生物活性分子的融合的制作方法
【专利摘要】本发明提供了融合蛋白，其包含与肠表面结合性结构域连接的酶，优选地饲料酶或食品酶。融合蛋白可用来促进动物中的饲料利用。在具体的实施例中，包含与植酸酶连接的肠表面结合性多肽区段的根据本发明的融合酶，在肠中显示增加的停留时间，使得给予酶增加的时间来催化相应反应，最终导致改善的饲料利用。
【专利说明】生物活性分子的融合
[0001]本发明涉及，基于具有如本文下面所讨论的有黏附性质的微生物的适应特性，构建用于增加动物胃肠道中停留时间的多肽和酶的创新方法。
[0002]本发明尤其涉及与参考多肽或酶相比在动物饲料中显示改善性能的新型多肽和酶，例如饲料酶。
【背景技术】
[0003]农场动物，例如猪和家禽二者是通常被补充饲料酶以提高饲料利用的动物。
[0004]例如，植酸酶是单胃动物的常用饲料酶，用来改善动物饲料的营养价值并且减少对饲料进行的磷补充，从而降低集中型家畜生产地区的环境污染。
[0005]就任何饲料酶而言，产生的产物(本文是磷)量是底物(本文是植酸盐)浓度、酶活性和给予酶进行催化反应的时间量的函数，仍需要通过修饰酶制剂或通过开发新型的酶来优化饲料利用和酶活性。
_6]技术背景简述
[0007]乳酸菌属(Lactobacillus)的成员以及其他细菌,特别是芽孢杆菌属(Bacillus)的成员经常出现在鸟类和哺乳动物的胃肠道中。对于能够定居在该开放流动环境中的细菌，对黏膜的黏附被认为是必要条件。肠的上皮细胞由保护性粘液层覆盖，所述保护性粘液层是糖蛋白和糖脂的复杂混合物，大的糖蛋白黏蛋白(mucin)是主要组分。定居在黏膜上的细菌可在粘液层中找到并且黏附在上皮细胞上。在大部分情况下，已经报道，黏附由蛋白质介导，但是也已经描述了在乳酸杆菌(Iactobacilli)细胞表面上的糖类部分与黏膜组分相互作用。总结现有知识已知，微生物菌株黏附至胃肠组分上的能力，基于微生物菌株与胃肠粘液或其主要组分黏蛋白的亲和力，以及微生物菌株与由于肠上皮细胞脱落而陷入粘液中的胶原或当上皮细胞损伤时可获取的胶原的亲和力。还已知，天然肠生细菌(包括芽孢杆菌属的成员)能够形成生物膜并黏附到上皮细胞上，其比不能产生生物膜的细菌在肠道中明显坚持更长时间。所以，自产的胞外生物膜基质对于微生物菌株黏附至胃肠组分的能力而言也起必要的作用。
[0008]粘液结合蛋白已经主要在乳酸杆菌中表征。已知来自Lactobacillisreuteri 1063的基因编码命名为Mub的细胞表面蛋白，所述细胞表面蛋白黏附到粘液组分上。Mub是大的多结构域蛋白质(357kDa)，其作为黏蛋白结合性结构域(MucBP，Pfam06458)共价地附着到细胞表面上。
[0009]胶原结合性结构域可分为两种类型:
[0010]Cna型蛋白，其原型是来自Staphylococcus aureus的蛋白A (Pfam05738),介导细菌黏附至胶原上
[0011]CBD结构域，其是梭菌胶原酶的一部分。
[0012]TasA是由芽孢杆菌属的成员产生的生物膜的主要蛋白质组分。已经检测了与EPS (胞外聚合物质)和孢子二者相关的TasA，并且TasA被认为对表面黏附而言是必需的。
【发明内容】
[0013]本发明尤其涉及与多肽或酶，优选饲料酶或食物酶连接的肠表面结合性多肽区段。本发明还涉及编码由酶和肠表面结合性多肽区段组成的这种融合蛋白的DNA、包含该DNA的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及生产它们的方法，以及它们在例如动物饲料和动物饲料添加剂中的用途。
[0014]本发明还涉及促进动物中的饲料消化率的方法，其包括给动物施用根据本发明的融合蛋白。本发明还提供了包含这种融合蛋白的饲料组合物或预混物。
[0015]包含与酶连接的肠表面结合多肽区段的融合蛋白，特别是融合酶显示肠中增加的停留时间，这导致给予酶增加的时间量来进行催化相应，在饲料酶的情况下最终使得饲料利用改善。
[0016]基于蛋白质的同源性,本发明人已经在候选菌株益生菌Bacillus subtilis BSPl的基因组中鉴定了一种胶原结合性蛋白，所述胶原结合性蛋白参与前面提到的黏附现象。该蛋白质是本文后面描述的肠表面结合性多肽区段的第一个例子。根据本发明可使用的另一肠表面结合性多肽区段是来自Staphyloccus aureus的胶原结合结构域。其已知为Cna(ProtA)。
[0017]本发明人已经从与Citrobacter braakii的植酸酶基因appA融合的益生菌菌株B.subtilis BSPl 基因 bbspllOO 和 bbspllOl 或来自 S.aureus 的 cna基因的一部分构建了含有胶原结合结构域的融 合蛋白。
[0018]在融合蛋白的一些实施方式中，胶原结合性多肽区段是细菌胶原-结合多肽区段。在更具体的实施方式中，胶原结合性多肽区段是梭菌属(Clostridium)胶原结合性多肽区段。
[0019]在本发明的另一实施方式中，胶原结合性多肽区段是胶原酶或细菌胶原酶或梭菌属胶原酶的区段。优选地，区段仅仅是胶原酶的一部分且胶原结合性多肽区段没有胶原酶活性。
[0020]本发明还涉及TasA或来自生物膜胞外基质的另一蛋白质用作间接肠结合性肽的用途，所述间接肠结合性肽来自Bacillus subtilis并且靶向肠中细菌生物膜和孢子二者。已经发现TasA蛋白的序列在如下所示的芽孢杆菌属的成员中高度保守。
[0021]芽孢杆菌属成员中TasA蛋白序列的保守性。
【权利要求】
1.一种组合物，其包含与多肽或酶，优选饲料酶或食品酶连接的肠表面结合性多肽区段。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肠表面结合性多肽区段是细菌胶原结合性多肽区段。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肠表面结合性多肽区段是粘液结合性蛋白的区段。
4.权利要求1-3任一项所述的组合物，其中所述酶是植酸酶。
5.权利要求1-4任一项所述的组合物，其中所述肠表面结合性多肽区段和酶是融合蛋白的部分。
6.一种经分离的核酸序列，其包含编码权利要求1-5任一项所述的组合物的核酸序列。
7.—种核酸构建体,其包含与一种或多种控制序列可操作地连接的如权利要求6所述的核酸序列，所述控制序列指导在合适的表达宿主中生产所述融合蛋白。
8.—种重组体表达载体，其包含权利要求7所述的核酸构建体。
9.一种重组体宿主细胞，其包含权利要求7所述的核酸构建体和/或权利要求8所述的表达载体。
10.生产权利要求1-5任一项所述的组合物或融合蛋白的方法，其包括:(a)培养权利要求9所述的宿主细胞，以生产包含所述融合蛋白的上清液，和(b)回收所述融合蛋白。
11.一种动物饲料组合物，其包含权利要求1-5任一项所述的至少一种组合物或融合蛋白，和 (a)至少一种脂溶性维生素； (b)至少一种水溶性维生素；和/或 (C)至少一种痕量矿物质。
12.改善动物饲料的营养价值的方法，其中将权利要求1-5任一项所述的至少一种组合物或融合蛋白添加至所述饲料。
13.促进动物中饲料利用的方法，其包括给所述动物施用权利要求1-5任一项所述的组合物。
14.权利要求1-5任一项所述的组合物用于促进动物中饲料利用的用途。
【文档编号】C12N9/16GK103945704SQ201280028390
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2012年6月11日 优先权日:2011年6月9日
【发明者】格赫斯兰·舍恩斯, 史蒂芬娜·杜沃, 奥雷利·布海林 申请人:诺维信专利公司