专利名称：酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的参与控制植物生长的酶，编码该酶的DNA序列，以及编码该酶的核苷酸序列在生产生长特征有所改进或改变的转基因植物中的应用。
赤霉素(GA)是一大类存在于所有高等植物和一些真菌中的二萜类羧酸。这类物质中的某些成分发挥植物激素的功能，参与某些发育过程，包括种子萌发、茎伸长、叶扩展、花的发生和发展、以及种子和果实的生长。生物活性GA通常是19碳化合物，含有一个19-10内酯、一个C-7羧酸和一个3β-羟基。其生物合成的后一阶段涉及C-20的氧化去除和C-3的羟基化。2β位的羟基化产生无生物活性的产物。该反应是植物中GA代谢的最重要途径，它确保活性激素不在植物组织中累积。GA的生物合成酶7-氧化酶、20-氧化酶、3β-羟化酶和2β-羟化酶均是2-酮戊二酸-依赖性双加氧酶。它们是一大类以2-酮戊二酸作为共底物的酶，反应的一部分是所述底物被脱羧化成为琥珀酸(参见Hedden,P.和Kamiya,Y.,的综述，“植物生理和植物分子生物学年度综述(Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.)”48 431-460(1997))。
植物生长的化学调节剂应用于园艺和农业已有很多年。这些化合物中的一些功能在于改变植物组织中的GA浓度。例如，生长延缓剂抑制参与GA生物合成的酶的活性，由此降低GA浓度。这些化学物质应用很普遍，例如，防止谷类倒伏，控制观赏植物和园艺植物生长。相反地，GA可以应用于植物，例如GA3应用于无子葡萄，以改善果实的大小和形状。GA4和GA7的混合物应用于苹果改进果实的质量，应用于某些松类植物刺激松果形成。应用生长调节剂存在几个问题。一些生长延缓剂在土壤中高度残留，使这样的土壤在被处理作物之后很难生长其它作物。其它生长调节剂需要反复应用，以维持所需的作用。很难将应用限制到目标植物器官，而不扩散到其它器官或植物，和不产生不期望的作用。生长调节剂应用的精确靶向需要花费大量劳动。因此，非常期望一种非化学物质来控制植物形态。
发育中的种子通常含有GA，以及相对较大量的GA-生物合成酶。红花菜豆(多花菜豆，Phaseolus coccineus)的成熟种子含有极高浓度的2β-羟基GA,GA8，作为其糖甙，说明一定存在高水平的2β-羟化酶活性。这在相关品种的菜豆(Phaseolus vulgaris)中得到确证，其中在种子完全成熟之前不久，GA2β-羟化酶活性迅速增加(Albone等，Planta 177 108-115(1989))。2β-羟化酶已经从豌豆(Pisumsativum)(Smith,V.A.和MacMillan,J.,Planta 167 9-18(1983))和菜豆(Griggs等，植物化学(Phytochemistry)30 2507-2512(1991)和Smith,V.A.和MacMillan,J.,植物生长调节杂志(J.Plant GrowthRegul.)2251-264(1984))的子叶中部分纯化出来。这些研究表明，对于这两种来源都显然存在至少两种不同底物特异性的酶。通过阳离子交换色谱和凝胶过滤从吸液膨胀的菜豆的子叶中分离出两种活性物质。主要活性物质，是一种相当于通过尺寸排阻HPLC测得分子量为26,000的酶，优选底物是羟化的GA1和GA4,GA9和GA20不太优选，而GA9是第二种酶(Mr 42,000)的优选底物。然而，试图纯化酶活性物质以获得用于氨基酸测序的N-末端构型已经证明是不可能的，因为该酶在植物组织中相对于其它蛋白质丰度很低，而且一种污染物，植物凝集素与酶活性物质共同纯化出来，使N-端氨基酸测序是不可能的。
Ross等报道，利用sln(纤细(slender))突变在豌豆(Pisumsativum，也称garden pea)中检查了赤霉素失活的调控(植物杂志(The Plant Journal)7(3)513-523(1995))。sln突变阻断了GA20(生物活性GA1的前体)的失活。这些研究结果表明sin基因可能是控制参与GA失活的两种独立结构基因表达的调控基因，所述的GA失活也就是GA20经C-2位的2β-羟化，氧化为GA29，然后羟基进一步氧化为酮(GA29到GA29-分解代谢物(catabolite))。在豌豆子中GA29到GA29-代谢物的转化被前己二酮钙(prohexadione-calcium)抑制，前己二酮钙是2-酮戊二酸-依赖性双加氧酶的一种抑制剂(Nakayama等，植物细胞生理学(Plant Cell Physiol.)31 1183-1190(1990))，表明该反应被这种类型的酶催化。虽然发现豌豆中的纤细(sln)突变可以阻断种子中GA20转化为GA29以及GA29转化为GA29-分解代谢物，但未标记的GA20不能抑制放射性标记的GA29的氧化，反之亦然，表明上述步骤由不同的酶催化。而且，在芽组织中，纤细突变抑制GA20的2β-羟化，但不抑制形成GA29-分解代谢物。这些观察形成了这样的理论，即存在两种不同的酶参与控制植物中GA失活的代谢途径(Hedden,P.和Kamiya,Y.,植物生理和植物分子生物学年度综述(Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.)48 431-460(1997))。
然而，现在令人惊奇地发现，事实上一种酶即可分解代谢这些不同的反应。本发明公开了编码GA 2β-羟化酶的cDNA的首次被报道的克隆，所述GA 2β-羟化酶作用于C19-GA，并且2β-羟化作用是其唯一羟化酶活性。来自南瓜子(pumpkin seed)的cDNA克隆编码一种具有2β-和3β-羟化酶活性的酶(Lange等，植物细胞(Plant Cell)91459-1467(1997))，但它的主要活性是3β-羟化作用，仅当底物是三羧酸(C20)时，它才作为2β-羟化酶；它不对C19-GA进行2β-羟化。因为本发明的新酶催化β-羟化，并催化C-2位取代的羟基进一步氧化为酮基，因此该酶被称为“GA2-氧化酶”。
按照本发明的第一方面，提供了一种编码赤霉素2-氧化酶的，分离、纯化或重组的核酸序列，它包括如
图1所示的核酸序列或其功能衍生物，或其互补链或其同源序列。
GA-生物合成基因的命名系统目前已有介绍(Coles等，植物杂志，17(5)547-556(1999))。在本申请中有关多花菜豆的赤霉素2-氧化酶基因的引用应当理解为也指PcGA2ox1。本申请中有关鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)的at-2bt3、at-2bt24、和T31E10.11的赤霉素2-氧化酶基因的引用应当理解为也分别指AtGA2ox1、AtGA2ox2、和AtGA2ox3。
本发明的编码赤霉素2-氧化酶(GA 2-氧化酶)的核酸序列是将GA，特别是C19-GA，包括生物活性GA例如GA1和GA4的C-2β位引入羟基的2-酮戊二酸-依赖性双加氧酶。它们也可以将2β-羟化GA进一步氧化为GA-代谢物，其在C-2具有酮基。这些代谢物的内酯桥也可以打开，产生一个C-19羧酸和一个C-10双键。2-氧化酶的活性导致生物活性GA的失活，或活性GA的生物合成前体转化为不能被转化成生物活性形式的产物。因此本发明的优选核酸序列编码能够通过在C-2β位引入一个羟基而氧化C19-赤霉素化合物的赤霉素2-氧化酶。该酶还可以将2β-羟基氧化为酮基。本发明的赤霉素2-氧化酶的优选底物是GA9、GA4、GA20和GA1。
在本发明中的上下文，氨基酸序列之间的同一性程度可以至少为40％、合适地为50％或更高，例如55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％。在核苷酸水平上，同一性程度可以至少为50％，合适地为60％或更高，例如65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％。按照本发明，一种同源序列因此可以具有上述序列同一性。可以用任何常规提供的方案确定序列同源性，例如利用来自Strasbourg大学的Clustal XTM和利用GenedocTM(Karl B.Nicholas)产生的同一性表。
与按照本发明第一方面的序列在严紧条件下杂交的核酸序列，或者若非遗传密码的简并性将与所述序列同源或在严紧条件下与其杂交的核酸序列，或者特异于任何所述序列的寡核苷酸序列，也包括在本杂交的严紧条件可以具有如下特征，即低盐浓度或高温度条件。例如，高度严紧条件可以定义为在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中在65℃与结合到固体支持物上的DNA杂交，在0.1xSSC/0.1％SDS中在68℃洗涤(Ausubel等，“分子生物学当前方案(Current Protocols in Molecular Biology)”1，页2.10.3,GreenPublishing Associates,Inc.和John Wiley & Sons,Inc.，出版，New york,(1989))。在某些情况下，可能需要低严紧度条件。如本申请中使用的，中度严紧条件可以定义为包括在0.2xSSC/0.1％SDS中在42℃洗涤(Ausubel等，(1989)，同上)。还可以加增加量的甲酰胺使杂交体的核酸双链不稳定，而使杂交更严紧。因此，特定的杂交条件能够容易地操作，通常将按照所需的结果选择。通常，在存在50％甲酰胺的情况下，对于与目的DNA具有95％-100％同源性的探针而言，适宜的杂交温度为42℃，对于90-95％的同源性为37℃，对于70-90％的同源性为32℃。
本发明的优选核酸序列的一个例子是编码具有多花菜豆赤霉素2-氧化酶活性的酶(例如，PcGA2ox1)，或蝶形花科(Fabaceae family)家族的另一成员的等效蛋白质。本发明的核酸序列还可以编码一种来自菜豆或来自鼠耳芥的赤霉素2-氧化酶(例如AtGA2ox1、AtGA2ox2、或AtGAox3)。
按照本发明这方面的其它核酸序列还可以包括，如前面定义的核酸序列，其中编码序列有效地连接于启动子。启动子可以是结构型的和/或在特定植物细胞或组织中特异性表达的，例如在根中应用烟草RB7(Yamamoto等，植物细胞，3 371-382(1991))；在绿色组织中应用番茄rbcS-3A(Ueda等，植物细胞，1 217-227(1989))；在分化细胞中应用玉米组蛋白H3(Brignon等，植物分子生物学，22 1007-1015(1993))或鼠耳芥属(Arabidopsis)CYC07(Ito等，植物分子生物学，24 863-878(1994)；在蔬菜分生组织中应用鼠耳芥属KNAT1(Lincoln等，植物细胞6 1859-1876(1994))；在导管组织中应用豆GRPl.8(Keller,B.,& Heierli,D.,植物分子生物学，26 747-756(1994))；在花中应用鼠耳芥属ACT11(Huang等，植物分子生物学33125-139(1997)或矮牵牛查耳酮合成酶(Bandermeer等，植物分子生物学，15 95-109(1990)；在雌蕊中应用土豆SK2(Ficker等，植物分子生物学，35 425-431(1997))；在花粉囊中应用芸苔TA29(Deblock,M.,& Debrouwer,D.,Planta 189 218-225(1993))；在果实中应用番茄聚半乳糖醛酸酶(Bird等，植物分子生物学11651-662(1988))。或者启动子可以来源于植物组织，例如，花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV)。适当的启动子序列可以包括来自植物品种的启动子序列，例如来自十字花科(Brassicaceae)的启动子序列。
因此本发明还扩展到一种分离、纯化或重组的核酸序列，其包括天然驱动赤霉素2-氧化酶的编码基因表达的启动子，包括图1所示的核酸序列或其功能衍生物，或其互补链，或其序列同源物。该赤霉素2-氧化酶可以是多花菜豆的(例如PcGA2ox1)或豆科植物家族另一成员的等效蛋白质。该核酸序列还可以编码来自菜豆或鼠耳芥的赤霉素2-氧化酶(例如AtGA2ox1、AtGA2ox2、或AtGA2ox3)。优选地，核酸序列包括一种驱动来自多花菜豆、菜豆或鼠耳芥的赤霉素2-氧化酶表达的启动子。该启动子序列包括图1所示序列的编码序列5’端天然存在的启动子。启动子还可以被选择用来组成性超量表达编码赤霉素2-氧化酶基因的核酸。可以使用由内部或外部因素，例如化学物质、植物激素、光或应力诱导的启动子。例如可由水杨酸诱导的与致病机理有关的基因，铜-操纵的基因表达(Mett等，美国国家科学院科学进展(Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA)90 4567-4571(1993))和四环素-调控的基因表达(Gatz等，植物杂志，2 397-404(1992))。可由赤霉素诱导的基因的例子是γ-TIP(Phillips,A.L.,& Huttly,A.K.,植物分子生物学24 603-615(1994))和GAST(Jacobsen,S.E.,&Olszewshi,N.E.,Planta 198 78-86(1996))。GA下调赤霉素20-氧化酶基因(Phillips等，植物生理学108 1049-1057(1995))，它们的连接于GA 2-氧化酶ORF的启动子也可以应用于本发明的这一方面。
由本发明的核酸序列编码的赤霉素2-氧化酶可以适当地催化C19-赤霉素分子的2β-氧化，在C-2位引入羟基，随后进一步氧化产生酮衍生物。
本发明的核酸序列还可以编码与植物细胞中正常存在的RNA反义的RNA，或者可以编码能够剪切植物细胞中正常存在的RNA的RNA。因此，本发明还提供了一种编码核酶的核酸序列，所述核酶能够特异地剪切由赤霉素2-氧化酶基因编码的RNA。该编码核酶的DNA通常将用于抑制赤霉素，尤其是C19-GA的失活。
按照本发明的核酸序列还可以进一步含有5’信号序列，以指导表达的蛋白质产物的表达。该信号序列还可以包括蛋白质导向序列，其能够指导表达的蛋白质到达表达该核酸序列的宿主细胞内部或外部的特定位置。或者，核酸序列还可以包括3’信号，例如聚腺苷酸化信号或其它调控信号。
因此本发明为农业提供了意义重大的便利，即提供核酸序列调控赤霉素植物激素的代谢。该调控可以是通过促进赤霉素2-氧化酶的作用抑制植物生长，还可以是通过赤霉素2-氧化酶防止赤霉素失活而促进植物生长。例如，1997年，英国约15％小麦倒伏，约30％大麦倒伏，估计损失达到￡100m栽培物。由于降低GA含量产生的矮壮茎抗-倒伏谷类的应用具有相当大的经济价值。
按照本发明的另一方面，提供了一种反义核酸序列，其包括一种与编码赤霉素2-氧化酶，例如来自多花菜豆、菜豆或鼠耳芥的赤霉素2-氧化酶，的基因中被天然转录的至少部分DNA链互补的DNA的可转录链。按照本发明优选的基因包括PcGA2ox1、AtGA2ox1、AtGA2ox2和AtGA2ox3。
一种更一般性原理的例子是上述反义核酸和核酶-编码的核酸按照本发明的进一步方面，提供了导致(例如通过其表达)选择性破坏赤霉素2-氧化酶基因的适当表达的DNA，或在优选实施方式中，多花菜豆基因PcGA2ox1。
按照本发明的另一方面，提供了一种分离的、纯化的或重组的多肽，包括赤霉素2-氧化酶，具有图2所示氨基酸序列。
按照本发明的重组DNA在形式上可以是一种载体。该载体可以是例如一种质粒、粘粒、噬菌体或人工染色体。载体将通常包括一种或多种可选择性标记，使可以选择含有它们的被转染的细胞(或被转化的这些术语在本说明书中可以互换使用)，优选地，能够选择携带整合异源DNA的载体的细胞。通常存在适当的“起始”或“终止”信号。另外，如果载体是用于表达的，则将存在足够的调控序列以促使表达；然而，本发明的DNA将通常在植物细胞中表达，因此微生物宿主表达将不属于本发明的主要目标，当然也不排除(例如在细菌或酵母菌宿主细胞)。不包括调控序列的载体可以用作克隆载体。
可以将克隆载体导入大肠杆菌(E.coli)或另一种有利于它们操作的适当宿主中。因此按照本发明的另一方面，提供了一种用上述核酸序列转染或转化的宿主细胞。本发明的进一步实施方式提供了一种通过GA 2-氧化酶cDNA在异源宿主例如大肠杆菌，酵母包括酿酒酵母，或用含重组DNA的杆状病毒感染的昆虫细胞中表达得到的酶。该酶可以用于生产2β-羟化GA和GA-分解代谢物或用于制备针对GA 2-氧化酶的抗体。宿主细胞还可以适当地为植物细胞培养中的植物细胞或愈伤组织的一部分。
可以通过任何常规方法制备本发明的核酸序列，包括连续核苷酸连接到一起，和/或寡-和/或多-核苷酸的连接，包括在无细胞的体外过程中，但重组DNA技术构成精选方法。
最后，本发明的核酸序列将通过任何适当方法导入植物细胞。按照本发明的再一方面，提供了一种包括本发明上述核酸序列的植物细胞。
优选地，本发明的核酸序列通过用二元载体pLARS120，pGPTV-Kan的改进形式(Becker等，植物分子生物学，20 1195-1197(1992)),其中β-葡糖醛酸酶报告基因被来自pBI220的花椰菜花叶病毒35s启动子取代(Jefferson,R.A.,植物分子生物学报告(Plant Mol.Biol.Rep.)5 387-405(1987))，转化导入植物细胞。然后通过电融合将该质粒导入根瘤农杆菌，然后可以经一个真空过滤程序转移到宿主细胞中。或者，可以通过本领域已知的方法，例如EP-A-0116718和EP-A-0270822中描述的方法，利用解除的(disarmed)Ti-质粒载体实现转化，和通过农杆菌进行转化。当农杆菌属无效时，可以用单独的放电装置将外源DNA直接导入植物细胞，例如转化单子叶植物。能够稳定地将核酸序列引入任何植物细胞的细胞核DNA或线粒体DNA中的任何其它方法也是适用的。包括那些还不能进行遗传转化的植物品种。
优选地，用于导入宿主细胞的本发明的核酸序列还含有第二嵌合基因(或“标记”基因)，其能够使含有外源DNA的转化植物容易地从不含外源DNA的其它植物中分辨出来。该标记基因的例子包括抗生素抗性(Herrera-Estrella等，EMBO J.2 987-995(1983))，除草剂抗性(EP-A-0242246)和葡糖醛酸酶(GUS)表达(EP-A-0344029)，标记基因的表达优选被第二启动子控制，其允许在所有发育期的细胞中表达，从而能够在植物再生的所有阶段确定标记基因的存在。
可以从一个转化植物细胞再生完整植物，因此本发明提供了含有上述本发明核酸序列的转基因植物(或其部分，例如繁殖材料，例如，原生质体、细胞、愈伤组织、组织、器官、种子、胚、胚珠、合子、块茎、根等)。在本发明中，应当注意术语“转基因”不应当限于指其种系中含有一个或多个来自另一物种基因的上述生物体，虽然一些这类生物体将含有该基因。而是该术语更广泛地指其种系已经作为重组DNA技术的技术介入主题的任何生物体。因此，例如，其胚系中一种内源基因被删除、复制、激活、或修饰的生物体与其种系中附加了一种外源DNA序列的生物体一样，也是作为本发明目标的转基因生物体。
植物的优选品种包括但不限于单子叶植物包括种子和其后代或繁殖体，例如黑麦草属、玉蜀黍属、小麦属、蜀黍属、Triticale、甘蔗属、雀麦属、燕麦属、大麦属、黑麦属、和狗尾草属。尤其有用的转基因植物是玉米、小麦、大麦植物和其种子。双子叶植物也在本发明范围内，优选的转基因植物包括但不限于蝶形花科(Fabaceae)、茄属、十字花科(Brassicaceae)，尤其是土豆、菜豆、卷心菜、森林树(foresttree)、玫瑰、铁线莲、油子芸苔、向日葵、菊花、猩猩木和金鱼草((snapdragon))。
可以通过如Sambrook等(分子克隆实验室手册，第二斑(1989))描述的Southern分析筛选存在特定DNA序列的植物细胞、组织和植物。还可以通过本领域已知技术——聚合酶链式反应(PCR)进行该筛选。
植物细胞的转化包括从没有被转化的细胞中分离转化细胞。这种分离或筛选的—种方便方法为将一种筛选标记基因引入到待插入转化细胞的材料中。结果是，仅那些成功转化的细胞才含有标记基因。然后标记基因的翻译产物赋于能够筛选的表型性状。通常，表型性状是在存在某些化学试剂、例如卡那霉素、G418、巴龙霉素等抗生素(它们被置于筛选培养基中)的情况下，能够生存的能力。赋于具备抗生素抗性的一些基因的例子包括例如，编码新霉素磷酸转移酶卡那霉素抗性(Belten等，EMBO J.3 2723-2730(1984))、潮霉素抗性(vanden Elzen等，植物分子生物学，5 299-392(1985))、来源于Tn5的卡那霉素抗性(NPT Ⅱ)基因(Bevan等，自然，304 184-187(1983)；Mcbride等，植物分子生物学，14(1990))和氯霉素乙酰转移酶的基因。Thompson等中描述的PAT基因(EMBO J.6 2519-2523(1987))可以用于赋予除草剂抗性。
主要用作组织培养中鉴定含遗传工程载体的植物细胞的可筛选标记基因的例子是编码形成产色产物的酶。一个例子是编码产生β-葡糖醛酸酶(GUS)的基因。该酶被广泛应用，其制备和应用在Jefferson中被描述(植物分子生物学报告，5 387-405(1987))。
当在筛选培养基上培养转化的植物细胞后，存活的细胞被筛选出来用于进一步研究和操作。筛选方法和材料是本领域技术人员已知的，可以筛选具有高度可预言性的存活细胞，被筛选出的细胞将是已经成功地被外源DNA转化的细胞。
当植物细胞或植物用例如，农杆菌属Ti-质粒转化后，Ti-质粒转化的、从而能够表达酶的植物细胞或植物能够通过适当的表型标记筛选出来。这些表型标记包括但不限于抗生素抗性。其它的表型标记是本领域已知的，可以用于本发明。
按照本领域已知的程序再生阳性克隆。随后评价转化植物是否存在所述特性和/或所需特性被表达的程度。第一种评价可以包括，例如，转化植物的细菌/真菌抗性水平，所需特性的稳定的遗传率，田间实验等。
下面方案通过说明和概述的方式阐述了一种典型方法，通过该方法可以制备转基因植物材料，包括完整植物。可以认为该方法涉及下面五个步骤
(1)首先从适当来源分离或通过已知方法合成一种编码表现GA2-氧化酶活性的蛋白质的DNA序列；(2)将所述DNA序列以5’到3’的方向有效地连接于本文前面描述的植物表达序列；(3)将步骤(2)的构建物通过已知方法转化到植物材料中，并在其中表达；(4)筛选按照步骤(3)处理的植物材料是否存在编码表现赤霉素2-氧化酶活性的蛋白质的DNA序列；和(5)任选地将步骤(3)的转化的植物材料再生成为一个完整植株。
因此本发明还包括转基因植物和其有性和/或无性后代，它们已经用本发明的重组DNA序列转化。可以通过任何已知常规方法从适当的前述方法制备的，或者从这些材料来源的繁殖材料进行植物的再生。
“转基因植物的无性或有性后代”的表达包括本发明定义的所有通过已知方法得到的突变体和变异体，例如细胞融合或突变体筛选，其仍然表现起始转化植物的特性，以及转化植物材料的所有杂交和融合产物。
本发明的另一个目的涉及转基因植物的繁殖材料。转基因植物的繁殖材料相对于本发明，定义为可以在体内或在体外有性繁殖的任何植物材料。在本发明范围内特别优选的是原生质体、细胞、愈伤组织、组织、器官、种子、胚、卵细胞、合子、以及从转基因植物得到的任何其它繁殖材料。
本发明的另一方面在于提供针对至少部分赤霉素2-氧化酶氨基酸序列的抗体。该抗体在筛选适当载体中的来源于植物组织RNA的cDNA文库方面是有用。
按照本发明赤霉素2-氧化酶基因用于转基因植物生长和发育过程的修饰。因此，本发明的另一个重要方面是其在制备转基因植物或种子中的应用，在所述转基因植物或种子中，赤霉素2-氧化酶组成性超量表达，以减少植物或种子中的生物活性赤霉素(GA)的浓度。优选的赤霉素2-氧化酶基因包括PcGA2ox1、AtGA2ox1、AtGA2ox2和AtGA2ox3。该超量表达GA2-氧化酶的转基因植物类似用生长迟缓剂处理的植物。因此本发明用于降低植物生长，例如，预防谷类植物包括稻倒伏，提高谷类产量，预防油子芸苔(oilseed rape)倒伏，改善株冠结构，改善移植的幼苗质量，减缓草坪草的生长，降低果园中和观赏树木芽的生长，使观赏植物形成更紧密的生长习惯，改善对低温、干旱、和感染的耐受力，通过同化物从营养器官转移到生殖器官而提高产量，防止莲座状植物例如甜菜、莴苣、brassicas、和菠菜的抽苔。本发明还通过花器官中表达用于诱导雄性和/或雌性不孕，防止谷类在收获前发芽，降低绿篱植物芽的生长，可逆地抑制种子的发育和萌发，降低商业树木品种芽的生长。
可以利用含组成性启动子和核酸编码序列的DNA构建体在通过重组DNA技术制备的转基因植物中实现编码赤霉素2-氧化酶的核酸序列的超量表达。或者，可以利用同源重组技术将一种组成性启动子插入细胞核中本发明核酸序列的正常沉默拷贝的上游，实现超量表达。
本发明还提供了另一方面，即上述核酸序列在制备转基因植物和/或种子中的用途，在所述转基因植物和/或种子中，通过例如，内源性GA 2-氧化酶DNA序列的反义拷贝的表达，内源性基因的截短的有义拷贝的表达(共-抑制)，或者针对内源性转录物的合成核酶的应用，使转基因植物中内源性GA 2-氧化酶基因的表达减少(即，沉默)。按照本发明这一方面的优选的赤霉素2-氧化酶基因包括PcGA2ox1、AtGA2ox1、AtGA2ox2、和ATGA2ox3。这将导致生物活性GA的周转降低，因此浓度增加的植物。在这一方面，本发明可以用于，例如，改善无子葡萄、柑桔和梨的果实形成和生长，改善苹果皮质地和果实形状，增加甘蔗茎的长度由此提高产量，提高芹菜和大黄的产量和早熟，改善谷类，尤其是大麦麦芽的产量和质量。它还可以用于促进木本品种的生长。
本发明第二方面和后续方面的优选特征如同第一方面，同时在细节上加以必要的变更。
下面将参考实施例和附图进一步描述本发明，提供它们的目的仅在于解释，不应该构成对本发明的限制。在实施例中，参考对照下列附图编号，其中图1显示了多花菜豆2-氧化酶cDNA克隆pc-2boh.dna(PcGA2ox1)的核苷酸序列，其中编码区在残基68-1063nt(332个氨基酸)。
图2显示了图1所示的多花菜豆核苷酸序列(PcGA2ox1)的推测的氨基酸序列。
图3显示了鼠耳芥探针T3(图3a)和探针T24(图3b)的DNA探针序列。
图4显示了赤霉素(GA)生物合成的两个主要途径。
图5显示了鼠耳芥克隆at-2bt3(AtGA2ox1)的部分核苷酸序列，其中编码区在残基41-1027nt(329个氨基酸)。
图6显示了鼠耳芥克隆at-2bt3(AtGAox1)的推测的氨基酸序列。
图7显示了鼠耳芥克隆at-2bt24(AtGA2ox2)的部分核苷酸序列，其中编码区在残基109-1131nt(341个氨基酸)。
图8显示了鼠耳芥克隆at-2bt24(AtGAox2)的推测的氨基酸序列。
图9显示了鼠耳芥基因组克隆T31E10.11(AtGA2ox3)的核苷酸序列。
图10显示了基因组克隆T31E10.11(AtGA2ox3)的推测的氨基酸序列。
图11显示了在CaMV35S启动子的控制下，表达多花菜豆GA 2-氧化酶cDNA的转化的鼠耳芥植物(哥伦比亚生态型)的照片，包括一种未显示表型的转化植物(最右端的图)。
实施例1．来自多花菜豆的编码GA 2β-羟化酶的cDNA克隆的分离如下述从多花菜豆胚中，通过在cDNA文库中筛选功能型酶的表达，而分离编码GA 2β-羟化酶的cDNA克隆。按照Dekker等(1989)，从成熟多花菜豆种子的子叶中提取RNA。通过oligo(dT)纤维素层析纯化Poly(A)+mRNA。用定向cDNA合成试剂盒(λ-ZAP Ⅱ cDNA合成试剂盒，Stratagene)从5μg多聚(A)+mRNA合成cDNA。将cDNA连接到λ-ZAP Ⅱ臂中，利用Gigapack Gold Ⅲ(Stratagene)包装和按照生产商的说明书扩增1 x 106重组克隆。
按照生产商的体外切除方案(Stratagene)从多花菜豆cDNA文库(1×109pfu)制备噬菌粒贮备液。为了初步筛选，按照生产商的说明(Stratagene)，用噬菌粒贮备液感染大肠杆菌SOLR，得到约11000菌落形成单位(cfu)。将它们再分到微滴板的48个孔(6×8阵列)中(孔体积=3.5ml)，在0.5ml添加50μg/ml卡那霉素和100μg/ml羧苄青霉素的2×YT肉汤中，在37℃下振摇过夜生长扩增。从每行六个孔和每列八个孔中取20μl等分液混合，得到14个汇集液，分别加入10ml 2 YT肉汤，添加50μg/ml卡那霉素和100μg/ml羧苄青霉素，在37℃下振摇生长，直到OD 600nm值为0.2-0.5。然后将该培养物转移到30℃的振荡培养箱中，添加1mM的IPTG，诱导重组融合蛋白质产生。诱导培养物16小时。离心(3000g×10分钟)沉淀细菌，重悬浮于750μl溶胞缓冲液(100mM Tris HCl pH 7.5,5 mM DTT)。超声溶解细菌(3×10秒)，在微量离心管中离心10分钟沉淀细胞碎片。如下述分析上清液中GA 2β-羟化酶的活性。从第6行(R6)和第1列(C1)的收集到的细菌的细胞溶解液能够催化[1.2-3H2]GA4和[2.3-3H2]GA9释放3H2O。对于第二次筛选，将孔R6C1的细菌在添加100μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的2YT琼脂板上铺板，在37℃下生长16小时。随机挑取一百个单菌落，转移到5ml含100mg/ml羧苄青霉素和50mg/ml卡那霉素的2xYT肉汤中，于37℃振摇生长16小时。将培养物分布到10×10格栅中，来自每行和每列的汇集物用于如上述诱导和测试GA 2β-羟化酶的活性。第2和9行和第7和10列能够催化从[1,2-3H2]GA4和[2,3-3H2]GA9释放3H2O。表明培养物27和90表现该活性。推测的GA 2β-羟化酶克隆被命名为2B27。
利用Promega SV miniprep试剂盒从克隆2B27分离出的质粒DNA，应用Amersham’s Taq循环测序试剂盒，M13通用(-20)和反向测序引物，测序。用Applied Biosystems 373A自动测序仪分析从测序反应得到的链终止产物。用来自基因密码公司(Gene Codes Corporation)的程序性测序仪3.0进行序列分析。用Wisconsin大学遗传计算机组的一套程序进行进一步核苷酸和蛋白质序列分析。实施例2．GA 2-氧化酶活性的分析如Smith和MacMillan所述(Smith,V.A.,和MacMillan,J.“植物生长调节杂志(J.Plant Growth Regulation)”2 251-264(1984))，通过测定2β-氚标记的GA底物中3H2O的释放，确定GA 2β-羟化酶活性。将细菌裂解液(90μl)与[1,2-3H2]GA4或[2,3-3H2]GA9(约50000dpm)，在存在4mM 2-氧化戊二酸、0.5mM Fe(Ⅱ)SO4、4mM抗坏血酸、4mM DTT、1mg/ml过氧化氢酶、2mg/ml BSA的情况下一同保温，终反应体积为100μl。混合液在30℃培养60分钟。添加1ml活性炭(5％w/v)，随后在微量离心管中离心5分钟除去氚代GA。0.5ml上清等份液与2ml闪烁液体混合，通过闪烁记数确定放射活性。
为了确定cDNA表达产物的功能，将细菌裂解液与[17-14C]GA在存在辅助因子的情况下如上述共同保温。保温后，加入pH为3的乙酸(10μl)和水，混合液在3,000rpm离心10分钟。通过HPLC在在线放射性监测仪上分析上清液，通过GC-MS鉴定产物，如以前的描述(MacMillan等，植物生理学，113 1369-1377(1977))。实施例3．编码来自鼠耳芥的GA 2-氧化酶的cDNA的克隆应用TblastN程序，用预测的克隆2B27的蛋白质序列，在国家生物信息中心(the National Centre for Biological Information,ncbi.nlm.nih.gov)的基因组概括序列数据库(the Genomic SurveySequences database)中检索。两种鼠耳芥属的基因组序列，T3M9-Sp6和T24E24TF，证明与2B27序列具有高度氨基酸序列等同性。基于T3M-Sp6基因组序列设计寡核苷酸引物为5’-TAATCACTATCCACCATGTC-3’(有义)5’-TGGAGAGAGTCACCCACGTT-3’(反义)，和基于T24E24TF序列设计寡核苷酸引物为5’-GGTTATGACTAACGGGAGGT-3’(有义)，5’-CTTGTAAGCAGAAGATTTGT-3’(反义)，将它们应用于以鼠耳芥属基因组DNA作为模版的PCR反应。PCR反应由200ng基因组DNA、1xPCR缓冲液、1.5mM MgCl2、200μM脱氧核苷酸三磷酸、1μM各种引物、和2单位Taq DNA聚合酶(Promega)组成。将该反应加热到94℃3分钟，然后进行扩增循环35次(94℃30秒，55℃30秒和72℃30秒)，最后在72℃保温10分钟。应用TA克隆试剂盒(Invitrogen)将得到的PCR产物直接克隆到pCR2.1载体中，然后如上述测序。克隆被命名为AtT3和AtT24。采集哥伦比亚生态型(columbia ecotype)的长角果、花、顶端茎(茎顶端2cm)、下端茎、叶(茎生的和莲坐叶丛)、和根，在液氮中冷冻。如上述提取Poly(A)+mRNA。使5μg Poly(A)+mRNA样品通过含甲醛的琼脂糖凝胶电泳，制备Northern印迹，然后转移到硝基纤维素上(Sambrook等，分子克隆实验室指南，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York(1989))。应用即用标记小珠(Ready to go labelling beads)(Pharmacia)制备AtT3和AtT24的随机-引导的32P-标记的探针。图3显示了鼠耳芥探针T3(图3a)和探针T24(图3b)的DNA探针序列。在存在50％甲酰胺的情况下，在42℃进行杂交16小时(杂交缓冲液5xSSPE,2xDenhardts、0.5％(w/v)SDS、100μg/ml变性超声的鲑鱼精DNA,10％葡聚糖硫酸酯)。印迹在20℃1×SSC/0.5％SDS中清洗10分钟，共两次。在60℃0.1×SSC/0.5％SDS中进一步清洗10分钟，两次。在-80℃使印迹与具有MS强化滤光片的kodakMS胶片接触在花序中检测到两种基因的最高表达。如上述用5μg花序poly(A)+mRNA构建cDNA文库。总共5x105在大肠杆菌XL1-Blue MRF’中的重组噬菌体在五个24cm×24cm方型平板上铺板。噬斑生长直到铺满(8-10小时)，然后在20×22cm支持的硝基纤维素滤膜(Nitropure,MSI)进行影印，然后如Sambrook等(分子克隆实验室指南。ColdSpring Harbor Laboratory press,Plainview,New York(1989))所述处理。如上述进行32P-标记的AtT3和AtT24探针的杂交。通过放射自显影鉴定阳性噬斑，挖取噬斑中心，置于750μl SM缓冲液(50mMTris HCl pH7.5,100mM NaCl,10mM MgSO4,0.5％明胶)，重新筛选直到分离出噬斑-纯克隆。应用Stratagene’s Rapid Excision试剂盒进行质粒拯救。对cDNA克隆进行测序，如上述进行重组蛋白质在大肠杆菌中表达，GA 2-氧化酶活性的实验。所述克隆的部分核苷酸和推测的氨基酸序列在图5、6、7和8中显示。
也在GenBank数据库中检测了与多花菜豆GA 2-氧化酶(PcGA2ox1)具有高度氨基酸等同性的第三种鼠耳芥属基因组序列T31E10.11(AtGA2ox3)。其衍生的氨基酸序列分别与多花菜豆GA 2-氧化酶(PcGA2ox)、T3(AtGA2ox1)、和T24(AtGA2ox2)具有53％、49％和67％的等同性(67％、67％和84％的相似性)。T31的核苷酸序列在图9中显示，推测的氨基酸序列在图10中显示。实施例4．用有义和反义GA 2-氧化酶cDNA构建体转化鼠耳芥属应用下述寡核苷酸引物通过PCR扩增预测的2B27的编码区5’-TGAGCTCAACCATGGTTGTTCTGTCTCAGC-3’(有义)，和5’-TGAGCTCTTAATCAGCAGCAGATTTCTGG-3’(反义)，它们各有一个插入其5’末端的SacI限制性位点。将PCR产物亚克隆到pCR2.1中，以便有利于如前述的DNA测序。用SacⅠ消化2B27编码区，然后亚克隆到二元载体pLARS120的SacⅠ位点上，所述二元载体pLARS120是一种pGPTV-Kan的改进型(Becker等，植物分子生物学20 1195-1197(1992))，其中β-葡糖醛酸酶报告基因被来自pBI220的花椰菜花叶病毒35S启动子取代(Jefferson,R.A.,植物分子生物学报告(Plant Mol Biol Rep)5 387-405(1987))。将DNA在35S启动子的控制下插入有义方向。通过电穿孔将质粒导入根瘤农杆菌，然后通过真空渗入法转化进鼠耳芥哥伦比亚栽培品种(ArabidopsisCV.Columbia)(Bechtold等，Compt.Rend.Acad.Sci.SerieⅢ-Sciences de la Vie-Life Science 316 1194-1199(1993))。同样地，也将AtT3和AtT24的SacⅠ片段亚克隆到pLARS120中，除了在这两种情况下，将DNA在35S启动子的控制下插入反义方向。用这两种反义构建体如上述转化鼠耳芥。实施例5(a)．GA 2-氧化酶在转基因植物中改变的表达将有义方向的多花菜豆2-氧化酶cDNA(PcGA2ox1)和反义方向的鼠耳芥2-氧化酶cDNA插入载体pLARS120的CaMV 35S启动子和nos终止子之间。载体pLARS120是一种用于由农杆菌介导的植物转化的二元载体除了CaMV 35S启动子和nos终止子之外，T-DNA还含有nos启动子之下的nptⅡ可选择标记。载体来源于pGPTV-Kan(Becker等，植物分子生物学20 1195-1197(1992)),pGPTV-Kan中的uidA报告基因由35S启动子替代。通过电穿孔将二元表达构建体导入携带pAD1289质粒的根瘤农杆菌菌株GV3101，所述pAD1289质粒使VirG超量表达。通过真空渗入法将它们导入鼠耳芥(Bechtold等，Compt.Rend.Acad.Sci.Serie iii-Sciences de la Vie-Life Science 3161194-1199(1993))。为了鉴定转基因植物，将来自渗入的植物的种子在添加卡那霉素(50μg/ml)的MS平板中生长约14天，将抗性植物转移到培养料中。同时通过用转化的根瘤农杆菌感染叶盘，将含多花菜豆2-氧化酶构建体的T-DNA导入Nicotiana sylvestris。
在CaMV 35S启动子的控制下用多花菜豆GA 2-氧化酶cDNA转化鼠耳芥属植物产生下列结果。所有被检查的转化体半数以上表现某种程度的矮小，许多严重矮小，一些不能抽苔。图11显示矮小转化植物与未表现表型(哥伦比亚生态型)的转化植物相比的筛选照片。转化体对GA3处理有应答，导致增加的茎伸长和正常花形成，从而它可能够获得种子。多花菜豆GA 2-氧化酶cDNA在Nicotiana sylvestris中的超量表达导致植物茎高减少。一种转化体不能抽苔或形成花，而同一年龄的未转化植物已经开花。实施例5(b)．GA 2-氧化酶在转基因植物中的改变的表达得到五种35S-PcGA2ox1转基因为纯合的鼠耳芥品系。一种在野生型(哥伦比亚(Columbia))植物抽苔的同一时间抽苔，但茎高度较短，而其它四种在长(16小时)或短(10小时)光期下生长时，保留莲座，不抽苔。一种严重矮小系不能产生纯合子植物，甚至当存在GA3下种子发芽时，表明当存在两拷贝所述基因时，该系的种子发育被损伤。严重矮小系拥有接近盘卷水平的小、暗色叶。当在长光期下它们形成花蕾，然而不能正常形成花，并且不结果。当植物在短光期下生长时，得不到花蕾。用10μM GA3处理转基因系能够使它们抽苔，产生结出能发芽的种子的正常花。
比较了严重矮小35A-PcGA2ox1系与野生型植物中C19-Gas的代谢。基于HPLC分析发现，矮小系比野生型更大程度地将GA1、GA4、GA9、和GA20转化成2-氧化产物。矮小系不代谢GA3，确证了重组酶的结果，表明GA3不是GA 2-氧化酶的底物。因此，该GA可以用于，当需要时，逆转由于GA 2-氧化酶基因超量表达产生的GA-缺陷。
35S-PcGA2ox1系的Northern印迹分析确证转基因高水平表达。与野生型植物相比，35S-PcGA2ox1系的莲座型叶丛中GA 20-氧化酶基因(AtGA2ox1)和3β-羟化酶(AtGA3ox1)基因的转录丰度提高，而天然GA 2-氧化酶(AtGA2ox2)的转录水平降低，这是GA稳态的控制机制的结果。实施例6．鼠耳芥属GA 2-氧化酶基因T3和T24(分别为AtGA2ox1和AtGA2ox2)的表达模式通过对从具有全长cDNA的不同组织中提取到的RNA进行探针Northern印迹分析，检查了鼠耳芥GA 2-氧化酶基因T3和T24的表达模式。这些基因表现相似的表达模式，这两种基因均在叶、下端茎、上端茎、花、和长角果中转录。花、长角果和上端茎中有高水平表达，它们的转录丰度以降序排列。T24，而不是T3，还在根中表达。GA3处理后，在GA-缺陷型鼠耳芥突变体，gal-2的未成熟花蕾和花梗中T3和T24的转录丰度增加，表明这些2-氧化酶基因的表达被GA上调。这与GA 20-氧化酶和3β-羟化酶基因的表达被GA下调形成对照。在所有组织中，T31的转录丰度比T3或T24低得多。通过RT-PCR检测到花、上端茎和叶中有T31转录，而根或长角果中没有。实施例7．来自多花菜豆和鼠耳芥的重组GA2-氧化酶的功能在存在双加氧酶辅助因子的情况下，将重组蛋白质与由C19-GA GA1、GA4、GA9和GA20，以及C20-GA GA12和GA15构成的一系列14C-标记的GA底物一同保温，检查了重组蛋白质的催化性质，所述重组蛋白质是通过将来自多花菜豆(PcGA2ox1)和鼠耳芥(AtGA2ox1、AtGA2ox2、和AtGA2ox3)的cDNA在大肠杆菌中表达得到的。这种最终化合物以其封闭内酯形式和开放内酯形式保温。所有酶都没有转化GA12，而PcGA2ox1和AtGA2ox2将GA15转化成单一产物。开放内酯形式的GA15(20-羟基GA12)被AtGAox2转化成同一产物，但比内酯形式的效率低，而PcGA2ox1不转化GA15开放内酯。GA15的产物的质谱与2β-羟基GA15的一致，尽管，因为得不到用于比较的真正化合物，对该产物的鉴定是暂行的。
C19-GA的重组酶的底物特异性比较(表1)表明GA9是PcGA2ox1、AtGA2ox1和AtGA2ox2的优选底物。重组酶在其底物特异性上存在某些不同，PcGA2ox1和AtGA2ox3可以将GA4如GA9一样有效地转化，但对于AtGA2ox1和AtGA2ox2来说GA4是相对较差的底物。虽然AtGA2ox1和AtGA2ox2能够使GA20比使GA4更有效地2β-羟基化，但与GA20保温后，没有检测到GA29分解代谢物(catabolite)，而当GA4与PcGA2ox1、AtGA2ox2、和AtGA2ox3保温后，得到低产量的GA34分解代谢物。重组PcGA2ox1、AtGA2ox2、和AtGA2ox3对GA9的2β-羟基化活性在pH6.5-8之间改变很小，而AtGA2ox1的该活性在pH7时达峰值，在pH≤5.9和≥8.1时未检测到活性。
结果表明，作为生物活性化合物的即时前体的非3β-羟基C19-GA比活性GA本身是GA 2-氧化酶的更好底物。因此，GA 2-氧化酶基因的超量表达将导致产生非常低活性的GA。
表1重组GA 2-氧化酶对C19-GA底物的特异性
数值是将表达cDNA的大肠杆菌的细胞裂解物与14C-标记的GA底物和辅助因子共同保温2.5小时后，对产物进行HPLC-放射性监测得到的％产率。产物和底物通过HPLC分离，产物通过GC-MS鉴定。产物的合并产率＜100％，其余的是未转化的底物。赤霉素(GA)的生物合成图4显示了赤霉素(GA)生物合成的两个主要途径，从GA12到GA4和从GA53到GA1。GA1和GA4是生物活性GA。GA12到GA9以及GA53到GA20的转化被GA 20-氧化酶催化。GA9到GA4以及GA20到GA1的转化由GA3β-羟化酶催化。GA9、GA4、GA20、和GA1均是GA 2-氧化酶的2β-羟化酶活性的底物，它们分别被转化为GA51、GA34、GA29、和GA8。这些2β-羟化的GA可以被进一步氧化成相应的分解代谢物。本发明表明来自多花菜豆的酶和来自鼠耳芥的两种酶催化每一种底物2β-羟化。另外，本发明还表明当将多花菜豆酶和鼠耳芥酶的一种分别与GA9和GA4保温后，形成GA51分解代谢物和GA34分解代谢物。
权利要求
1．一种编码赤霉素2-氧化酶的分离的、纯化的或重组的核酸序列，其包括图1所示的核酸序列或其功能衍生物，或其互补链，或其同源序列。
2．如权利要求1的核酸序列，其编码一种具有多花菜豆赤霉素2-氧化酶活性的酶。
3．如权利要求1的核酸序列，其编码一种来自多花菜豆或鼠耳芥的赤霉素2-氧化酶。
4．如权利要求1-3任一的核酸序列，其中编码序列有效地连接于启动子。
5．如权利要求4的核酸序列，其中启动子是一种组成型启动子。
6．如权利要求4的核酸序列，其中启动子在特定植物细胞中表达特异性的。
7．一种含有一种启动子的分离的、纯化的或重组的核酸序列，所述启动子天然驱动编码赤霉素2-氧化酶的基因表达，含有图1所示的核酸序列或其功能衍生物，或其互补链，或其同源序列。
8．如权利要求7的核酸序列，其中赤霉素2-氧化酶是来自多花菜豆的赤霉素2-氧化酶(PcGA2ox1)。
9．如权利要求1-8任一的核酸序列，其中赤霉素2-氧化酶催化C19-赤霉素分子2β-氧化，在C-2引入羟基。
10．如权利要求9的核酸序列，其中赤霉素2-氧化酶进一步催化C-2位引入的羟基氧化，产生酮衍生物。
11．一种编码核酶的核酸序列，所述核酶能够特异性地剪切由赤霉素2-氧化酶基因编码的RNA。
12．一种反义核酸序列，包括一种互补于至少部分的在编码赤霉素2-氧化酶基因中被天然转录的DNA链的DNA的可转录链。
13．一种分离的、纯化的、或重组的多肽，包括赤霉素2-氧化酶，具有如图2所示氨基酸序列。
14．一种包含权利要求1-12任一的核酸序列的载体。
15．一种用权利要求1-12任一的核酸序列转化或转染的宿主细胞。
16．一种含有权利要求1-12任一的核酸序列的植物细胞。
17．一种至少其某些细胞是权利要求16的细胞的植物或植物的一部分。
18．来自权利要求17的植物的繁殖材料。
19．权利要求1-12任一的核酸序列在制备植物中的用途。
20．权利要求19的用途，其中赤霉素2-氧化酶在植物中组成型地超量表达，从而降低了植物中生物活性赤霉素(GA)的浓度。
21．权利要求19的用途，其中在转基因植物中内源性GA 2-氧化酶基因的表达降低
全文摘要
提供了一种编码赤霉素2－氧化酶基因的核酸序列,所述赤霉素2－氧化酶催化赤霉素分子2β－氧化,在C－2位引入羟基,并进一步催化C－2位引入的羟基氧化,产生酮衍生物。该序列可以应用于制备赤霉素2－氧化酶水平改变的转基因植物。
文档编号C12N1/21GK1310761SQ99808839
公开日2001年8月29日 申请日期1999年6月11日 优先权日1998年6月12日
发明者S·G·托马斯, P·赫登, A·L·菲利普斯 申请人:布里斯托尔大学