一种含有水蛭或地龙成分的中药制剂的生物活性测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种含有水蛭或地龙的中药制剂的抗凝生物活性测定方法，体外实验证明水蛭或地龙的提取液能够剂量相关的抑制凝血酶活性，因此本发明通过采用荧光共振能量转移(FRET)方法来测定凝血酶的抑制作用可反映含有水蛭或地龙药材成分的药物制剂的抗凝活性，方法简便快速，误差小，重现性高。
【专利说明】一种含有水蛭或地龙成分的中药制剂的生物活性测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及中药制剂的质量检测方法，确切的说，本发明涉及一种含有水蛭或地龙药材成分的中药制剂的生物活性测定方法，该方法可用于产品的质量控制。
【背景技术】
[0002]水蛭是一味传统的中药，始载于《神农本草经》，中医认为它具有破血、逐瘀、通经的作用。历来用于治疗症瘕、痞块、血瘀闭经、跌打损伤。水蛭中的水蛭素是作用最强的凝血酶特异性抑制剂，它不仅能阻止纤维蛋白原的凝固，也可阻止凝血酶催化的进一步血瘀反应，如凝血诱导的血小板反应等。由于水蛭素能有效地抑制游离的和凝血块上的凝血酶，因此可用以防止各类血栓的形成及延伸。研究证明，水蛭药材经不同的提取工艺后，其抗凝活性不仅存在于水蛭素，部分的小分子成分也具有抗凝作用，这类成分的中药制剂如疏血通注射液等。
[0003]地龙也是一味传统中药，具有清热、定惊、通络、平喘及利尿等多种功效。现代研究表明，地龙含有丰富的酶类，其中纤维蛋白溶解酶、蚓激酶、蚓胶质酶对体内凝血和纤溶系统具有广泛的影响。贺石林等(地龙提取液的抗凝作用与毒性[J].湖南医科大学学报，1990，(2):107-111)发现地龙水煎醇提取液在动物体内外均有抗凝血活性，经初步化学分离认为抗凝活性成分可能是耐热的小肽类成分，并排除了蛋白质、多糖、核酸类大分子的可能。含有地龙成分的中药制剂如复方地龙胶囊、脑心通胶囊等临床广泛用于脑中风等疾病的防治。
[0004]含有水蛭或地龙药材的中药制剂多具有抗凝、溶栓、细胞保护等多方面生理活性，临床上多用于心脑血管相关疾病的防治。目前，对于这类中药制剂还没有很好的生物活性测定方法。国家药典2010版所用的水蛭药材抗凝活性测定方法采用凝血酶滴定法，计时和肉眼鉴别滴定终点，误差大且容易受实验者操作手法影响。本发明采用荧光共振能量转移(FRET)方法来测定凝血酶的抑制作用可反映含有水蛭或地龙药材成分的药物制剂的抗凝活性，采用荧光仪自动仪器读数，方法简便快速，误差小，重现性高，较药典方法具有很大优势。
[0005]凝血酶是由凝血酶原活化变成的一种专一性很强的丝氨酸蛋白类水解酶，是机体凝血系统中的天然成分。凝血酶在体内以凝血酶原形式存在，在凝血过程中，凝血酶原复合物将其激活而转变为有丝氨酸蛋白类水解活性的凝血酶。凝血酶的形成在凝血过程中起到了中心作用。凝血酶特异性的剪切一些肽类底物如S-2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNA.2HC1)等已有文献报道(Abildgaard U, Lie M, Odegard OR.Antithrombin (heparin cofactor)assay with " new " chromogenic substrates(S-2238and Chromozym TH).ThrombRes.19770ct ；11(4):549-53.)。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是克服现有含水蛭或地龙药材的中药制剂生物活性测定方法的不足，提供一种新的生物活性检测方法，以控制产品的质量。
[0007]本发明提供的测定含水蛭或地龙药材的中药制剂抗凝血酶生物活性测定方法，主要包括以下步骤:
[0008](I)配制制剂供试品溶液:对于注射剂，可直接取注射液作为供试品溶液，注射用粉针剂可以采用生理盐水溶解后作为供试品溶液，固体制剂可以采用适当方法提取活性成分后，用水、生理盐水或缓冲液溶解后作为供试品溶液。
[0009](2)制备反应溶液:依次在96孔荧光测定板中加入37°C预热的测试缓冲液、生理盐水、供试品溶液、凝血酶，混匀即得反应溶液。
[0010](3)测定荧光密度:将上述加好溶液的96孔荧光板37°C预热15min，加入凝血酶底物溶液50 μ 1，Ex/Em=485nm/535nm立即测定荧光密度(RFU)，测定持续30min，每间隔5min记录数据。
[0011]所述步骤(1)中固体制剂的供试品配制方法为精密称取固体制剂0.1~10g，采用水、生理盐水或甲醇、乙醇溶液提取，提取方式可以采用浸泡、加热提取或超声提取，提取液减压浓缩至干燥，用水、生理盐水或TriS缓冲液溶解后作为供试品溶液。
[0012]所述步骤(2)中反应溶液的制备方法为在96孔荧光测定板中每孔加入供试品溶液10~90 μ 1，纯化的凝血酶20~200ng或5mU~5U，测试缓冲液或生理盐水至总体积100 μ I。测试缓冲液可以采用ρΗ6-8范围内的0.01~5Μ Tris缓冲液。
[0013]所述步骤(3)中凝血酶底物为荧光标记的小肽，荧光标记物可以为生物素或FITC等荧光染料，小肽核心氨基酸序列为Phe-PiO-Arg或文献报道的其他序列，荧光底物的浓度为 0.1-100 μ M0
[0014]荧光共振能量转移(FRET)方法检测原理见附图1，凝血酶能特异性剪切凝血酶肽类底物，肽类底物一般N端和C段分别有一个供体和受体荧光基团，正常状态下供体受体基团处于同一肽链上，由于二者互相接近而发生荧光淬灭，供体没有荧光产生。当加入凝血酶后，可特异性切断肽类底物，荧光淬灭停止，当有外源激发光时，供体荧光基团即可产生荧光。FRET荧光的强弱与凝血酶活性成正比，即凝血酶活性越高，则荧光越强。以加/不加凝血酶的空白溶剂的荧光读数分别为RFU (2)和RFU (I)，加/不加凝血酶的供试溶液的荧光读数分别为RFU(4)和RFU(3)，则抗凝血酶活性可以按如下公式计算:
【权利要求】
1.一种含有水蛭或地龙成分的中药制剂的生物活性检测方法，其特征在于，通过检测凝血酶的活性反映该制剂的抗凝生物活性。
2.根据权利要求1所述的生物活性测定方法，其特征在于，通过荧光共振能量转移(FRET)方法检测凝血酶活性大小以间接反映含有水蛭或地龙成分的中药制剂的抗凝血酶作用。
3.根据权利要求1所述的生物活性测定方法，其特征在于，采用荧光标记的凝血酶的肽类底物，通过监测其荧光密度的变化反映凝血酶的活性。
4.根据权利要求2所述的生物活性测定方法，其特征在于，所述的检测凝血酶活性的荧光共振能量转移(FRET)方法具体操作步骤如下: 采用美国AnaSpec公司的SensoLyte? 520试剂盒 (1)制备工作液 IX测试缓冲液:将5ml的2X测试缓冲液(试剂C)加入5ml去离子水中； 凝血酶稀释液:使用1X测试缓冲液对凝血酶(试剂D)进行25倍稀释，96孔板，每孔加入稀释后的凝血酶溶液5μ 1，根据需要调整进行稀释的酶量； 凝血酶底物溶液:使用1X测试缓冲液对凝血酶底物(试剂Α)进行100倍稀释，每次试验都需要制备新鲜的底物溶液，因为试剂A中的凝血酶底物对光敏感，请避光操作； 0.9%生理盐水溶液:溶解0.9g NaCl到100mL去离子水中； (2)制备反应溶液 依次在96孔荧光测定板中加入37°C预热的IX测试缓冲液、0.9%生理盐水、含有水蛭或地龙药材成分的中药提取液、凝血酶，混匀即得反应溶液； (3)测定荧光密度 将上述加好溶液的96孔荧光板37°C预热15min，加入凝血酶底物溶液50 μ 1，Ex/Em=485nm/535nm立即测定荧光密度(RFU)，测定持续30min，每间隔5min记录数据。
5.根据权利要求3所述的生物活性测定方法，其特征在于，肽类底物核心氨基酸序列为 Phe-Pro-Arg。
6.根据权利要求4所述的生物活性测定方法，其特征在于，96孔板中每孔含有纯化的凝血酶20~200ng，或5mU~5U。
7.根据权利要求4所述的生物活性测定方法，96孔板中每100μ l反应溶液中加入含有水蛭或地龙药材成分的中药制剂提取液体积为10~90 μ l。
【文档编号】G01N21/64GK103901010SQ201410162027
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月21日 优先权日:2014年4月21日
【发明者】李振国, 陈艳明, 张忠兵 申请人:牡丹江友搏药业股份有限公司