸酶选自i.与SEQ ID No 3具有至少75％同源性的亲本肌醇六磷酸酶或其功能片段ii.源自布丘氏菌属的亲本肌醇六磷酸酶iii.至少一种肌醇六磷酸酶变体b)在亲本肌醇六磷酸酶的氨基酸残基中制造至少一种变化，所述变化为氨基酸残基插入、缺失或取代，以获得肌醇六磷酸酶变体c)筛选肌醇六磷酸酶变体，其与亲本肌醇六磷酸酶相比具有如本文所述的改良的特性，优选选自下列一种或多种i.更高的热稳定性和/或ii.比活和/或iii.蛋白水解稳定性和/或d)制备肌醇六磷酸酶变体。
任选地，至少步骤a)至c)可在一次或多次随后的(反复的)循环中重复。因此，设想亲本肌醇六磷酸酶为通过上述方法a)至c)的先前循环而制备的肌醇六磷酸酶变体。
在另外的实施方案中，本发明提供制备肌醇六磷酸酶变体的方法，包括下列步骤a)提供亲本肌醇六磷酸酶，选自(i)与SEQ ID No 3具有至少75％同源性的亲本肌醇六磷酸酶或其功能片段(ii)源自布丘氏菌属的亲本肌醇六磷酸酶，(iii)至少一种肌醇六磷酸酶变体b)通过亲本肌醇六磷酸酶的改变产生肌醇六磷酸酶变体的群体，优选所述一个或多个改变通过亲本肌醇六磷酸酶中至少一个氨基酸残基的插入、缺失或取代或任何其组合而获得。
c)针对群体筛选肌醇六磷酸酶变体，其与亲本肌醇六磷酸酶相比具有如本文所述的改良的特性，优选选自下列中一种或多种(i)更高的热稳定性和/或(ii)更高的比活和/或(iii)更高的蛋白水解稳定性，d)从肌醇六磷酸酶群体选择一种或多种肌醇六磷酸酶变体，e)任选循环重复步骤(a)至(c)，并且优选其中在一个循环中所选的肌醇六磷酸酶变体用作后面的循环中的起始肌醇六磷酸酶。
在另外的实施方案中，本发明提供制备肌醇六磷酸酶变体的方法，其包括a)将编码亲本肌醇六磷酸酶的核苷酸序列进行诱变，其中该亲本肌醇六磷酸酶选自i.与SEQ ID No 3具有至少75％同源性的亲本肌醇六磷酸酶或其功能片段ii.源自布丘氏菌属的亲本肌醇六磷酸酶iii.至少一种肌醇六磷酸酶变体b)在宿主细胞中表达步骤(a)中获得的突变核苷酸序列，和c)筛选表达肌醇六磷酸酶变体的宿主细胞，所述肌醇六磷酸酶变体与亲本肌醇六磷酸酶相比具有如本文所述的改良的特性，优选选自下列一种或多种i)更高的热稳定性和/或ii)更高的比活和/或iii)更高的蛋白水解稳定性和/或d)制备由宿主细胞表达的肌醇六磷酸酶变体。
任选地，步骤a)至c)，可选择地包括d)可在一次或多次随后的(反复的)循环中重复。
在另外的实施方案中，本发明提供制备肌醇六磷酸酶变体的方法，包括下列步骤a)将编码亲本肌醇六磷酸酶的核苷酸序列进行诱变，以产生改变的核苷酸变体的群体，其中优选所述一个或多个改变通过亲本肌醇六磷酸酶中至少一个氨基酸残基的插入、缺失或取代或任何其组合而获得，并且其中该亲本肌醇六磷酸酶选自(i)与SEQ ID No 3具有至少75％同源性的肌醇六磷酸酶或其功能片段(ii)源自布丘氏菌属的肌醇六磷酸酶，(iii)至少一种肌醇六磷酸酶变体(b)在相应的宿主细胞群体中表达步骤(a)中获得的核苷酸变体群体，和(c)针对群体筛选肌醇六磷酸酶变体，其与亲本肌醇六磷酸酶相比具有如本文所述的改良的特性，优选选自一种或多种(i)更高的热稳定性和/或(ii)更高的比活和/或(iii)更高的蛋白水解稳定性，(d)从肌醇六磷酸酶群体选择一种或多种肌醇六磷酸酶变体，(e)任选循环重复步骤(a)至(b)，并且优选，其中在一个循环中所选的肌醇六磷酸酶变体用作下一循环的起始肌醇六磷酸酶。
当合适时，在上述制备肌醇六磷酸酶变体的方法中，所述核苷酸序列优选为DNA序列。
核苷酸序列优选为分离和/或纯化的核酸分子或核苷酸序列，其编码包括如本文所述的对应布丘氏菌属肌醇六磷酸酶的氨基酸序列的酶，或其同源物。
肌醇六磷酸酶亲本优选选自SEQ ID No 3或其功能片段或如本文所述的SEQ ID No 3公开的布丘氏菌属肌醇六磷酸酶的同源物。
本发明涉及制备肌醇六磷酸酶变体方法的上述实施方案中，编码亲本肌醇六磷酸酶/核苷酸的亲本肌醇六磷酸酶/核苷酸优选为野生型肌醇六磷酸酶。
然而，另外亲本可以是通过先前循环的诱变制备的变体，即在一个实施方案中，制备肌醇六磷酸酶变体的方法为反复的，其中步骤a)至c)(任选包括步骤d))重复至少超过一次。所述实施方案中第一轮诱变所用的诱变方法优选为易错PCR，更优选错误阈值PCR(error threshold PCR)。随后的循环也可以是易错PCR，更优选错误阀值PCR，但另外可为基于重组的诱变，其中在第一轮诱变中鉴定的至少两种独立的改良变体的组在第二或随后轮的诱变期间被重组，以产生至少一种重组变体(例如利用家族改组或重组酶链式反应方法)。
对技术人员显而易见的是也可利用替代的诱变方法，包括合理的设计，位点扫描诱变，或化学/辐射诱导的诱变。
本发明涉及制备肌醇六磷酸酶变体方法的上述实施方案中，优选针对更高的热稳定性筛选肌醇六磷酸酶变体。
本发明涉及制备肌醇六磷酸酶变体方法的上述实施方案中，优选对至少单个参数筛选肌醇六磷酸酶变体，所述单个参数优选选自更高的热稳定性，更高的蛋白水解稳定性或更高的比活，最优选更高的热稳定性。
优选，对所述第一个参数的筛选在至少第一轮诱变中进行，所述诱变包括至少步骤a)至c)，其中c)包括至少对所述第一个参数的筛选。该第一轮诱变能因此后接进一步的(反复的)的诱变，以及包括步骤a)至c)(任选地包括d))的选择，其中所述在另外的循环中的选择可选自如所述第一轮的步骤c)中所用的相同的选择参数，或者可替换地，不同的参数。
在制备肌醇六磷酸酶变体的上述方法的反复循环期间，优选所述第一个参数选自更高的热稳定性、更高的蛋白水解稳定性或更高的比活，最优选更高的热稳定性。优选，当进行第一轮诱变以选择具有更高热稳定性的变体时，在包括步骤a)至c)的随后(反复的)一个或多个诱变循环期间，所述参数选自更高的热稳定性，更高的蛋白水解稳定性或更高的比活，最优选更高的蛋白水解稳定性或更高的比活。
本发明涉及制备肌醇六磷酸酶变体方法的上述实施方案中，优选在至少一轮诱变(步骤a至c)，优选超过一个循环，即反复的选择循环中，针对更高的热稳定性和更高的蛋白水解稳定性以及更高的比活筛选肌醇六磷酸酶变体。
亲本肌醇六磷酸酶优选源自布丘氏菌属P1-29。
在制备肌醇六磷酸酶变体的方法中，所述方法包括将编码亲本肌醇六磷酸酶的DNA序列诱变，编码亲本肌醇六磷酸酶的DNA序列优选经受随机诱变，更优选经受易错PCR，更优选经受错误阀值PCR。
优选的诱变编码亲本肌醇六磷酸酶的DNA序列的方法为易错PCR，更优选为错误阈值PCR，其他的诱变方法可代替易错/错误阈值PCR或和易错PCR/错误阈值PCR一起使用。参见实施例12，其提供了合适的易错PCR和错误阈值PCR方法的参照。另外合适的诱变PCR方法由Cadwell和Joyce(PCR Methods Appl.3(1994)，136-140)公开。
当用在涉及“肌醇六磷酸酶变体制备方法”的实施方案的语境中时，术语“在宿主细胞中表达”优选定义为如本文定义的在活体生物、器官或细胞中生产肌醇六磷酸酶变体。优选的宿主为大肠杆菌K12；枯草芽孢杆菌；酿酒酵母。在一种或多种下列表达宿主中异源表达后，鉴定本文详述的肌醇六磷酸酶大肠杆菌K12；枯草芽孢杆菌；酿酒酵母。
不过，考虑到为了选择如本文所述的肌醇六磷酸酶变体的目的，所述方法可应用表达肌醇六磷酸酶变体的体外方法，优选用于所述方法的步骤(c)中，其利用分离自一个或多个活体生物或病毒的一个或多个细胞的转录和翻译机制。本发明的变体肌醇六磷酸酶的所述体外生产也可以用于选择优选的变体肌醇六磷酸酶。体外表达可以适当地利用标准技术进行。关于参考文件请参见Promega公司的′In vitro Expression Guide′(部分号BR053)。
变体表型的定义。
优选利用实施例12中公开的方法来测定具有更高热稳定性(热稳定性差异)的变体。
通过制备肌醇六磷酸酶变体的方法制备的变体肌醇六磷酸酶优选具有至少1.5的热稳定性差异(T.D)，更优选2，2.5，3，3.5，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，最优选至少20。
优选通过实施例12中公开的方法测定具有更高蛋白水解稳定性的变体。
本发明的肌醇六磷酸酶变体优选具有至少45％，优选50％，55％，更优选至少60％或65％，最优选至少70％的蛋白水解稳定性(残留活性)。
本发明的肌醇六磷酸酶变体优选具有pH 4.0时大于100％野生型活性的比活，优选大于105％，110％，更优选大于114％。
其他变体实施方案本发明另外的实施方案中提供用于制备包括肌醇六磷酸酶变体的动物饲料的方法，所述方法包括连续的步骤i)进行制备肌醇六磷酸酶变体的一种或多种上述方法，和ii)将制备的肌醇六磷酸酶变体添加至动物饲料。
本发明具体的实施方案中提供用于制备包括肌醇六磷酸酶变体的动物饲料的方法，所述方法包括a)选择亲本肌醇六磷酸酶，其中该亲本肌醇六磷酸酶选自i.与SEQ ID No 3具有至少75％同源性的亲本肌醇六磷酸酶或其功能片段ii.源自布丘氏菌属，优选布丘氏菌属P1-29的亲本肌醇六磷酸酶，和/或iii.至少一种肌醇六磷酸酶变体；b)在亲本肌醇六磷酸酶中制造至少一种变化，所述变化为氨基酸残基的插入、缺失或取代，以获得肌醇六磷酸酶变体，c)筛选肌醇六磷酸酶变体，其与亲本肌醇六磷酸酶相比具有如本文所述的改良的特性，优选选自下列的一种或多种i.更高的热稳定性和/或ii.比活和/或iii.蛋白水解稳定性和/或d)制备肌醇六磷酸酶变体，e)将制备的肌醇六磷酸酶变体添加至动物饲料。
本发明另外的实施方案中提供用于制备包括肌醇六磷酸酶变体的动物饲料的方法，所述方法包括a)将编码亲本肌醇六磷酸酶的核苷酸(优选DNA)序列进行诱变，其中所述亲本肌醇六磷酸酶选自编码以下的核苷酸i.与SEQ ID No 3具有至少75％同源性的亲本肌醇六磷酸酶或其功能片段，和/或ii.源自布丘氏菌属的亲本肌醇六磷酸酶，优选布丘氏菌属P1-29，b)将步骤(a)中获得的突变核苷酸(优选DNA)序列在宿主细胞中表达，和c)筛选表达肌醇六磷酸酶变体的宿主细胞，所述变体与亲本肌醇六磷酸酶相比具有如本文所述的改良的特性，优选选自下列一种或多种
i.更高的热稳定性和/或ii.更高的比活和/或iii.更高的蛋白水解稳定性和/或d)制备由所述宿主细胞表达的肌醇六磷酸酶变体f)将制备的肌醇六磷酸酶变体添加至动物饲料。
制备肌醇六磷酸酶变体的方法的所述实施方案和优选方面还应用到制备包含肌醇六磷酸酶变体的动物饲料的上述方法中。
本发明的另一方面提供用本文所述的编码肌醇六磷酸酶的核酸转化或转染的宿主细胞。
适当地本发明这方面的宿主细胞包括肌醇六磷酸酶，其包含如SEQ IDNO3所示的氨基酸序列或其功能片段或与其具有至少75％同源性的序列。
在一优选的实施方案中，所述宿主细胞产生肌醇六磷酸酶。
本发明的另一方面提供用本发明的编码肌醇六磷酸酶的核酸转化或转染的宿主细胞。优选，肌醇六磷酸酶为本文所述的布丘氏菌属肌醇六磷酸酶或其同源物或衍生物。适当地所述肌醇六磷酸酶包括任何如SEQ ID NO3所示的氨基酸序列或其功能片段或与其至少75％同源(同一)的序列。优选，所述宿主细胞产生肌醇六磷酸酶。
在一个实施方案中，可用于本发明的核苷酸序列可获自(尽管它实际上不一定要获自)布丘氏菌属，尽管将认识到分离和/或纯化自等同菌株的酶可以等同地使用。
适当地所述宿主细胞源自微生物，包括细菌和真菌，包括酵母。尤其优选的实施方案中，宿主细胞为原核的细菌细胞。合适的细菌宿主细胞包括来自不同原核分类组的细菌，其包括变形菌门(proteobacteria)，包括α，β，γ，Δ和ε细部的成员，革兰氏阳性细菌如放线菌纲(Actinomycetes)，硬壁菌门(Firmicutes)，梭菌属(Clostridium)和近缘生物，黄杆菌属(flavobacteria)，蓝细菌(cyanobacteria)，绿色硫细菌(green sulfurbacteria)，绿色无硫细菌(green non-sulfurbacteria)，和archaea。特别优选的是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如大肠杆菌，属于γ细部和低GC革兰氏阳性细菌如杆菌属(Bacillus)的变形菌门。
合适的真菌宿主细胞包括酵母，所述酵母选自下组子囊菌门(Ascomycota)，包括酵母纲(Saccharomycetes)，如毕赤酵母属(Pichia)，汉森酵母属(Hansenula)，和酵母属(saccharmyces)，裂殖酵母纲(Schizosaccharmycetes)，如粟酒裂殖酵母(Schizosacchromyces pombe)，和变形子囊菌门(anamorphic Ascomycota)，包括曲霉属(Aspergillus)。
其它合适的真核宿主细胞包括昆虫细胞，如SF9，SF21，Trychplusiani和M121细胞。例如，本发明的多肽可以方便地在昆虫细胞系统中表达。除了在培养的昆虫细胞中表达之外，肌醇六磷酸酶基因还可以在完整的昆虫生物体中表达。病毒载体如杆状病毒可以感染完整的昆虫。大型昆虫，如蚕蛾，提供高产量的异源蛋白。可以根据常规提取技术将蛋白质从昆虫中提取出来。适用于本发明的表达载体包括所有能够在昆虫细胞系中表达外源蛋白的载体。
其它宿主细胞包括选自下组的植物细胞原生质体、细胞、愈伤组织、组织、器官、种子、胚、胚珠、合子等。本发明还提供已经转化并包含本发明的重组DNA的完整植物。
术语″植物″一般包括真核藻类、有胚植物，其包括苔藓植物门(Bryophyta)、蕨类植物门(Pteridophyta)和种子植物门(Spermatophyta)，如裸子植物亚门(Gymnospermae)和被子植物亚门(Angiospermae)。
优选，所述宿主细胞是微生物。优选的微生物包括原核细菌细胞，优选大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)和杆菌属的其它物种，酵母，优选多形汉森氏酵母(Hansenula Polymorpha)和粟酒裂殖酵母。
本发明的另一方面提供了细菌细胞菌株布丘氏菌属P1-29，由DaniscoGlobal Innovation，Sokeritehtaantie 20，FIN-02460Kantvik，Finland在2004年9月22日保藏，保藏号NCIMB 41248。可将这种细胞直接掺入饲料中。
在另一方面，提供了一种生产肌醇六磷酸酶的方法，包括用本发明的表达载体或质粒转染宿主细胞，在肌醇六磷酸酶的表达条件下培养所述宿主细胞，和从宿主细胞培养基中提取所述肌醇六磷酸酶。
适当地所述方法是生产肌醇六磷酸酶的方法，包括在宿主细胞中表达如SEQ ID NO3所示的氨基酸序列或与其具有至少75％同源性的序列或其有效片段，以及从宿主细胞培养基中提取分泌的蛋白。
本发明的另一方面提供一种包含本发明的肌醇六磷酸酶的饲料组合物。优选该饲料组合物包含浓度为10-10000U/kg饲料，优选200-2000U/kg饲料，更优选500-1000U/kg饲料的肌醇六磷酸酶。
在一个实施方案中，该饲料组分包含本发明的宿主细胞。
在另一方面提供根据本发明的肌醇六磷酸酶在食品或动物饲料中的应用。
优选的方面在随附的权利要求书和后面的介绍以及实施例部分中给出优选的方面。
其他优点本发明是有益的，因为它提供了具有许多特性的肌醇六磷酸酶，这些特性使得其作为动物饲料的添加剂特别有用。
特别地，本发明的肌醇六磷酸酶在低pH下具有活性，优选pH 2-5.5的范围，活性最大值在pH 4-4.5左右。适当地本发明的肌醇六磷酸酶在胃环境的低pH下具有活性(pH 2.5时保留约40％的最大活性)。
另外，本发明的肌醇六磷酸酶在天然宿主和在异源表达期间都可以有效地分泌，由此导致更加有效的生产和分离，用于添加到饲料中。
而且，本发明的肌醇六磷酸酶优选具有宽泛的底物特异性，包括五磷酸酯，四磷酸酯，三磷酸酯和二磷酸酯底物，由此增加了可用于动物吸收的总磷酸酯(可得到的磷酸酯)。本发明的肌醇六磷酸酶还优选具有300U/mg+/-大约10％的高比活，优选至少300U/mg。
本发明的产物可以用作食品和饲料的添加剂/补充物。该产物还可以用于各种肌醇磷酸酯的商业生产。
肌醇六磷酸/植酸/肌醇六磷酸酶植酸(肌-肌醇六磷酸(myo-inositol hexakisphosphate))是谷类、豆类、油籽作物中的重要组分。盐的形式，肌醇六磷酸，是磷在这些植物中的主要储存形式。
肌醇六磷酸酶催化植酸的磷酸单酯水解，其导致逐步形成肌-肌醇五-，四-，三-，二-和单磷酸酯，以及无机磷酸酯的释放。
本文所用的术语″野生型肌醇六磷酸酶″或″野生型″指具有天然发现的氨基酸序列的肌醇六磷酸酶。
术语″肌醇六磷酸酶变体″或″变体″或″修饰形式″指具有源自亲本肌醇六磷酸酶氨基酸序列的氨基酸序列的肌醇六磷酸酶，其具有一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失，所述取代、插入和/或缺失总称为″突变″。
术语″亲本肌醇六磷酸酶″或″亲本酶″指由其衍生出肌醇六磷酸酶变体的肌醇六磷酸酶。亲本肌醇六磷酸酶可以是野生型肌醇六磷酸酶或另一种肌醇六磷酸酶变体。尤其在本发明中，″亲本肌醇六磷酸酶″可以源自布丘氏菌属。适当地，″亲本肌醇六磷酸酶″源自如本文所述的布丘氏菌属菌株P1-29，其优选具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
分离的一方面，优选核苷酸或氨基酸序列为分离的形式。术语″分离的″意指该序列至少基本上不含至少一种其它组分，而这种组分是与该序列天然相关联的，如天然所发现的那样。
纯化的一方面，优选核苷酸或氨基酸序列为纯化的形式。术语″纯化的″意指该序列处于相对纯的状态—至少1％，5％纯的或10％纯的，更优选至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％纯的。在优选的实施方案中，当涉及多肽时，如上定义的纯度根据通过SDS-PAGE电泳从其他多肽纯化而确定。在优选的实施方案中，当涉及多核苷酸时，如上定义的纯度根据从其他多核苷酸纯化而确定。
核苷酸序列本发明的范围包括编码具有如本文所定义的特定特性的酶的核苷酸序列。
如本文所用的术语″核苷酸序列″指寡核苷酸序列、核酸或多核苷酸序列，及其变体，同源物，片段和衍生物(如其部分)。核苷酸序列可以是基因组或合成或重组起源的，其可以是双链或单链的，不管代表有义链还是反义链。
涉及本发明的术语″核苷酸序列″或″核酸分子″包括基因组DNA，cDNA，合成DNA，和RNA。优选其指DNA，更优选指编码本发明的cDNA序列。
在优选的实施方案中，当涉及和当被本发明的自身范围所包括时，核苷酸序列并不包括处于天然环境之中、并与其天然相关联的一个或多个序列相连的根据本发明的天然核苷酸序列，而所述天然相关联的序列也处于其天然环境之中。为了方便参考，我们将把这种优选的实施方案称为“非天然核苷酸序列”。在这点上，术语″天然核苷酸序列″意指处于其天然环境之中的完整核苷酸序列，以及当它与天然相关联的完整启动子可操作性连接之时，所述启动子也处于天然环境之中。不过，本发明的范围所包括的氨基酸序列可以是其天然生物中表达后分离和/或纯化的核苷酸序列产物。不过，本发明的范围所包括的氨基酸序列优选可以在其天然生物中由核苷酸序列所表达，但是其中所述核苷酸序列并不在该生物中与所述核苷酸序列天然相关联的启动子的控制之下。
核苷酸序列的制备一般，本发明的范围所包括的氨基酸序列或用于本发明的核苷酸序列是利用重组DNA技术制备的(即，重组DNA)。不过，在本发明的备选实施方案中，可以利用本领域公知的化学方法全部或部分地合成核苷酸序列(参见Caruthers MH(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和Horn T等，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。
由产生所述酶的任何细胞或生物可以鉴定和/或分离和/或纯化出编码具有如本文所定义的特定特性的酶或适于修饰的酶的核苷酸序列。本领域已知多种方法来鉴定和/或分离和/或纯化核苷酸序列。举例来说，一旦已经鉴定和/或分离和/或纯化了合适的序列，就可以使用PCR扩增技术以制备更多序列。
作为进一步的举例，利用来自产生所述酶的生物的染色体DNA或信使RNA可以构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果已知该酶的氨基酸序列或该酶的部分氨基酸序列，可以合成标记的寡核苷酸探针并用来由基因组文库鉴定编码酶的克隆，所述文库由所述生物制备。或者，可以利用包含与另一种已知酶基因同源的序列的经标记的寡核苷酸探针来鉴定编码酶的克隆。在后一种情况中，利用低严谨度的杂交和洗涤条件。
或者，可以通过将基因组DNA片段插入表达载体，如质粒中，用得到的基因组DNA文库转化酶阴性细菌，随后将转化的细菌铺平板到包含该酶底物(例如对于产葡萄糖苷酶(麦芽糖酶)的酶，底物为麦芽糖)的琼脂板上，由此得以鉴定表达该酶的克隆，来鉴定编码酶的克隆。
在又一个备选方案中，可以通过已确立的标准方法合成性制备编码酶的核苷酸序列，例如由Beucage S.L.等，(1981)Tetrahedron Letters 22，p1859-1869所述的氨基磷酸酯(phosphoroamidite)方法，或由Matthes等，(1984)EMBO J.3，p 801-805所述的方法。在氨基磷酸酯方法中，例如在自动DNA合成仪中合成寡核苷酸，纯化，退火并克隆在合适的载体中。
核苷酸序列可以是混合的基因组和合成起源的，混合的合成和cDNA起源的，或混合的基因组和cDNA起源的，通过根据标准技术连接合成的、基因组的或cDNA起源(根据需要)的片段而制备。每一个连接的片段都对应于完整核苷酸序列的各部分。还可以通过聚合酶链式反应(PCR)利用特定引物来制备DNA序列，例如在US 4,683,202或在Saiki R K等，(Science(1988)239，pp 487-491)中所述的。
由于遗传密码的简并性，可以轻易地生产核苷酸序列，其中对于一些或所有由原始核苷酸序列编码的氨基酸改变了三联体密码子用法，由此产生与原始核苷酸具有低同源性的核苷酸序列，但是其编码与原始核苷酸序列所编码的相同、或变体氨基酸序列。例如，对于大多数氨基酸来说，遗传密码的简并性是在三联体密码子中的第三个位置上(摆动位置)(参考文献见Stryer，Lubert，Biochemistry，Third Edition，Freeman Press，ISBN0-7167-1920-7)，因此，所有三联体密码子都在第三位置上发生“摆动”的核苷酸序列与原始核苷酸序列将具有大约66％的同一性，然而，改变的核苷酸序列将与原始核苷酸序列编码相同或变异的一级氨基酸序列。
因此，本发明进一步涉及任何核苷酸序列，所述核苷酸序列对于编码氨基酸的至少一个三联体密码子改变了三联体密码子用法，但是其与原始核苷酸序列编码的多肽序列具有相同、或变体多肽序列。
另外，具体的生物一般对于用来编码氨基酸的三联体密码子有所偏好。优选的密码子用法表是随处可得的，并且可以用来制备密码子优化基因。常规使用这些密码子优化技术来优化异源宿主中的转基因表达。
分子进化一旦分离和/或纯化了编码酶的核苷酸序列，或鉴定了推定的编码酶的核苷酸序列，可以希望修饰选定的核苷酸序列，例如希望对序列进行突变从而制备根据本发明的酶。
可以利用合成性寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸包含位于所需突变位点侧翼的核苷酸序列。
在Morinaga等(Biotechnology(1984)2，p646-649)中描述了合适的方法。在Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，p 147-151)中描述了将突变引入编码酶的核苷酸序列的另一种方法。
除了诸如上面所述的定点诱变之外，还可以例如利用商业试剂盒如来自Stratagene的GeneMorph PCR诱变试剂盒，或来自Clontech的DiversifyPCR随机诱变试剂盒随机引入突变。
获得新序列的第三种方法是对非同一性的核苷酸序列进行片段化，通过利用任一种限制性酶或酶如DNA酶I，并重新组配编码功能性蛋白质的完整核苷酸序列。或者可以使用一个或多个非同一性核苷酸序列并在完整核苷酸序列的组配过程中引入突变。
因而，有可能在体内或体外在核苷酸序列中产生多个定点或随机突变，随后通过各种方法筛选编码多肽的改良的功能性。
作为非限制性实例，可以将多核苷酸序列的突变或天然变体与野生型或其它突变或天然变体重组以产生新的变体。也可以针对所编码多肽的改良的功能性筛选这些新的变体。通过本领域公知的各种方法，例如错误阈值诱变(Error Threshold Mutagenesis)(WO 92/18645)，寡核苷酸介导的随机诱变(US 5,723,323)，DNA改组(US 5,605,793)，外介导的(exo-mediated)基因组配(WO 0058517)产生新的优选变体。例如在WO0134835，WO 02/097130，WO 03/012100，WO03/057247，WO 2004/018674，US 6,303,344和US 6,132,970中描述了其它合适的方法。
上述和类似的分子进化方法的应用可以鉴定和选择本发明的酶的变体而无需任何蛋白质结构或功能的现有知识，所述变体具有优选的特性，并且可以生产不可预测但有益的突变或变体。本领域有许多应用分子进化以优化或改变酶活性的实例，所述实例包括，但不限于下列的一种或多种在宿主细胞中或体外优化的表达和/或活性，提高的酶活性，改变的底物和/或产物特异性，提高或降低的酶学或结构稳定性，在优选的环境条件，例如，温度、pH、底物中改变的酶活性/特异性。
上述分子进化方法可用于制备如本文所述的肌醇六磷酸酶变体的方法中。
氨基酸序列本发明的范围还包括具有如本文所定义的特异性质的酶的氨基酸序列。
如本文所用的，术语″氨基酸序列″与术语″多肽″和/或术语″蛋白质″同义。在一些情况下，术语″氨基酸序列″与术语″肽″同义。在一些情况下，术语″氨基酸序列″与术语″酶″同义。
氨基酸序列可以由合适的来源制备/分离，或者其可以合成制备或者可以通过利用重组DNA技术来制备。
本发明所包括的酶可以结合其它酶使用。因而本发明还包括酶的组合，其中所述组合包含本发明的酶和另一种酶，其可以是根据本发明的另一种酶。在后面的部分中对这方面进行讨论。
当涉及或者当被本发明的自身范围所包括时，氨基酸序列优选不是天然酶。在这一点上，术语″天然酶″意指在其天然环境下的完整酶，并且当其由天然核苷酸序列表达。
变体/同源物/衍生物本发明还包括酶的任何氨基酸序列或编码这种酶的任何核苷酸序列的变体、同源物和衍生物的用途。
在这里，术语“同源物”意指与氨基酸序列和核苷酸序列具有一定同源性的实体。在这里，术语″同源性″可以等同于“同一性”。适当地，在本文中″同源的″指在利用下面更加详细介绍的比对算法来比对其序列之后两种酶之间的序列同一性。
在本文中，同源的氨基酸序列用来包括可以与序列至少75，80，81，85或90％同一，优选至少95，96，97，98或99％同一的氨基酸序列。一般，同源物将例如与目标氨基酸序列包含相同的活性位点。尽管同源性也可以用相似性(即具有类似化学特性/功能的氨基酸残基)来考虑，在本发明的上下文中，优选用序列同一性表示同源性。
“功能片段”意指保留该多肽的特征性特性的多肽片段。在本发明的上下文中，肌醇六磷酸酶的功能片段是保留完整蛋白质的肌醇六磷酸切割能力的片段。
在本文中，同源的核苷酸序列用来包括可以与编码本发明的酶的核苷酸序列(目标序列)至少75，80，81，85或90％同一性，优选至少95，96，97，98或99％同一的核苷酸序列。一般，同源物将包含与目标核苷酸序列编码相同活性位点等的序列。尽管同源性也可以用相似性(即具有类似化学特性/功能的氨基酸残基)来考虑，在本发明的上下文中，优选用序列同一性表示同源性。
对于氨基酸序列和核苷酸序列来说，可以通过肉眼，或者更常借助于易于得到的序列比较程序来进行同源性比较。这些商业上现有的计算机程序可以计算两个或多个序列之间的％同源性。
％同源性可通过毗邻序列来计算，即，将一个序列与另一个序列进行序列对比，并且一个序列中的每个氨基酸直接与另一个序列的相应氨基酸进行每次一个残基的比较。这被称为“无缺口的”序列对比。通常，所述无缺口的对比只在相对少量的残基中进行。
尽管这是非常简单且一致的方法，但是它没有考虑到，例如，在序除此之外相同的列配对中，一个插入或缺失将导致随后的氨基酸残基被逐出序列对比，因此当进行整体排列时，将很可能导致％同源性的大幅度下降。因此，多数序列比较方法被设计成考虑到可能的插入和缺失而不会对整体同源性积分不适当地罚分，从而产生最佳的序列对比。这通过在序列对比中插入“缺口”来试图最大化局部的同源性而实现。
但是，这些更复杂的方法对序列对比中出现的每个缺口指定了“缺口罚分”，这样，对于相同数量的相同氨基酸，带有尽可能少的缺口的序列对比——反映两个比较序列之间的更高相关性—将比有较多缺口的序列获得更高的积分。一般用“远交缺口计分(Affine gap costs)”来给缺口的存在扣(charge)较多的计分，给缺口中每个随后的残基扣较少罚分。这是最普遍使用的缺口积分系统。高缺口罚分当然将产生具有较少缺口的最优化的序列对比。多数序列对比程序允许修改缺口罚分。但是当使用这种软件作序列比较时，优选使用缺省值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit包时，氨基酸序列的缺省缺口罚分是缺口为-12，每个延伸为-4。
因此最大％同源性的计算首先需要产生考虑到缺口罚分的最佳序列对比。用于进行这种比对的合适的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(Devereux等，1984，Nucleic Acids Research 12387)。可以进行序列比较的其他软件的例子包括，但不局限于BLAST软件包(参见Ausubel等，1999，Short Protocols in Molecular Biology，第四版，第18章)，FASTA(Atschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和GENEWORKS比较工具系列。BLAST和FASTA都可得到，用于脱机和联机检索(参见Ausubel等，1999，ShortProtocols in Molecular Biology，第7-58到7-60页)。
不过，对于一些应用，优选使用GCG Bestfit程序。一种称作BLAST2序列的新工具也可以用于比较蛋白和核苷酸序列(见FEMS MicrobiolLett 1999174(2)247-50；FEMS Microbiol Lett 1999177(1)187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。
尽管最终同源性百分比可以根据同一性而测量，对比过程自身一般不以全或无成对比较为基础。相反，通常使用按比例绘制的(scaled)相似性评分矩阵将得分分配到每个以化学相似性或进化距离为基础而进行的成对比较。这种常用矩阵的一个例子是BLOSUM62矩阵，即BLAST程序系列的缺省矩阵。GCG Wisconsin程序一般用公共默认值或如果已提供，则使用自定义符号比较表(更详细内容见用户手册)。对于一些应用，优选将公共默认值用于GCG软件包，或在使用其它软件的情况下，使用缺省矩阵，如BLOSUM62。
或者，可以利用DNASISTM(Hitachi软件)中的多重比对特征，基于类似于CLUSTAL(Higgins DG&Sharp PM(1988)，Gene 73(1)，237-244)的算法来计算百分比同源性。
一旦软件产生最优对比，就有可能计算％同源性，优选％序列同一性。软件一般作为序列比较的一部分进行此计算并产生以数字表示的结果。
本发明优选的方面中利用用于计算百分比序列同源性/同一性的下列软件和设置。对于氨基酸序列的同一性(同源性)或″阳性″百分比，通过AlignXVectorNTI(来自Invitrogen Corporation，Carlsbad，California，USA.的VectorNTI Advance 9.1)对每一可能的氨基酸序列对计算。设置为缺省参数(缺口开放罚分-10，缺口延伸罚分0.1)。
对于核酸序列的同一性(同源性)或″阳性″百分比，通过来自InformaxInc.(USA)的AlignX VectorNTI程序对每一可能的核酸序列对计算。设置为对DNA的默认设置，为缺口开放罚分15和缺口延伸罚分6.66(对于多重比对为相同的设置)。
优选氨基酸同一性(同源性)跨越全长氨基酸序列计算，或对于核酸为编码相应全长氨基酸序列的对应多核苷酸。
序列也可以有氨基酸残基的缺失、插入或取代，其产生沉默改变并导致产生功能等同物。可以根据氨基酸特性(如残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、和/或双亲性)的相似而进行有意的氨基酸取代，所以将氨基酸以官能团分类在一起是有用的。氨基酸可以仅仅以它们的侧链特性而分类在一起。不过，包括突变数据等更加有用。由此衍生的氨基酸组有可能由于结构的原因而是保守的。这些组能够以Venn图表的形式描述(LiVingstone C.D.和Barton GJ.(1993)″Protein sequence alignmentsastrategy for the hierarchical analysis of residue conservation″Compiit.ApplBiosci.9745-756)(Taylor W.R.(1986)″The classification of amino acidconservation″J.Theor.Biol.119；205-218)。例如根据下表可以制备保守性取代，所述表描述了普遍接受的氨基酸分类的Venn图表。
本发明也包含可以发生的同源取代(这里用到的取代和替代都表示现有氨基酸残基与备选残基的交换)，即相似物取代相似物，如碱性取代碱性，酸性取代酸性，极性取代极性等等。也可发生非-同源取代，即从一类残基取代为另一类，或者包括引入非天然氨基酸如鸟氨酸(以下简称Z)，二氨基丁酸鸟氨酸(以下简称B)，正亮氨酸鸟氨酸(以下简称O)，吡啶丙氨酸，噻吩丙氨酸，萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。
也可通过非天然氨基酸进行替代。
变体氨基酸序列可以包括可以插入序列的任意两个氨基酸残基之间的适当间隔子基团，包括烷基，例如甲基、乙基或丙基，以及氨基酸间隔子，如甘氨酸或β丙氨酸残基。本领域的技术人员将容易理解变异的其它形式，其包括类肽形式的一种或更多氨基酸残基的存在。为了免除怀疑，“类肽形式”用来指变体氨基酸残基，其中α碳取代基是在残基的氮原子上，而不是在α碳上。制备类肽形式的肽的方法是本领域中公知的，如Simon RJ等，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134。
用于本发明的核苷酸序列可以包括合成或修饰的核苷酸。寡核苷酸的许多不同类型的修饰是本领域已知的。这些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链，和/或在分子的3′和5′端添加吖啶或多聚赖氨酸链。为了本发明的目的，要理解在此所描述的核苷酸序列可以通过本领域已有的任何方法进行修饰。可以进行这种修饰以便提高体内活性或本发明的核苷酸序列的寿命。
本发明还包括与本文给出的序列互补的核苷酸序列，或其任何衍生物、片段或其衍生物的用途。如果序列与其片段互补那么该序列可以用作探针来在其它生物等中鉴定类似的编码序列。
可以以多种方式获得与本发明的序列不具有100％同源性但是落在本发明范围内的多核苷酸。可以例如通过探测从许多个体，例如来自不同种群的个体制备的DNA文库，来获得本文所述的序列的其它变体。此外，可以获得其它的同源物并且这样的同源物及其片段通常能够任选地与在本文的序列表中显示的序列杂交。这样的序列可以通过探测制备自其它物种的cDNA文库或来自其它物种的基因组DNA文库，并在中度至高严格条件下，用包含在后附的序列表中的任何一个序列的全部或部分的探针探测这些文库来获得。应用类似的考虑来获得本发明的多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。
还可以使用简并PCR来获得变体和菌株/物种同源物，所述简并PCR使用这样的引物，所述引物被设计以靶向变体和同源物中的序列，所述序列编码本发明的序列中的保守氨基酸序列。保守序列可以例如通过比对来自数种变体/同源物的氨基酸序列进行预期。序列比对可以使用本领域已知的计算机软件来进行。例如，广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。
在简并PCR中使用的引物包含一个或多个简并位点并且将在这样的严格条件下使用，所述严格条件低于用针对已知序列的单序列引物克隆序列所使用的那些条件。
或者，这些多核苷酸可以通过被表征的序列的定点诱变来获得。这在例如需要沉默密码子序列变化以优化特定宿主细胞的密码子偏好的情况中可以是有用的，在所述特定宿主细胞中多核苷酸序列被表达。可能需要其它的序列变化以引入限制性酶识别位点，或改变由所述多核苷酸编码的多肽的性质或功能。
可以使用本发明的多核苷酸(核苷酸序列)来产生引物，例如PCR引物，用于选择性扩增反应的引物，探针例如，通过常规方式，使用放射性或非放射性标记标记以具有显示性的标记，或者可以将所述多核苷酸克隆入载体中。这些引物、探针和其它片段的长度将至少为15，优选至少20，例如至少25，30或40个核苷酸，并且也被本文所用的术语本发明的多核苷酸所包括。
可以重组性地，合成性地，或通过本领域技术人员已知的任何方法来生产根据本发明的多核苷酸如DNA多核苷酸和探针。其还可以通过标准技术进行克隆。通常，将通过合成方法来生产引物，包括一次一个核苷酸来逐步生产所需的核酸序列。利用自动技术实现此的技术可以轻易在现有技术中获得。
一般将利用重组方法来生产较长的多核苷酸，例如利用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术。可以将引物设计成包含合适的限制性酶识别位点从而可以将扩增的DNA克隆入合适的克隆载体中。
生物学活性优选所述变体序列等与本文所给出的序列至少同样具有生物学活性。
如本文所用的“生物学活性”指一种序列，其具有与天然发生的序列相似的结构功能(但不必同等程度)，和/或相似的调控功能(但不必同等程度)，和/或相似的生化功能(但不必同等程度)。
尤其，变体序列或其修饰形式具有与本文鉴定的肌醇六磷酸酶酶学谱相似的酶学谱。这种谱包括诸如作为分泌蛋白的特征，具有pH2-5.5范围的最佳pH，优选4.0-4.5，在pH2-5.5范围下保留至少50％的最大活性，和/或具有超过300U/mg的比活。
杂交本发明还包括与本发明的序列互补的序列或可以与本发明的序列或其互补序列杂交的序列。
如本文所用的术语“杂交”应包括“使核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程”，以及在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行的扩增过程。
本发明还包含可以与这里所述序列，或其任意衍生物、片段或其衍生物互补的序列杂交的核苷酸序列的用途。
术语“变体”还包括可以与这里所述核苷酸序列杂交的序列互补的序列。
优选，术语“变体”包括可以在严谨条件下(如50℃和0.2×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH7.0})与此处呈现的核苷酸序列杂交的序列互补的序列。
更优选，术语“变体”包括可以在高严谨条件下(如65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH7.0})与此处呈现的核苷酸序列杂交的序列互补的序列。
本发明还涉及可以与本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列(包括本文给出序列的互补序列)。
本发明还涉及与可以与本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列(包括本文给出序列的互补序列)互补的核苷酸序列。
可以在中度到最大严谨度条件下与本文给出的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列也包括在本发明的范围中。
在一个优选方面，本发明包含可以在严谨条件下(如50℃和0.2×SSC)与本发明的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。
在一个更优选的方面，本发明包含可以在高严谨条件下(如65℃和0.1×SSC)与本发明的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。
定点诱变一旦分离和/或纯化出编码酶的核苷酸序列，或鉴定出推定的编码酶的核苷酸序列，可以预期使序列突变，从而制备本发明的酶。
可以用合成寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸含有所需突变位点的侧翼核苷酸序列。
适合的方法公开于Morinaga等(Biotechnology(1984)2，p646-649)中。另一种将突变引入编码酶的核苷酸序列中的方法描述于Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，p147-151)。另一种方法描述于Sarkar和Sommer(Biotechniques(1990)，8，p404-407-“The megaprimer methodof site directed mutagenesis”)中。
重组的在一方面，用于本发明的序列是重组序列—即已经利用重组DNA技术制备的序列。
这些重组DNA技术是本领域普通技术人员能力范围内的技术。这些技术在文献，例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，MolecularCloningA Laboratory Manual，Second Edition，Books 1-3，Cold Spring HarborLaboratory Press中进行了解释。
合成的在一方面，用于本发明的序列是合成的序列—即已经通过体外化学或酶学合成制备的序列。其包括但不限于，用宿主生物偏好的密码子用法制备的序列—所述宿主生物如甲基营养型酵母毕赤酵母属和汉森酵母属。
酶的表达用于本发明的核苷酸序列可以被并入重组可复制载体。该载体可以用于复制、和在相容性宿主中和/或由相容性宿主以酶的形式表达该核苷酸序列。
可以用控制序列例如调控序列控制表达。
通过核苷酸序列表达而由宿主重组细胞产生的酶可以被分泌，或包含在细胞内，这取决于使用的序列和/或载体。可以将编码序列设计为具有信号序列，该信号序列增强编码序列通过特定原核或真核细胞膜的直接分泌。
有利地，本发明的酶是分泌的。
表达载体术语“质粒”、“载体系统”或“表达载体”意指能够体内或体外表达的构建体。在本发明的上下文中，这些构建体可以用来将编码酶的基因导入宿主细胞中。适当地，其表达可被导入的基因可以称作“可表达的转基因”。
优选，将表达载体掺入合适的宿主生物体的基因组。术语“掺入”优选包括稳定掺入基因组。
本文所述的核苷酸序列，包括本发明的核苷酸序列，可以存在于载体中，其中核苷酸序列被可操作性连接到调控序列上，所述调控序列能够通过适当宿主生物体提供核苷酸序列的表达。
用于本发明的载体可以被转化到下面所述的适当宿主细胞中，从而提供本发明多肽的表达。
载体例如质粒、粘粒或噬菌体载体的选择通常将取决于其将要导入的宿主细胞。
用于本发明的载体可以包含一种或多个可选择的标记基因—如赋予抗生素抗性例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的基因。或者，可以通过共转化来实现选择(如WO91/17243中所述)。
可以体外使用载体，例如来生产RNA，或用来转染、转化、转导或感染宿主细胞。
因而，在另一个实施方案中，本发明提供制备本发明的核苷酸序列的方法，该方法是通过将本发明的核苷酸序列导入可复制的载体，将该载体导入相容的宿主细胞中，和在能够带来载体复制的条件下生长所述宿主细胞而进行的。
所述载体可以进一步包含能够使载体在所研究的宿主细胞中复制的核苷酸序列。这些序列的实例为质粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMBl，pIJ101、pTZ12和pET11的复制起点。
调控序列在一些应用中，用于本发明的核苷酸序列可操作性地连接到调控序列上，所述调控序列能够提供核苷酸序列的表达，如通过选定的宿主细胞的表达。例如，本发明包括这样一种载体，其包含可操作性地连接到这种调控序列上的本发明的核苷酸序列，即所述载体是表达载体。
术语“可操作性地连接”指一种毗连，其中所述组分的关系使得其以其所希望的方式发挥作用。以特定的方式连接“可操作性地连接”到编码序列上的调控序列，从而在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
术语“调控序列”包括启动子和增强子和其它表达调控信号。
以本领域正常意义使用术语“启动子”，例如RNA聚合酶结合位点。
还可以通过选择异源调控区例如启动子、分泌前导区和终止子区域来增加编码本发明的酶的核苷酸序列的表达。
优选，根据本发明的核苷酸序列可操纵地与至少一个启动子连接。
指导核苷酸序列在细菌、真菌或酵母宿主中转录的合适的启动子的实例是本领域众所周知的。
构建体构建体术语“构建体”—其与术语如“缀合物”、“盒”和“杂交体”同义—包括按照本发明使用直接或间接连接于启动子的核苷酸序列。
间接连接的实例是在启动子和本发明的核苷酸序列之间提供适合的间隔子基团，如内含子序列，如Sh1-内含子或ADH内含子。涉及本发明的术语“融合的”也是如此，其包括直接或间接连接。在一些情况中，该术语不包括核苷酸序列的天然组合，所述核苷酸序列编码与野生型基因启动子相关联的蛋白质，并且当它们均处在天然环境中时。
所述构建体可以甚至包含或表达容许选择遗传构建体的标记。
对于一些应用而言，优选地，本发明的构建体至少包含与启动子可操纵连接的本发明的核苷酸序列。
宿主细胞涉及本发明的术语″宿主细胞″包括任何细胞，所述细胞包含如上所述的核苷酸序列或表达载体，并且用于重组生产具有如本文定义的具体的性质的酶，或用于本发明的方法。
因此，本发明的另一个实施方案提供用表达本发明所述的酶的核苷酸序列转化或转染的宿主细胞。选择细胞来与所述载体相容并且所述细胞可以例如是原核生物(例如细菌)、真菌、酵母或植物细胞。优选地，所述宿主细胞不是人细胞。
合适的细菌宿主生物的实例是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌物种。
在一优选的实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌，如已观察到布丘氏菌属P1-29肌醇六磷酸酶在大肠杆菌中有效分泌。在一种或多种下列表达宿主中异源表达后，鉴定肌醇六磷酸酶，包括变体大肠杆菌K12；枯草芽孢杆菌；酿酒酵母。这些宿主因此也是优选的。
根据编码本发明的酶的核苷酸序列的性质和/或对于进一步加工表达的蛋白质的需要，可以优选真核宿主，如酵母或其它真菌。通常，酵母细胞优于真菌细胞，因为它们易于操纵。然而，一些蛋白质不易从酵母细胞中分泌，或在一些情况中不能正确加工(例如，在酵母中过度糖基化)。在这些情况中，应该选择不同的真菌宿主生物。
使用合适的宿主细胞—如酵母，真菌和植物宿主细胞—可以提供翻译后修饰(例如，十四烷酰化，糖基化，平截，lapidation和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，因为可能需要给本发明的重组表达产物赋予优化的生物活性。
宿主细胞可以是蛋白酶缺陷或蛋白酶负型菌株。
可以修饰宿主细胞的基因型来提高表达。
宿主细胞修饰的实例包括蛋白酶缺陷，稀有tRNA′s的补充，和改变在细胞质中的还原电势以增加二硫键形成。
例如，宿主细胞大肠杆菌可以过量表达稀有的tRNA′s以提高异源蛋白质的表达，如在Kane(Curr Opin Biotechnol(1995)，6，494-500″Effects ofrare codon clusters on high-level expression of heterologus proteins in E.coli″中例示/描述。所述宿主细胞可以缺乏许多还原酶，因此有利于形成稳定的二硫键，如在Bessette(Proc Natl Acad Sci USA(1999)，96，13703-13708″Efficient folding of proteins with multiple disulphide bonds in the Escherichiacoli cytoplasm″)中例示/描述。
在一个实施方案中，本发明上下文中的宿主细胞包括可以直接添加到动物饲料中的那些细胞。
生物体涉及本发明的术语″生物体″包括这样的任何生物，所述生物可以包括编码如在本发明中所述的酶的核苷酸序列和/或获自其中产物，和/或其中当本发明的核苷酸序列存在于所述生物中时，启动子可以容许根据本发明的核苷酸序列的表达。
合适的生物体可以包括原核生物、真菌、酵母或植物。
涉及本发明的术语″转基因生物″可以包括这样的任何生物，所述生物包括编码如在本发明中所述的酶的核苷酸序列和/或获自其中的产物，和/或其中启动子可以容许根据本发明的核苷酸序列在所述生物中的表达的任何生物。优选地，将所述核苷酸序列掺入所述生物的基因组中。
术语″转基因生物″不包括当它们在其天然启动子控制下时，在它们天然环境中的天然核苷酸编码序列，所述天然启动子也在其天然环境中。
因此，本发明的转基因生物包括这样的生物，所述生物包含编码如本发明所述的酶的核苷酸序列，根据本发明的构建体，根据本发明的载体，根据本发明的质粒，根据本发明的细胞，根据本发明的组织，或其产物的中任何一种，或其组合。
例如，所述转基因生物还可以包括在异源启动子控制下编码本发明的酶的核苷酸序列。
宿主细胞/生物体的转化如前面指出，宿主生物可以是原核生物体或真核生物体。合适的原核生物宿主的实例包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。
关于原核宿主的转化的教导在本领域的文献中有充分记载，例如见Sambrook等(Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，1989，ColdSpring Harbor Laboratory Press)。其它合适的方法在本文实施例中提出。如果使用原核宿主，那么核苷酸序列可能需要在转化前进行适当地修饰——如通过去除内含子进行修饰。
丝状真菌细胞可以使用本领域已知的各种方法进行转化——诸如包括形成原生质体和转化原生质体，随后以已知方式再生细胞壁的方法。在EP 0 238 023中描述了将曲霉属(Aspergillus)用作宿主微生物。
另一种宿主生物体可以是植物。用于转化植物的一般技术的综述可以见于Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)的文章。关于植物转化的另外的教导可以见于EP-A-0449375。
关于真菌、酵母和植物的转化的一般教导见于下面的部分。
转化的真菌宿主生物可以是真菌——如丝状真菌。合适的这样的宿主的实例包括属于高湿霉属(Thermomyces)，支顶孢属(Acremonium)，曲霉属，青霉属(Penicillium)，毛霉属(Mucor)，脉孢菌(Neurospora)，木霉属(Trichoderma)等属的任何成员。
关于转化丝状真菌的教导综述于US-A-5741665，其陈述了转化丝状真菌的的标准技术，培养所述真菌是本领域众所周知的。用于粗糙链孢霉(N.crassa)的技术的广泛综述见于例如Davis和de Serres，Methods Enzymol(1971)17A79-143。
关于转化丝状真菌的另外的教导综述于US-A-5674707。
在一方面，宿主生物可以是曲霉菌属生物，如黑曲霉(Aspergillus niger)。
还可以按照，例如Turner G.1994(Vectors for genetic manipulation.InMartinelli S.D.，Kinghorn J.R.(Editors)Aspergillus50years on.Progress inindustrial microbiology vol 29.Elsevier Amsterdam 1994.pp.641-666)的教导制备根据本发明的转基因曲霉属。
基因在丝状真菌中的表达已经综述于Punt等.(2002)Trends Biotechnol2002May；20(5)200-6，Archer&Peberdy Crit Rev Biotechnol(1997)17(4)273-306中。
转化的酵母在另一个实施方案中，转基因生物体可以是酵母。
在例如Methods Mol Biol(1995)，49341-54，和Curr Opin Biotechnol(1997)Oct；8(5)554-60中提供关于异源基因在酵母中表达的原理的综述。
在该方面，可以将酵母——诸如物种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisi)或巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)(见FEMS Microbiol Rev(2000 24(1)45-66)用作异源基因表达的载体。
在E Hinchcliffe E Kenny(1993，″Yeasts as a vehicle for the expression ofheterologous genes″，Yeasts，Vol 5，Anthony H Rose and J Stuart Harrison，eds，第二版，Academic Press Ltd.)中提供在酿酒酵母中异源基因表达和基因产物的分泌的原理的综述。
对于酵母的转化，已经开发了一些转化方法。例如，可以按照Hinnen等，(1978，Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75，1929)；Beggs，J D(1978，Nature，London，275，104)；和Ito，H等(1983，J Bacteriology 153，163-168)的教导制备根据本发明的转基因的酵母。
可以使用各种选择标记——如营养缺陷型标记、显性抗生素抗性标记来选择转化的酵母细胞。
转化的植物/植物细胞适合于本发明的宿主生物可以是植物。一般技术的综述可以见于Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 199417-27)的文章。
培养和生产用本发明的核苷酸序列转化的宿主细胞可以在有益于编码的酶的产生并有利于酶从所述细胞和/或培养基中回收的条件下培养。
用于培养所述细胞的培养基可以是适合于培养目的宿主细胞并获得所述酶的表达的任何常用培养基。
可以在细胞的表面上呈现由重组细胞产生的蛋白质。
酶可以从宿主细胞中分泌并可以方便地使用众所周知的方法从培养基中回收。
分泌可以希望使酶从表达宿主中分泌到其中酶可能更易于回收的培养基中。根据本发明，分泌前导序列可以基于期望的表达宿主进行选择。杂交体信号序列也可以用于本发明的背景中。
异源分泌前导序列的典型实例是从真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-例如来自曲霉菌的18和24个氨基酸的形式)，α-因子基因(酵母，例如，酵母属(Saccharomyces)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和汉森氏酵母属(Hansenula))或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌属)起源的那些。
作为实例，在大肠杆菌中的异源蛋白质的分泌在Methods Enzymol(1990)182132-43中进行综述。
检测用于检测和测量氨基酸序列的表达的各种方法是本领域众所周知的。实例包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)，放射免疫测定法(RIA)和荧光激活的细胞分选术(FACS)。
广泛种类的标记和缀合技术是本领域那些技术人员已知的并且可以用在多种核酸和氨基酸测试中。
许多公司如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)，Promega(Madison，WI)，和US Biochemical Corp(Cleveland，OH)提供用于这些步骤的商业试剂盒和方法。
适合的报告分子或标记包括那些放射性核素，酶，荧光，化学发光，或显色剂以及底物，辅因子，抑制剂，磁性颗粒等。教导这些标记的应用的专利包括US-A-3,817,837；US-A-3,850,752；US-A-3,939,350；US-A-3,996,345；US-A-4,277,437；US-A-4,275,149和US-A-4,366,241。
此外，可以如在US-A-4,816,567中所显示产生重组免疫球蛋白。
检测肌醇六磷酸酶活性的其它合适的测试法是本领域已知的并且在本文进行例示。
融合蛋白可以将根据本发明使用的氨基酸序列作为融合蛋白进行制备，从而例如有助于提取和纯化。融合蛋白配偶体的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，6xHis，GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)和β-半乳糖苷酶。在融合蛋白配偶体和目标蛋白序列之间包括蛋白水解剪切位点从而容许去除融合蛋白序列也可以是有利的。
优选地，融合蛋白不会干扰蛋白质序列的活性。
已经在Curr Opin Biotechnol(1995)6(5)501-6中综述了在大肠杆菌中的基因融合表达系统。
在本发明的另一个实施方案中，氨基酸序列可以连接于异源序列以编码融合蛋白。例如，为了筛选能够影响物质活性的试剂的肽库，编码表达由商购抗体识别的异源表位的嵌合物质可以是有用的。
其它序列还可以结合一个或多个另外的目标蛋白质(POI)或目标核苷酸序列(NOI)来使用根据本发明应用的序列。
POI的非限制性实例包括木聚糖酶，脂肪酶，酸性磷酸酶和/或其它。这些包括例如调节饲料粘性的酶。所述NOI甚至可以是任何那些序列的反义序列。
POI甚至可以是融合蛋白，从而例如有助于提取和纯化或有利于增加体内肌醇六磷酸代谢。
POI甚至可以与分泌序列融合。
其它的序列也可以有利于分泌或增加分泌的POI的产率。这些序列可以编码伴侣蛋白，如例如在英国专利申请9821198.0中所述的黑曲霉cyp B基因的产物。
可以出于许多原因对编码POI的NOI进行改造从而改变它们的活性，包括但不限于，改进其表达产物的加工和/或表达的改变。作为进一步的实例，还可以修饰NOI以优化在特定宿主细胞中的表达。可能需要其它的序列改变从而引入限制性酶识别位点。
编码POI的NOI在其中可以包括合成或修饰的核苷酸——诸如甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链。
可以修饰编码POI的NOI从而增加细胞内的稳定性和半衰期。可能的修饰包括，但不限于，加入分子的5′和/或3′末端的旁侧序列或在所述分子的主链中使用硫代磷酸酯或2’O-甲基而不是磷酸二酯键。
抗体本发明的一个方面涉及与SEQ ID No.3的氨基酸具有免疫反应性的氨基酸。
可以通过标准技术，诸如用本发明的物质进行免疫或通过使用噬菌体展示文库产生抗体。
出于本发明的目的，除非相反地指出，术语“抗体”包括，但不限于，多克隆，单克隆，嵌合的，单链，Fab片段，通过Fab表达文库产生的片段及其模拟物。这些片段包括完整抗体的片段，其保留它们对于目标物质，Fv，F(ab′)和F(ab′)2片段，以及单链抗体(scFv)，融合蛋白和包括抗体的抗原结合位点的其它合成蛋白质的结合活性。此外，抗体及其片段可以是人源化抗体。中和抗体，即，抑制物质多肽的生物活性的那些，对于诊断和治疗是尤其优选的。
如果需要多克隆抗体，用本发明的序列(或包含其免疫表位的序列)免疫选定的哺乳动物(例如，小鼠，兔，山羊，马等)。根据宿主的物种，可以使用各种佐剂来增加免疫应答。
收集来自被免疫的动物的血清，并根据已知的方法对其进行处理。如果包含针对本发明的序列(或包含其免疫表位的序列)的多克隆抗体的血清包含针对其它抗原的抗体，可以通过免疫亲和层析来纯化多克隆抗体。用于产生和加工多克隆抗血清的技术是本领域已知的。为了可以制备这些抗体，本发明还提供本发明的多肽或其片段，其半抗原化(haptenise)成另一种多肽来在动物或人中用作免疫原。
针对本发明的序列(或包含其免疫表位的序列)的单克隆抗体还可以由本领域技术人员容易地制备，并且包括，但不限于，杂交瘤技术Koehler和Milstein(1975Nature 256495-497)，人B-细胞杂交瘤技术(Kosbor等，(1983)Immunol Today 472；Cote等，(1983)Proc Natl Acad Sci802026-2030)和EBV-杂交瘤技术(Cole等，(1985)Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，Alan Rickman Liss Inc，pp 77-96)。
此外，可以使用为产生“嵌合抗体”所开发的技术，剪接小鼠抗体基因与人抗体基因从而获得具有适合的抗原特异性和生物活性的分子(Morrison等(1984)Proc Natl Acad Sci 816851-6855；Neuberger等，(1984)Nature312604-608；Takeda等，(1985)Nature 314452-454)。
或者，可以将对于生产单链抗体所述的技术(美国专利号4,946,779)进行改进以产生物质特异性单链抗体。
还可以产生包含对于所述物质的特异性结合位点的抗体片段。例如，这样的片段包括，但不限于，可以通过用胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab′)2片段和可以通过还原F(ab′)2片段的二硫键产生的Fab片段。或者，可以构建Fab表达文库以容许快速和容易地鉴定具有需要的特异性的单克隆Fab片段。(Huse WD等，(1989)Science 2561275-1281)。
大规模应用在本发明的一个优选实施方案中，将编码布丘氏菌属衍生的肌醇六磷酸酶的氨基酸序列或本发明的方法用于大规模的应用。具体而言，本发明的方法可以用于大规模生产肌醇六磷酸酶以作为食品或饲料组合物的添加剂/补充物进行工业应用。
优选，在培养宿主生物后，所述氨基酸序列以每升总细胞培养物体积的5g到每升约10g的量产生。
优选，在培养宿主生物体后，所述氨基酸序列以每升总细胞培养物体积的100mg到约每升900mg的量产生。
优选，在培养宿主生物后，所述氨基酸序列以每升总细胞培养物体积的250mg到约每升500mg的量产生。
肌醇六磷酸酶的应用如上文指出，本发明还涉及如本文所述的肌醇六磷酸酶的生产。
具体而言，本发明还涉及将在本文公开的氨基酸序列用于制备有机和无机的磷酸盐(酯)化合物。
因此，本发明还涉及将编码肌醇六磷酸酶的核苷酸序列用于产生表达所述肌醇六磷酸酶的表达载体或系统。
此外，本发明涉及将这些表达载体或系统用于产生表达肌醇六磷酸酶的宿主细胞。
本发明还涉及将修饰的宿主细胞用于产生有机和无机磷酸盐(酯)化合物的前体或用于产生特定的有机磷酸盐(酯)化合物。
合适的有机和无机磷酸盐(酯)化合物包括肌-肌醇五-，四-，三-，二-和单磷酸。
因此适当地，本发明提供产生有机磷酸盐(酯)化合物的方法，所述方法包括用衍生自布丘氏菌属的肌醇六磷酸酶处理肌醇六磷酸。优选地，所述方法的特征在于所述酶包含如SEQ ID NOs3所显示的氨基酸序列，或与其具有至少75％同一性(同源性)的序列或有效片段，或其修饰形式。适当地，有机磷酸盐(酯)是肌醇六磷酸或肌-肌醇二-，三-，四-，和五磷酸的所有可能的立体异构体。其它合适的有机磷酸盐(酯)包括肌醇-四磷酸和肌醇-寡磷酸。在优选的实施方案中，所述方法是体内生物技术方法。
用于生产有机磷酸盐(酯)化合物的这些方法可以适当地包括下列步骤a)提供包含可表达的转基因的宿主细胞，所述转基因包含布丘氏菌属肌醇六磷酸酶；b)在适合于表达所述转基因的条件下培养所述转基因生物；和c)从所述培养物中回收有机磷酸盐(酯)化合物。
可以将所述化合物用于许多应用，包括用于测试肌醇六磷酸酶的特征。一些肌醇磷酸酯涉及作为在细胞内调节的信号分子，并可以将其用作研究用化学药品。
在另一方面，提供生产食品或动物饲料的方法。动物饲料典型地在饲料粉碎机中生产，其中首先将原材料研磨成适合的颗粒大小，接着将其混合以适合的添加剂。接着，可以以醪液或粒状沉淀形式生产饲料；后者典型地包括将温度升高到目标温度，接着将所述饲料通过模具以产生特定大小的粒状沉淀的方法。随后，可以加入液体添加剂如脂肪和酶。在运输之前，使所述粒状沉淀冷却。动物饲料的生产还可以包括另外的步骤，所述另外的步骤包括在粒化之前进行挤压或膨胀。
因此，本发明还提供编码肌醇六磷酸酶的氨基酸序列或表达肌醇六磷酸酶的宿主细胞的用途，用于产生肌醇六磷酸酶以制备食品或饲料产品。在一方面，提供了将如本文所述的氨基酸序列用于制备食品或饲料产品的用途。在另一方面，提供了将根据本发明的宿主细胞用于制备食品或饲料产品的用途。在另一方面，提供将根据本发明的表达载体或系统用于制备食品或饲料产品的用途。
本发明还包括使用酶作为饲料的组分与其它组分组合递送给动物。
与其它组分的组合本发明的酶可以与其它组分或载体组合使用。
用于饲料的酶的合适的载体包括小麦(粗研的)。此外，存在许多封装技术，包括基于脂肪/蜡覆盖的那些技术、加入植物树胶等。
其它组分的实例包括下列各项的一个或多个增稠剂，胶凝剂，乳化剂，粘合剂，晶体改性剂，甜味剂(包括人工甜味剂)，流变学改性剂，稳定剂，抗氧化剂，染料，酶，载体，媒介物，赋形剂，稀释剂，润滑剂，增香剂，着色物质，悬浮剂，崩解剂，颗粒粘合剂等。这些其它的组分可以是天然的。这些其它的组分可以通过使用化学和/或酶学技术进行制备。
用于本文的术语“增稠剂或胶凝剂”用于本文时，指通过延缓或阻止颗粒移动来防止分离的产品，所述颗粒为不可混溶的液体、空气、或不可溶的固体的小滴。
将用于本文的术语“稳定剂″定义为防止产品(例如食品)随时间变化的成分或成分的组合。
用于本文的术语“乳化剂”指防止乳状液分离的成分(例如食品成分)。
用于本文的术语“粘合剂″指通过物理或化学反应将产品粘合在一起的成分(例如，食品成分)。
用于本文的术语“晶体改性剂”指影响脂肪或水的结晶作用的成分(例如食品成分)。
“载体”或“媒介物”指适合于化合物施用的材料并且包括本领域已知的任何这样的材料，诸如例如任何液体，凝胶，溶剂，液体稀释剂，增溶剂等，其是无毒的并且不会以有害的方式与所述组合物的任何组分相互作用。
在营养上可接受的载体的实例包括，例如，谷物，水，盐溶液，醇，聚硅氧烷，蜡，矿脂，植物油等。
赋形剂的实例包括下列各项的一个或多个微晶纤维素和其它的纤维素，乳糖，柠檬酸钠，碳酸钙，磷酸氢钙，甘氨酸，淀粉，乳糖和高分子量的聚乙二醇。
崩解剂的实例包括下列各项的一个或多个淀粉(优选地是谷物、马铃薯或木薯淀粉)，羟基乙酸淀粉钠，交联羧甲纤维素钠和某些复杂的硅酸盐。
颗粒的粘合剂的实例包括下列各项的一个或多个聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基甲基纤维素(HPMC)，羟丙基纤维素(HPC)，蔗糖，麦芽糖，明胶和阿拉伯胶。
润滑剂的实例包括下列各项的一个或多个硬脂酸镁，硬脂酸，甘油二十二烷酸酯和滑石。
稀释剂的实例包括下列各项的一个或多个水，乙醇，丙二醇和甘油，及其组合。
所述其它的组分可以同时(例如，当它们一起在混合物中时，或甚至当它们以不同的路径递送时)或顺序地(例如它们可以通过不同的路径递送)使用。
用于本文的术语“适合于动物或人食用的组分”意指作为添加物被添加或可以添加到本发明的组合物中的化合物，其可以是具有营养益处的、是纤维取代物或通常对于消费者具有有益作用。
作为实例，组分可以是益生元如藻酸盐(酯)，黄原胶，果胶，槐豆胶(LBG)，旋复花粉，瓜尔胶，半乳糖寡糖(GOS)，果糖寡糖(FOS)，乳蔗糖，大豆寡糖，palatinose，异麦芽寡糖，葡糖寡糖和木糖寡糖。
食品或饲料物质可以将所述化合物用作食品或饲料物质，或用在食品或饲料物质的制备中。在此处，术语“食品”以广泛意义使用，并且包括用于人的食物和食品以及用于动物的食物(即饲料)。关于在牲畜饲养中供应给动物的产品，使用术语″饲料″。在优选的方面，食品或饲料由单胃动物如猪，家禽和鱼食用。
根据使用和/或应用的模式和/或施用的模式，食品或饲料可以以溶液的形式或作为固体形式存在。
食品和饲料成分和添加物可以将化合物用作食品或饲料成分。
用于本文的术语“食品或饲料成分”包括被添加或可以被添加到食品或食料中的制剂，并且包括可以以低水平使用在多种产品中的制剂。
根据使用和/或应用的模式和/或施用的模式，食品成分可以以溶液的形式或作为固体形式存在。
所述化合物可以是食品添加物或可以被添加到食品添加物中。
食品和饲料组合物用于单胃动物的饲料组合物典型地包括包含植物产物的组合物，所述植物产物包含肌醇六磷酸。这些组合物包括基于玉米粉，大豆粉，油菜籽粉，棉籽粉，玉米，小麦，燕麦和高梁的饲料。
本文所述的肌醇六磷酸酶可以是食品或饲料组合物，或可以被添加到食品或饲料组合物中。
本发明还提供制备食品或饲料成分或添加物的方法，所述方法包括将由本发明的方法生产的肌醇六磷酸酶或按照本发明的组合物与另一种食品成分混合。制备方法或食品成分也是本发明的另一个方面。在上面提出了制备动物饲料的方法。所述酶还可以以固体制剂的形式或作为饲料添加剂如预混合液进行添加。固体形式典型地在混合步骤之前或其过程中进行添加，液体形式典型地在沉淀步骤后添加。
药物还可以将本发明的肌醇六磷酸酶用在药物制剂中或用于组合到粮食中从而提供某些药物作用。例如，EP 1,389,915描述了将肌醇六磷酸酶用在食品或饮料中以增加用于人的食品或饮料中的钙，铁和/或锌的有效性。
此外，EP 1,392,353描述了包含肌醇六磷酸酶的药物或营养添加物，其对于增加生命元素，例如钙和铁的生物利用率和对抗缺陷型疾病是有用的。
在此处，术语“药物”以广泛意义应用，并且包括用于人的药物和/或营养药以及用于动物的药物和/或营养药(即，兽医应用)。在优选的方面，所述药物用于人应用和/或用于动物饲养。
所述药物可以用于治疗目的，其可以在性质上是治疗性的、缓和性的或预防性的。所述药物甚至可以用于诊断目的。
当用作药物，或用在药物的制备中时，本发明的产物和/或化合物可以与下列各项的一个或多个结合使用药用载体，药用稀释剂，药用赋形剂，药用佐剂，药用活性成分。
根据使用和/或应用模式和/或施用模式，药物可以以溶液的形式或作为固体形式存在。
药物成分可以将本发明的产物和/或化合物用作药物成分。在此处，本发明的产品和/或组合物可以是单一的活性成分或其可以是许多(即，2个或更多)活性成分中的至少一种。
根据使用和/或应用的模式和/或施用的模式，药物成分可以以溶液的形式或作为固体形式存在。
药物成分可以以泡腾产品的形式存在以提高药物的溶解性质。
形式本发明的产品和/或化合物可以以任何合适的形式使用——不管是当单独存在时还是以组合物形式存在时。同样地，按照本发明产生的肌醇六磷酸酶(即，成分，诸如食品成分，功能性食品成分或药物成分)可以以任何合适的形式使用。
形式的合适的实例包括下列各项的一个或多个片剂，丸剂，胶囊，ovules，溶液，或混悬液，它们可以包含增香剂或着色剂，用于即刻的，延缓的，改进的，持续的，脉冲式的或受控的释放应用。
作为实例，如果所述产品和/或组合物以片剂形式使用——如用作功能性成分——所述片剂还可以包含下列各项的一个或多个赋形剂，崩解剂，颗粒粘合剂，或润滑剂。
用在制备所述形式中的在营养上可接受的载体的实例包括，例如，水，盐溶液，醇，聚硅氧烷，蜡，矿脂等。
用于所述形式的优选的赋形剂包括乳糖，淀粉，纤维素，乳糖，或高分子量的聚乙二醇。
对于水性混悬液和/或酏剂，可以将肌醇六磷酸酶裂解化合物组合以各种甜味剂或增香剂，着色物质或染料，组合以乳化剂和/或悬浮剂和组合以稀释剂如水，乙醇，丙二醇和甘油及其组合。
所述形式还可以包括明胶胶囊；纤维胶囊，纤维片剂等。
一般重组DNA方法技术除非另外指出，本发明使用常规的化学技术，分子生物学技术，微生物学技术，重组DNA技术和免疫学技术，它们都在本领域普通技术人员的能力范围内。这些技术都在文献中有所阐述。见，例如J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Books 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.等.(1995 and periodic supplements；Current Protocols in Molecular Biology，ch.9，13，和16，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，和A.Kahn，1996，DNA Isolation and SequencingEssential Techniques，JohnWiley & Sons；M.J.Gait(Editor)，1984，Oligonucleotide SynthesisA PracticalApproach，Irl Press；和，D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，Methods ofEnzymologyDNA Structure Part ASynthes is and Physical Analysis of DNAMethods in Enzymology，Academic Press.将这些一般性文章的每个并入本文作为参考。
实施例现在在下面的非限制性实施例中进一步举例说明本发明。
实施例1.肌醇六磷酸酶活性测试。
μl＝微升肌醇六磷酸酶测试在微量滴定板中进行。反应混合物(100μl)包含在200mM醋酸钠缓冲液，pH 3.5中的2mM肌醇六磷酸和0.8mM CaCl2。使反应在37℃进行1小时，随后通过改进的已知方法(Heinonen J.K.，LahtiRJ.Anal Biochem.113(2)，313-317(1981))来测量释放的磷酸盐(酯)。简言之，在每个微量滴定板孔中将200μl的新鲜制备的AMM溶液(7.5NH2SO4，15mM钼酸铵和丙酮—1∶1∶2)加入100μl的反应混合物中。加入AMM试剂后，在不早于10分钟和不晚于30分钟的时间内，测量在390nm的吸光度。通过用已知浓度的磷酸盐(酯)溶液构建校准曲线来测定磷酸盐(酯)的量。为了测试不同pH值下的肌醇六磷酸酶活性，使用下列的(全部为200mM)缓冲液介于pH 2.0和3.0之间的甘氨酸/HCl，介于pH 3.5和5.5之间的乙酸钠/乙酸，介于pH 6.0和7.5之间的Tris/马来酸。
实施例2.产生肌醇六磷酸酶的菌株P1-29细菌菌株P1-29最初从一堆腐烂的植物材料中分离，所述植物材料从芬兰南部森林的水坑底部收集。可以在许多简单培养基上在30℃需氧培养所述菌株，所述培养基例如LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH 7.4)或低磷酸盐(酯)培养基PP1(1％蛋白胨，1％牛肉提取物，0.5％酵母提取物，CaCl2-0.2M)。通过用NaOH将pH调节到11并煮沸10分钟制备培养基。通过过滤去除沉淀物，并再次调整pH到5.5，通过在121℃高压灭菌15分钟来对所述培养基进行灭菌。
在液体PP1培养基中生长后，发现所述菌株在pH 3.5和5.5都显示肌醇六磷酸酶活性(如在实施例1中所述测试)。在3.5和5.5的活性的比率是约1.3。还在P1-29的细胞和培养物上清液中分别测量活性。根据这些测量，大部分肌醇六磷酸酶活性为在细胞培养上清液中发现的细胞结合的10-20％活性。
所述菌株保藏于NCIMB，登录号为No 41248。
实施例3.从菌株P1-29中分离染色体DNA基本上用标准方法(Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，1996)来制备染色体DNA。将250ml在LB培养基中30℃过夜培养的培养物在10,000rpm离心30分钟，用20ml的50mM tris-HCl，5mM EDTA pH 8洗涤，并重悬于10ml的冷TES(50mMtris-HCl，5mM EDTA，15％葡萄糖pH 8)中。加入溶菌酶至10mg/ml，并在37℃温育细胞混悬液30-60分钟，直到裂解发生，所述裂解通过将100μl的反应混合物稀释到1ml的1％SDS中并检查“粘液(slimy)”稠度进行确定。在此时，分别将SDS和蛋白酶K(Sigma)加入到终浓度1％和0.5mg/ml。将反应混合物在56℃温育30分钟，随后加入2ml的5M NaCl和1.4ml的10％十六烷基三甲基溴化铵(Sigma)。在65℃持续温育15分钟。用氯仿/异戊醇(24∶1)提取溶液1次，并用苯酚/氯仿提取一次。提取后，将水相与0.6体积的异丙醇混合，通过离心(10,000rpm，15min)收集DNA沉淀，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬在2ml的10mM tris-HCl，1mM EDTA pH 8，5μg/ml RNA酶中。
实施例4.细菌菌株P1-29的分类学鉴定使用引物536f(CAGCMGCCGCGGTAATWC)和1392r(ACGGGCGGTGTGTRC)，(Lane，D.J.In Nucleic acid techniques inbacterial systematics，Stackbrandt，E.和Goodfellow，M.eds，John Wiley &Sons，New Yorkpp 115-117(1991))，用Taq DNA聚合酶(Roche)通过聚合酶链式反应(PCR)来扩增菌株P1-29的16S rRNA基因片段。使用下列程序1)在95℃进行5分钟的初始DNA变性步骤；2)在94℃1分钟，在55℃1分钟，在72℃1分钟，进行30个循环；3)在70℃进行最终的延伸步骤10分钟。在0.8％琼脂糖凝胶中通过电泳纯化PCR产物，所述产物约900碱基对大小，并根据生产商的说明书，使用凝胶纯化试剂盒(Qiagen)，将其从凝胶中提取出来。通过Medprobe(Norway)的商业服务对纯化的PCR产物进行测序。所测序的区域列于SEQ ID No 1。将该序列与在GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)中的DNA序列进行比较。发现该序列与来自几个布丘氏菌属菌株，如B.izardii DSM 9397，B.gaviniaeDSM 9393和B.noackiae ATCC 51607T的16S RNA基因的序列最为匹配(691个核苷酸中的688-689，99.6-99.7％)。因此，可以在分类学上将菌株P1-29分类为布丘氏菌属。
实施例5.从布丘氏菌属P1-29中克隆肌醇六磷酸酶基因将布丘氏菌属菌株P1-29的染色体DNA用限制性核酸内切酶Sau3A部分消化，并将所述消化产物在1％琼脂糖凝胶上进行分级。使用凝胶纯化试剂盒(Qiagen)从凝胶上分离3-5kb的DNA片段，并将其与BamHI消化的去磷酸化的λ-ZAP臂(Stratagene)连接起来。随后的文库构建步骤按照Stratagene的ZAP Express预消化的载体/Gigapack克隆试剂盒的说明书进行。将文库的噬菌体形式通过生产商(Stratagene)所述的“大量切除”(“massexcision”)方法转化为质粒形式。通过与早期公开的在培养皿上检测肌醇六磷酸酶活性的方法(Howson和Davis.Enzyme Microb.Technol.5，377-382(1983)；Chen J.C.Biotechnology techniques 12(10)751-761(1998)；RiccioMX.等，J.Appl.Microbiol.82，177-185(1997))类似的方法来进行质粒文库的筛选。通过亚克隆来分离并纯化数个肌醇六磷酸酶阳性克隆。将这些分离物培养在液体培养物(LB培养基，在30℃和200rpm约24小时)中并在得到的细胞混悬液中测量肌醇六磷酸酶活性(实施例1)。选择具有最高肌醇六磷酸酶活性(在pH 3.5约1.2U/ml)的一个克隆进行随后的表征。将分离自该克隆的质粒DNA命名为pBK(P1-29)，并通过插入DNA的部分DNA测序进行表征(测序服务获自Medprobe(Norway)。将包含肌醇六磷酸酶基因的这一序列列在SEQ ID No2中。布丘氏菌属肌醇六磷酸酶的推导氨基酸序列列为SEQ ID No3。使用由NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)提供的BLAST服务对SEQ ID No3与GenBank中序列进行比较，该比较鉴定了来自变形肥杆菌(Obesumbacteriumproteus)(GenBank登录号No AAQ90419)的肌醇六磷酸酶是布丘氏菌属P1-29肌醇六磷酸酶的最接近的已知同源物。然而，同源性水平很低—在两种蛋白质中仅有约74％的氨基酸残基是相同的。
实施例6.来自布丘氏菌属P1-29的肌醇六磷酸酶基因的扩增和表达通过PCR扩增肌醇六磷酸酶基因。将菌株布丘氏菌属P1-29的染色体DNA用作模板，并将寡核苷酸o29-5(GGAATTCATATGACGATCTCTGCGTTTAAC)和o29-3(GGAATTCGGATCCTTA-CTGTAGCTGGCAGCCTG)用作引物。使用Expand High Fidelity PCR系统试剂盒(Roche)进行扩增。使用下列程序1)在94℃进行初始DNA变性3分钟；2)在94℃45秒，在55℃45秒，在68℃1分钟，在72℃1分钟，在74℃1分钟，进行35个循环；3)在72℃进行最终的延伸步骤10分钟。将得到的PCR产物通过在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳，随后使用凝胶纯化试剂盒(Qiagen)从凝胶上提取DNA来进行纯化。用限制性酶NdeI和BamHI来消化纯化的PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(Qiagen)将其从反应混合物中分离。将载体质粒pET11a(Novagen)用限制性核酸内切酶NdeI和BamHI进行消化，使用虾碱性磷酸酶(Roche)进行去磷酸化，并在0.8％琼脂糖凝胶上通过电泳纯化。从凝胶上切下线性化的质粒DNA条带，使用凝胶纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。使用T4DNA连接酶(Roche)连接两段纯化的DNA片段。将连接反应物用70％乙醇沉淀，用乙醇洗涤，并直接重悬在50μl的电感受态大肠杆菌XL1-Blue MRF’细胞中。将所述混悬液转移到0.1cm的电穿孔杯(BioRad)中，并使用GenePulser Xcell(BioRad)装置，在1800V、25μF和200Ω进行电穿孔。电穿孔后立即加入1ml的LB培养基，将细胞混悬液转移到15ml的塑料管(Falcon)中并在37℃温育，摇动(200rpm)1小时。将转化的细胞在包含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上铺板，并在37℃过夜温育。将24个转化子培养在液体培养物中，并使用该培养物测试肌醇六磷酸酶的活性和质粒DNA的分离。选择产生最高肌醇六磷酸酶活性和产生预期限制图谱的质粒DNA的一个克隆。将由该克隆包含的、命名为pET11(P1-29)的质粒用于转化表达宿主菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)。将转化的细胞混悬液在包含2％的葡萄糖的LB中，于37℃摇动1小时，并将其接种到包含氨苄青霉素(100μg/ml)和葡萄糖(2％)的50ml的LB中，在30℃，摇动(200rpm)过夜培养。在600nm测量得到的培养物的OD，并使用所述培养物接种1升的LB+氨苄青霉素(100μg/ml)到OD600为0.04。继续在30℃培养过夜。在这样的培养物中的肌醇六磷酸酶活性典型地是8-12U/ml。约40g％的肌醇六磷酸酶活分泌到培养基中，而剩余的保持与细胞关联。这些观察结果显示布丘氏菌属P1-29肌醇六磷酸酶在大肠杆菌中的分泌在一定程度上比在其天然宿主中更有效。在相同的条件下培养的、用pET11转化的对照菌株BL21(DE3)pLysS的培养物中的活性低于0.05U/ml。
实施例7.来自布丘氏菌属P1-29的重组肌醇六磷酸酶的纯化将用pET11(P1-29)转化的BL21(DE3)pLysS的培养物进行离心以去除细菌细胞，使用旋转式汽化器将其浓缩到起始体积的约1/10并针对水进行透析直到溶液的传导性减少到低于250μS/cm。用tris碱将溶液的pH调节到8.0，并将其上样到以25mM tris-HCl，pH 8.0平衡的DEAE SepharoseFast Flow(Amersham Biosciences)的柱(3×20cm)上。用平衡缓冲液以3ml/min的流速洗涤所述柱30分钟，随后用在25mM tris-HCl，pH 8.0中的三个连续梯度的NaCl0-50mM，50-150mM和150-500mM进行洗脱。三个梯度的每个梯度设置为进行1小时，流速恒定为3ml/min。收集9ml的级分并测试肌醇六磷酸酶活性。检测到一个强的活性峰。使用Centriplusconcentrators(Amicon)来浓缩在峰级分中的蛋白质，并通过使用12％凝胶和标准的Laemmli缓冲液系统用SDS PAGE进行分析。这种分析的结果显示通过DEAE Sepharose获得的重组布丘氏菌属P1-29肌醇六磷酸酶的制备物包含单一显著的蛋白质组分。基于凝胶的数字图像的扫描(图1)进行的半定量分析显示纯度约65％。
实施例8.来自布丘氏菌属P1-29的重组肌醇六磷酸酶的pH谱在实施例1中所述的缓冲液和条件下，研究布丘氏菌属P1-29肌醇六磷酸酶(按照实施例7纯化)的活性对pH的依赖性。所述酶在广泛的pH区域(2-5.5)具有活性，其中在约pH 4.5具有最大值，并且在约pH3具有曲线的强“肩峰”(图2)。
实施例9.来自布丘氏菌属P1-29的重组肌醇六磷酸酶的底物特异性通过离子交换层析从用真菌肌醇六磷酸酶(Natuphos)处理的肌醇六磷酸的部分水解产物分离肌醇磷酸酯级分，所述肌醇磷酸酯每个肌醇残基包含三个、四个或五个磷酸酯。这些制备物的产生和纯化是BioChemis Ltd(St.Petersburg，Russia)提供的商业服务。通过HPLC判断(SandbergA.S.，Ahderinne R.J.Food Sci.51(3)，547-550)具有的不同磷酸化程度的肌醇磷酸酯的每个级分的污染少于5％。将商购果糖1，6-二磷酸和果糖6-磷酸(Sigma)用作模型底物来用于评估布丘氏菌属P1-29肌醇六磷酸酶对二磷酸酯和单磷酸酯底物的特异性。使用最终反应混合物中2mM浓度的底物，在pH 3.5，通过标准测试法(实施例1)测量按照实施例7纯化的布丘氏菌属肌醇六磷酸酶对不同底物的活性。结果(图3)显示所述酶具有极其广泛的底物特异性。其针对五磷酸酯、四磷酸酯和三磷酸酯的活性基本上等于或稍微高于将肌醇六磷酸作为底物时的活性。甚至果糖1，6-二磷酸(其对于大部分肌醇六磷酸酶是相当差的底物)也被布丘氏菌属肌醇六磷酸酶(尤其是P1-29来源的肌醇六磷酸酶)有效地水解。也可检测到果糖6-磷酸的水解，虽然其效率比其他受检测底物的水解低得多。
实施例10.来自布丘氏菌属P1-29的重组肌醇六磷酸酶的比活使用按照实施例7的纯化制备物来评估布丘氏菌属P1-29肌醇六磷酸酶的比活。根据实施例1在pH 3.5测量肌醇六磷酸酶活性。通过用BCA蛋白质测试试剂盒(Pierce)测量总蛋白质浓度并通过用SDS PAGE估计的肌醇六磷酸酶含量(实施例7)对其进行校正来计算肌醇六磷酸酶浓度。按照这些测量，来自布丘氏菌属P1-29的重组肌醇六磷酸酶的比活在37℃为约300U/mg。
实施例11.肌醇六磷酸酶变体的产生和表征使用如上列出的诱变方法，诸如在Morinaga等中公开的方法(Biotechnology(1984)2，p646-649)，或在Nelson和Long(AnalyticalBiochemistry(1989)，180，p 147-151)中公开的方法，或在WO 92/18645中所述的错误阈值(Error Threshold)诱变方法，通过序列SEQ ID No.2的诱变构建肌醇六磷酸酶变体。用于诱变PCR的其他合适的方法由Cadwell和Joyce(PCR Methods Appl.3(1994)，136-140)公开。
在一种或多种下列表达宿主中异源表达后，对肌醇六磷酸酶变体进行表征大肠杆菌K12；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
肌醇六磷酸酶变体源自SEQ ID No 3，其在一个或多个氨基酸位点存在不同，包括两个位点，三个位点，四个位点，五个位点，六个位点，七个位点，八个位点，九个位点，十个位点，十一个位点，十二个位点。其中如此处所述进行合适的反复诱变循环。
肌醇六磷酸酶变体的表征1.热稳定性通过酶的失活温度对所述变体的热稳定性进行表征。通过测量在不同的温度下温育10分钟，并随后冷却到室温后肌醇六磷酸酶的残留活性来测定失活温度。失活温度是这样的温度，在所述温度下，残余的活性是在相同的条件下在室温温育相同时间后的残留活性的50％。当适合时，通过从测量的活性数据进行内推和外推法来确定相应于50％残留活性的温度。通过将两种酶的失活温度彼此扣除来计算以℃表示的热稳定性的差异。
表1列出了不同变体的热稳定性差异表1来自以Seq ID No 3所示的亲本肌醇六磷酸酶的变体的热稳定性差异(TD)
2.其它特征其它特征也被改良。
使用如上所述的测试法来比较选定变体的热稳定性、比活和胃蛋白酶稳定性。通过与对照条件相比，在胃蛋白酶温育后，在pH 3.5，37℃测量的残留活性来表征这些变体的胃蛋白酶稳定性(残留活性＝在胃蛋白酶温育后的活性/在对照条件下温育后的活性)。在pH 2.0，0.25mg/ml胃蛋白酶，1mM CaCl2和5mg/ml BSA于37℃进行胃蛋白酶温育2小时。对照条件是在pH 5.0，1mM CaCl2和5mg/ml BSA，在37℃2小时。
表2显示选定变体的性质(来自根据Seq ID No.3的野生型肌醇六磷酸酶并与其比较)表2来自以Seq ID No.3所示的亲本肌醇六磷酸酶的变体的胃蛋白酶稳定性
表3来自以Seq ID No.3所示的亲本肌醇六磷酸酶的变体的比活
将在上述说明书中提及的所有的出版物，和在所述出版物中引用的文献都并入本文作为参考。本发明所述方法和系统的各种改进和变化对于本领域技术人员而言是显而易见的，而不背离本发明的范围和精神。尽管本发明已经结合具体的优选实施方案进行描述，应该理解的是要求保护的本发明不应该被局限于这些具体的实施方案。实际上，对于分子生物学或相关领域中的那些技术人员显而易见的用来进行本发明的所述模式的各种改进意图包含在下述权利要求的范围内。
序列表SEQ ID No1ACTACGACGCACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTTGTATGCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAGTTTATCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGGCCGAACCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCACAGTTCCCGAAGGCACTAAGGCATCTCTGCCAAATTCTGTGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGACTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACTCCTCAAGGGAACAACCTCCAAGTCGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCTAGCCTGCCAGTTTCGAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGSEQ ID No 2TTTCACATAGCAAACAACAACGAGACGAACTCGACGTTACCGCTTTGCTTCTGGAGTATATTTATCAGACTCAAACACCCCAAAGAAAAGAGGCTGTAAATGACGATCTCTGCGTTTAACCGCAAAAAACTGACGCTTCACCCTGGTCTGTTCGTAGCACTGAGCGCCATATTTTCATTAGGCTCTACGGCCTATGCCAACGACACTCCCGCTTCAGGCTACCAGGTTGAGAAAGTGGTAATACTCAGCCGCCACGGGGTGCGAGCACCAACCAAAATGACACAGACCATGCGCGACGTAACACCTAATACCTGGCCCGAATGGCCAGTAAAATTGGGTTATATCACGCCACGCGGTGAGCATCTGATTAGCCTGATGGGCGGGTTTTATCGCCAGAAGTTTCAACAACAGGGCATTTTATCGCAGGGCAGTTGCCCCACACCAAACTCAATTTATGTCTGGGCAGACGTTGATCAGCGCACGCTTAAAACTGGCGAAGCTTTCCTGGCAGGGCTTGCTCCGGAATGTCATTTAACTATTCACCACCAGCAGGACATCAAAAAAGCCGATCCGCTGTTCCATCCGGTGAAAGCGGGCACCTGTTCAATGGATAAAACTCAGGTCCAACAGGCCGTTGAAAAAGAAGCTCAAACCCCCATTGATAATCTGAATCAGCACTATATTCCCTTTCTGGCCTTGA
TGAATACGACCCTCAACTTTTCGACGTCGGCCTGGTGTCAGAAACACAGCGCGGATAAAAGCTGTGATTTAGGGCTATCCATGCCGAGCAAGCTGTCGATAAAAGATAATGGCAACAAAGTCGCTCTCGACGGGGCCATTGGCCTTTCGTCTACGCTTGCTGAAATTTTCCTGCTGGAATATGCGCAAGGGATGCCGCAAGCGGCGTGGGGGAATATTCATTCAGAGCAAGAGTGGGCGTCGCTACTGAAACTGCATAACGTCCAGTTTGATTTGATGGCACGCACGCCTTATATCGCCAGACATAACGGCACGCCTTTATTGCAGGCCATCAGCAACGCGCTGAACCCGAATGCCACCGAAAGCAAACTGCCTGATATCTCACCTGACAATAAGATCCTGTTTATTGCCGGACACGATACCAATATTGCCAATATCGCAGGCATGCTCAACATGCGCTGGACGCTACCTGGGCAACCCGATAACACCCCTCCGGGCGGCGCTTTAGTCTTTGAGCGTTTGGCCGATAAGTCAGGGAAACAATATGTTAGCGTGAGCATGGTGTATCAGACTCTCGAGCAGTTGCGCTCCCAAACACCACTTAGCCTTAATCAACCTGCGGGAAGCGTACAGCTAAAAATTCCTGGCTGTAACGATCAGACGGCTGAAGGATACTGCCCGCTGTCGACGTTCACTCGCGTGGTTAGCCAAAGCGTGGAACCAGGCTGCCAGCTACAGTAAATATCAGACAAAAAAAATGCCGCTCGCGATTAAGCGAACGGCATTACTTCCTAGCTTCCCAGCTCGGATTAGCATGGCGAGAGCCGAAAAACTTSEQ ID No3MTISAFNRKKLTLHPGLFVALSAIFSLGSTAYANDTPASGYQVEKVVILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGGFYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSIYVWADVDQRTLKTGEAFLAGLAPECHLTIHHQQDIKKADPLFHPVKAGTCSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPFLALMNTTLNFSTSAWCQKHSADKSCDLGLSMPSKLSIKDNGNKVALDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWASLLKLHNVQFDLMARTPYIARHNGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLNMRWTLPGQPDNTPPGGALVFERLADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRVVSQSVEPGCQLQ
权利要求
1.一种多肽，其包含对应于布丘氏菌属肌醇六磷酸酶或其修饰形式、同源多肽、变体、功能等同物或有效片段的氨基酸序列。
2.权利要求1的多肽，其包含如SEQ ID NO3中所示的氨基酸序列或与其具有至少75％同一性(同源性)，优选具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性(同源性)的序列或其功能片段。
3.权利要求1或2的多肽，其中所述多肽为分离的和/或纯化的。
4.权利要求1-3的多肽，其中所述多肽显示肌醇六磷酸酶活性。
5.权利要求1-4的多肽，其特征在于它可获自、优选源自以登录号NCIMB 41248保藏的布丘氏菌属菌株P1-29。
6.权利要求4或5的多肽或其功能等同物，其特征在于所述肌醇六磷酸酶具有至少100，更优选至少200，最优选至少300U/mg的比活，其中所述比活通过将所述肌醇六磷酸酶在溶液中在37℃的温度温育而测定，所述溶液包含溶于200mM醋酸钠缓冲液、pH4.5中的2mM肌醇六磷酸、0.8mMCaCl2。
7.权利要求4-6的多肽或其功能等同物，其特征在于所述肌醇六磷酸酶在约pH3-6，优选约pH4-5，最优选约pH4.5具有活性最大值，其中所述活性通过将所述肌醇六磷酸酶在溶液中在37℃的温度温育而测定，所述溶液包含溶于200mM醋酸钠缓冲液中的2mM肌醇六磷酸、0.8mM CaCl2。
8.权利要求1至7中任一项的多肽，其在至少一个下列位点(根据SEQID No.3中的编号方法进行编号)包含突变59、70、122、125、167、193、197、204、209、211、221、223、225、240、242、244、268、281、289、294、303、336或351。
9.权利要求8的多肽，其中所述肌醇六磷酸酶包括一个或多个下列突变K59A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或T70A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或Y；或A122C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或D125A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或T167A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或Y；或H193A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或F197A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或T204A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或Y；或T209A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或Y；或A211C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或G221A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或I223A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或S225A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；或K240A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或A242C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或D244A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或A268C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或L281A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y；或A294C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或N303A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或I336A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或N351A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y。
10.权利要求8或9的多肽/肌醇六磷酸酶，其包括选自下组的至少一个突变K59E；T167V；K240T；T167I；K240E；D244C；Q289Y；T209K或F197S。
11.权利要求8至10的多肽/肌醇六磷酸酶，其包括选自下组的突变组合D125E/H193R；或A294E/N303K；或T167I/K240T；或D223E/K240E/N351D；或T167I/K240T/A294E/N303K；或T167I/K240E/A242S/A294E/N303K；或A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A294E/N303K；或A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K；或A122T/D125E/H193R/F197S/T209K/A211P/S221N/G225A/K240E/A294E/N303K；或D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K；或A122T/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K/I336F或N70Y/D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K。
12.权利要求8至11的多肽/肌醇六磷酸酶，其中所述分离的多肽或肌醇六磷酸酶为改良的肌醇六磷酸酶变体，其与亲本肌醇六磷酸酶相比具有选自以下的一个或多个改良的特性i.更高的热稳定性和/或ii.比活和/或iii.蛋白水解稳定性。
13.选自以下的分离的核酸分子i)编码权利要求1至12任一项的肌醇六磷酸酶的分离的核酸分子；ii)核酸，其在中等严谨度条件下，优选高或很高的严谨度条件下与编码SEQ ID No.3的多肽或其同源物的核酸杂交；iii)分离的核酸分子，其包括SEQ ID NO2所示的序列或其同源物；iv)核酸，其在中等严谨度条件下，优选高或很高的严谨度条件下与SEQ ID No.2或其互补序列杂交。
14.权利要求13的分离的核酸分子，其编码多肽，所述多肽包括如SEQID NO3所示的氨基酸序列或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性(同源性)的序列或其有效片段。
15.权利要求13或14的分离的核酸分子，其包括核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO.2相同或互补或包含SEQ ID NO.2的任何密码子的任何合适的密码子取代或包括与SEQ ID NO.2具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的序列。
16.权利要求13至15的分离的核酸分子，其中所述核酸分子编码权利要求8至12的多肽。
17.质粒或载体系统，其包括权利要求13至16的核苷酸。
18.权利要求17的质粒或载体系统，其中所述质粒或载体系统为微生物中用于表达权利要求1至12的任一种酶的表达载体，和/或包括权利要求13至16的多核苷酸。
19.用权利要求17或18任一项的质粒或载体系统转化或转染的宿主细胞。
20.权利要求19的宿主细胞，其包含肌醇六磷酸酶，所述肌醇六磷酸酶包含如SEQ ID NO3所示的氨基酸序列或其功能片段，或与其至少75％同源的同源多肽序列。
21.权利要求19或20的宿主细胞，其中所述宿主细胞源自于微生物，所述微生物包括细菌，如枯草芽孢杆菌、大肠杆菌，和真菌，其包括酵母，如多形汉森氏酵母、粟酒裂殖酵母、酿酒酵母，以及丝状真菌，如木霉属和曲霉属，如米曲霉。
22.权利要求21的宿主细胞，其中所述微生物为原核细菌细胞，优选大肠杆菌。
23.细菌细胞菌株布丘氏菌属P1-29，以登录号NCIMB 41248保藏。
24.产生多肽的方法，其包括在宿主细胞中表达权利要求1至12的氨基酸序列和/或表达权利要求13至16的多核苷酸，并且从宿主细胞培养基分离所述肌醇六磷酸酶。
25.生产食品或动物饲料的方法，其包含向所述食品或动物饲料上喷洒液体形式的权利要求1-12任一项的多肽的步骤。
26.生产食品或动物饲料的方法，其包含将作为干燥产品的权利要求1-12任一项的多肽与所述食品或动物饲料混合的步骤。
27.权利要求1至12任一项的肌醇六磷酸酶在食物或动物饲料中的用途。
28.食物或动物饲料组合物，其包括i)权利要求1至12任一项的肌醇六磷酸酶，和/或ii)通过权利要求25或26的方法产生的动物饲料。
29.制备肌醇六磷酸酶变体的方法，所述方法包括下列连续的步骤a)选择至少一种亲本肌醇六磷酸酶，其中所述至少一种亲本肌醇六磷酸酶选自i)权利要求1-12的多肽和/或ii)至少一种肌醇六磷酸酶变体；b)通过在所述亲本肌醇六磷酸酶中引入所述亲本肌醇六磷酸酶的至少一种变化，以获得至少一种肌醇六磷酸酶变体，所述变化是氨基酸残基的插入、缺失或取代或其组合；c)筛选所述至少一种肌醇六磷酸酶变体以鉴定改良的肌醇六磷酸酶变体，所述肌醇六磷酸酶变体与亲本肌醇六磷酸酶相比具有选自以下的一种或多种改良的特性i.更高的热稳定性和/或ii.比活和/或iii.蛋白水解稳定性和/或d)制备所述改良的肌醇六磷酸酶变体，优选以产生分离和/或纯化的肌醇六磷酸酶变体。
30.权利要求29的方法，其中在步骤b)期间产生肌醇六磷酸酶变体的群体，以及在步骤c)中筛选至少一部分所述肌醇六磷酸酶变体的群体。
31.权利要求29或30的方法，其中步骤a)包括将编码亲本肌醇六磷酸酶的权利要求11至13的核苷酸序列进行诱变，并且步骤b)包括在宿主细胞中表达步骤(a)中获得的突变的核苷酸序列，且步骤c)包括针对宿主细胞或其一种或多种提取物筛选具有所述一个或多个改良特性的改良的肌醇六磷酸酶变体。
32.权利要求29至31的方法，其在步骤c)和任选的d)后，进一步包括随后的至少一轮重复步骤a)至c)和可选择的d)的步骤，其中优选在所述随后的一轮或多轮中，从根据权利要求29至31的方法制备的所述至少一种肌醇六磷酸酶变体和/或改良的肌醇六磷酸酶变体中选择步骤a)的至少一种亲本肌醇六磷酸酶。
33.权利要求29至32的方法，其中步骤c)包括筛选表达改良的肌醇六磷酸酶变体的宿主细胞，该肌醇六磷酸酶变体与i)所述亲本肌醇六磷酸酶和/或ii)包括SEQ ID No 3的多肽相比，具有至少2.5的热稳定性差异。
34.权利要求29至33的方法，其中步骤c)包括筛选表达改良的肌醇六磷酸酶变体的宿主细胞，该肌醇六磷酸酶变体与i)所述亲本肌醇六磷酸酶和/或ii)包括SEQ ID No 3的多肽相比，具有至少30的胃蛋白酶稳定性。
35.权利要求29至34的方法，其中步骤c)包括筛选表达改良的肌醇六磷酸酶变体的宿主细胞，该肌醇六磷酸酶变体与i)所述亲本肌醇六磷酸酶和/或ii)包括SEQ ID No 3的多肽相比，具有当与由SEQ ID No 3编码的肌醇六磷酸酶相比时至少110的比活比率。
36.根据权利要求29至35的方法制备的改良的肌醇六磷酸酶变体。
37.多核酸构建体，优选DNA构建体，其包括编码权利要求16或权利要求36任一项的改良的肌醇六磷酸酶变体的多核酸序列。
38.重组表达载体，其包括权利要求37的多核酸构建体。
39.宿主细胞，其用权利要求37的DNA多核酸和/或权利要求38的载体转化。
40.产生改良的肌醇六磷酸酶变体的方法，其包括在允许表达所述改良的肌醇六磷酸酶变体的条件下培养权利要求39的宿主细胞。
41.饲料或食物组合物，其包括至少一种权利要求8至12或36任一项的改良的肌醇六磷酸酶变体，或权利要求38的宿主细胞，其中所述食物或饲料组合物优选根据权利要求25或26的方法制备。
全文摘要
本发明涉及酶和方法。尤其描述了用编码细菌肌醇六磷酸酶和其变体的核酸转化或转染的宿主细胞。
文档编号C12N1/20GK101052715SQ200580035619
公开日2007年10月10日 申请日期2005年10月17日 优先权日2004年10月18日
发明者安德烈·米亚斯尼科夫, 维杰伊·库玛, 奥利弗·肯施, 克劳斯·佩伦加尔, 伯吉塔·勒思纳, 乌尔里克·凯特林, 安德烈·科尔特曼 申请人:丹尼斯科公司