专利名称：生物材料成分的测定的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种分析生物材料的成分的方法，尤其是脂质和/或维生素和富含该成分的生物材料，其中该生物材料用至少一种提取该成分的有机溶剂处理，本发明还涉及有机溶剂或有机溶剂混合物在这方面的应用以及用于测
量生物材料成分的分光光度计。
背景技术：
分析生物材料的现代方法通常包括生物材料成分的去除、提取、分离和/或凝集的步骤。这些方法步骤在用于消除干扰或假结果的物质的定性和定量分析中是必不可少的。此外，所谓的高通量方法或者为其提供整个功能、减
少到芯片卡大小的微流体系统正在被分析部门普遍采用。这种方法或系统被
口语化地称为术语如袖珍实验室(vest pocket lab)，芯片实验室(lab-on-a-chip)或即时照护系统(point-of-care system,可直接在病人身旁使用的诊断系统)。实质的小型化是这种分析模式必需的。这些系统的小型化意味着对可能阻塞并导致表面和毛细血管系统无法使用的杂质很敏感。因此，这种系统或方法往往需要费事的样本制备，在最终分析之前有耗时和设备密集的中间步骤。这些问题尤其涉及血液或食品的分析。人类和兽类医学实验室开展的最常见的研究是为诊断进行血液分析。正常情况下，研究针对全血样本的无细胞部分，尤其是血清或血浆进行。对全血的研究只能勉强进行，因为有血细胞溶解的风险，尤其是红细胞溶解的风险。适用于分析前去除血细胞成分的常规技术是离心和/或过滤。这些血球成分的去除有助于避免来自细胞和细胞碎片以及溶解产物的可能的干扰效应，尤其在芯片实验室分析宁。正常情况下，即使是芯片实验室分析，目前去除仍通过常规离心或过滤步骤的手段进行。直接去除细胞优选在芯片实验室上过滤。不论各种情况下使用何种过滤系统，这方面出现的主要问题是毛细管的迅速堵塞。为此，通常只能采用几微升的体积作为限制量。类似的问题还涉及食品分析。经过离心或过滤的必要的去除导致分析耗时增加，并且对试剂、设备和生物材料尤其是血液的需求增加。因此，人们非常需要一种用未过滤或未离心分离的样本即可实施的分析生物材料(尤其是血液)成分的方法。
发明内容
因此，本发明解决的问题是提供一种分析生物材料的成分的方法，该方法在分析前不需要离心或过滤生物材料样本，并且提供一种分析由该方法所得成分的仪器。
本发明通过上述用于分析生物材料的成分的方法，尤其是脂质和/或维生素和富含该成分的生物材料，解决了潜在的技术问题，其中该生物材料用至少一种提取所述成分的有机溶剂处理，生物材料在提取中被转换为凝集的
(consolidated)形式，以便形成凝集的沉淀物和液体有机相的上清液，并对提取至上清液的成分进行研究。
本发明上下文中，"生物材料"意指获取自植物、动物、人类和/或微生物的材料，尤其是内源性材料，优选内源性材料的样本。
本发明上下文中，"微生物"意图包括除例如真核生物如藻类、原核生物和/或真菌如酵母菌外，还包括病毒。尤其指出的是"生物材料"包括从培养获得的有机体和培养上清液。
通过使用生物材料的样本提供本发明方法中的生物材料，优选取自人类或动物有机体的样本。还可能适当地使用排泄或分泌的生物材料。此外，在将其用于本发明的方法前还可能培养该生物材料，尤其在人类或动物体外。
"凝集(consolidation)"在本发明中意指粘度的增加，尤其是生物材料的粘度的增加，以便形成凝集的沉淀物。还有可能达到介于液体和固体之间的粘度。特别用它来表示膏、面霜、骑自行车者的凝胶座的填充料、固定发型的发胶性质的生物材料的凝集形式或凝集沉淀物，优选明胶、胶状或凝胶状物质性质的凝胶。例如，凝集可通过沉淀或树脂化，尤其通过用酸或含树脂的组分处理来实现。
根据本发明适合作为凝集的形式或凝集的是凝胶或凝胶状态。从技术角度描述凝胶或凝胶状态是相对容易的。然而，人们仍在寻求一种凝胶的普遍可接受的全面的定义。凝胶通常被描述为由至少一种固相和一种液相组成的胶体系统。 一些凝胶中的固相可能为其中包含有液相的海绵状、三维网状的形式。依据其力学性质，凝胶为类似固体的状态。这种状态可通过均匀分布在整个系统中的成分来区别。该if胶可通过均匀结构(尤其是有序结构)和无序结构(尤其在聚集的聚合物的网的情况下)来表征。而且，该凝胶可通过它们的结合力和它们的液相的物理和化学性质来表征。当水介质构成液相时，凝胶被称为"水凝胶"。在有机介质的情况下，凝胶被称为"有机凝胶"。含有表面活性物质的凝胶作为液相时被称为"两性凝胶"。
凝胶通常通过在加热溶剂中溶解凝胶因子(gdator)产生。溶液的凝胶化在
冷却时开始。当凝胶因子或凝胶剂在溶剂中溶解度下降时，凝胶开始形成。这导致凝胶因子分子的聚集(自聚集)。部分溶剂被束缚在凝胶因子中。结果，溶剂体积，尤其它的总体积被凝集，并且它能承受自身的重量。
合适的凝胶因子或凝胶剂为各种低分子量的物质，取决于该凝胶的性质。在自然界发现了为数众多的在水溶液中形成水凝胶的分子。凝胶剂，尤其作为食品添加剂，结合水或在水中膨胀，即导致凝胶化，且尤其应该提到的凝胶剂是琼脂、藻酸、角叉胶、明胶、瓜尔豆胶、阿拉伯树胶、刺槐豆胶、果胶，尤其酰胺果胶，以及改性淀粉。
应提到的有机凝胶的凝胶因子的实例为脂肪酸，脂肪酸衍生物尤其脂肪酸的金属盐，类固醇衍生物尤其是胆固醇衍生物，含氨基酸凝胶因子，芳香
凝胶因子尤其是蒽醌衍生物，例如antryl衍生物，杯芳烃类，吡啶类，以及山梨醇衍生物和多元醇衍生物。 一种有名的有机凝胶是由卵磷脂形成。
除凝胶形成外，同样适用于生物样品凝集的为本领域技术人员熟知的技术和仍然未知的那些技术。
根据本发明的方法旨在用于分析生物材料的成分，尤其是脂质和/或维生素。该方法尤其用于提取亲脂性成分。该生物材料用有机溶剂处理，提取期间这些成分被转移至有机溶剂。生物材料优选存在于水介质中。
在用本发明的方法提取时，生物材料出人意料地转化为凝集形式。用有机溶剂尤其是溶剂混合物处理导致形成一多相系统，尤其是由两相组成的系统。当凝集在进行时，优选同时提取该生物材料尤其是生物材料的样品。
生物材料用溶剂以这样的方式处理将生物材料添加到溶剂，但也可能将溶剂添加到生物材料。
生物材料的凝集导致用于提取的溶剂和生物材料相分离，形成凝集的沉淀物和上清液。该上清液包括用于提取的溶剂，和已经转移至有机溶剂的成分尤其是亲脂t^成分。由此该生物材料有利地通过该凝集形式与存在于上清液的提取成分相分离。该生物材料形成凝集的沉淀物，而所述成分位于其上方的有机溶剂中并且随后可用已知的分析技术来研究。
可能的作用机制
生物材料(如血液)和本发明采用的有机溶剂(以极性和非极性的溶剂混合物的形式)的混合导致相分离。根据其分配系数，该极性溶剂实质上进入代表水相的生物材料。由于成分，优选亲脂性成分例如膜组分和脂蛋白形式的成分，存在于水相中，该极性溶剂富集在这些结构中。该极性溶剂能渗透进入细胞膜，例如全血中红细胞的细胞膜，并与脂质部分相互作用。两种效果出现高度亲脂性成分在它们的综合体系外溶解并且可被提取至上清液。该极性溶剂在细胞膜或含脂质结构中与较小亲脂性的成分相互作用。用于该凝胶形成效果的合适的脂质是出现在细胞壁上的磷脂和脂蛋白。生物膜包含化学成分不同的大量的磷脂。
和磷脂的相互作用以及从细胞膜中除去胆固醇导致细胞膜的交联(交错
结合)和凝胶的形成。胆固醇的存在通过所谓L。(液体有序的(liquid-ordered) )相的形成增强了细胞膜的流体特性(流动性)并且阻止了交联。随着模型膜中胆固醇内容物的增加，极性有机溶剂如醇类(甲醇、乙醇、丙醇、丁醇)使膜交联降低。为了在胆固醇富集时达到类似的效果，较高的醇浓度是必要的。亚溶解浓度的表面活性物质和各种各样短链醇类也导致膜中胆固醇耗尽。通过观察到醇类提取胆固醇而不是磷脂，醇类和与膜相关的磷脂相互作用的可能性也得到支持。磷脂的提取性通常更差。
澄清溶液通过本发明的方法有利地形成为上清液，并可接受进一步分析，优选无需进一步处理。优选使用的溶剂或溶剂混合物的密度比水低，由此保证液体上清液的形成。除此以外，也可能适当使用密度比水高的溶剂，以便实现凝集的生物材料结成乳脂，这可能有利于进一步光谱研究，尤其取决于使用的样品容器。本发明的方法中优选使用具有比水低的特定密度的溶剂。
本发明方法中使用的生物材料优选在实施该方法时显示出所需要的凝集，还可能用能达到所需凝集的物质进行处理，尤其可能使用前面提到的凝胶因子或凝胶剂。
在进一步的实施方式中，所述生物材料包括尤其来源于细胞培养的植物、动物、人类和/或微生物材料。
根据本发明有可能使用所有可被提取的生物材料。
在本方法进一步的优选实施方式中，该生物材料在使用前可被预处理，尤其是纯化过程。
合适的预处理的实例为打浆。合适的打浆是用匀桨器处理。应提及的匀浆器的例子为切割机，均质器设备，磨机等。从而该生物材料尺寸被减小以便增大它们的表面面积。尺寸的减小增大了提取效率。除此以外，用低温，尤其用液氮处理也是合适的。打浆有助于成分从生物材料中释放并由此可以提取。作为预处理，生物材料也能在特定洗涤过程，例如用缓冲溶液，除去杂质和/或干扰物质。
在本方法进一步优选的实施方式中，组织、器官和/或体液可用作生物材料。
优选使用的生物材料是医疗部门用于治疗的诊断和/或检测的那些生物材料。
在本方法进一步优选的实施方式中，使用的体液为血液、血浆、血清、尿液、羊水、子宫液、卵泡液、滑液、精液、肺液和/或分泌物。
所述分泌物优选奶液、汗液、泪液、唾液和/或胃肠道分泌物，尤其是胆汁和/或胰汁。根据本发明有可能用血液，尤其是全血作为体液。本发明的方法中优选血液作为生物材料。至于预处理，优选用抗凝物质处理血液，尤其是用聚多糖，优选用肝素和/或类肝素。还可能使用抗凝血酶III作为抗凝血剂，尤其是以肝素-抗凝血酶络合物的形式。此外，还可使用外源性抗凝血
剂。合适的外源性抗凝血剂尤其为维生素K拮抗剂或钙络合剂。应特别提到的维生素K拮抗剂是香豆素，而应特别提到的钙络合剂是柠檬酸、草酸、优选乙二胺四乙酸(EDTA)。
本发明的方法有利地避免了血液尤其是血细胞的溶血。根据本发明血的凝集导致血细胞被嵌入一凝胶状环境中，从而避免溶血。
进一步有利的是，提取可通过振动手动地进行，尤其是避免溶血的小心的振动。还可能用到辅助手段帮助溶剂提取血液，尤其是振动台，振动装置，竖直转子，磁力搅拌器和其它搅拌技术。手动混合的优点在于可进柠独立的萃取而与电流或电器设备的来源无关。
在本发明进一步优选的实施方式中，动物和/或蔬菜来源的食品，尤其食品匀浆，可以用作生物材料。
合适的食品尤其鸡蛋，优选整个蛋黄，水果，蔬菜，尤其胡萝卜，和/或鱼类和/或肉。除这些之外，本发明的方法可用来研究食品汁，尤其水果和/或蔬菜汁，优选胡萝卜汁。
优选地适用于本发明方法的食品包括人类饮食必不可少的成分，优选亲脂性成分。
在本方法进一步优选的实施方式中，有机溶剂采用极性质子溶剂，尤其醇类。
在本方法进一步优选的实施方式中，极性质子溶剂选自甲醇、乙醇、1-
丙醇、2_丙醇(异丙醇)、丁醇、戊醇、己醇及其混合物。
本发明的方法中，醇的使用出人意料地产生了生物样本的凝集现象。优
选使用乙醇和2-丙醇(异丙醇)的混合物。
在本方法进一步优选的实施方式中，至少有一种极性非质子溶剂用作有
机溶剂，尤其使用酯类，优选乙酸乙酯。
除了优选的极性质子溶剂之外，本发明方法中还有可能有利地使用极性
非质子溶剂。
在本方法进一步优选的实施方式中，使用腈类，优选乙腈作为极性非质子溶剂。
在本方法进一步优选的实施方式中，使用酮类，优选丙酮作为极性非质子溶剂。
在本方法进一步优选的实施方式中，使用DMSO (dimethyl sulfoxide)和/或DMF (N,N-dimethylforaiamide)作为极性非质子溶剂。
在本方法进一步优选的实施方式中，使用醚类，尤其二乙醚作为极性非质子溶剂。这里所述的溶剂有助于凝集生物材料，根据生物材料的性质，极性溶剂优选地是混合物的形式。
本方法进一步优选的实施方式中，至少使用一种非极性溶剂，尤其是烷
烃，优选C5-C12的垸烃作为非极性溶剂。 ^
本方法进一步优选的实施方式中，使用正己烷，庚烷和/或辛烷，尤其异辛烷，作为非极性溶剂。
本方法进一步优选的实施方式中，使用芳香族化合物，尤其苯和/或甲苯作为非极性溶剂。
所述非极性溶剂在本发明方法中作为所述成分，尤其是亲脂性成分的提取剂。
根据本发明，适当时可能使用有机溶剂分子的衍生物或异构体。该溶剂可以是无水的、含水的、分枝的、无分支的、环状的、非环的、卤化或非卣化的。
极性或非极性溶剂的区分可以从本领域中各个角度进行。例如，可适用化学的极性或溶剂行为的定义。
除这些以外，实践中可使用根据斯奈德或凯勒(Snyder or Kdler，斯奈德，吸收色谱原理，戴克，纽约，1968;凯勒，分析化学，海姆，1998， 195页)的极性指数来分类溶剂或溶剂混合物。因此，极性溶剂或溶剂混合物是指根据斯奈德的极性指数为4-8，尤其是4-7，优选5.5-6.5的溶剂或溶剂混合物。极性溶剂举例为水，尤其是水溶液。极性非质子溶剂举例为丙酮、乙腈、乙酸乙酯、二甲基亚砜或N， N-二甲基甲酰胺。极性质子溶剂举例为具有l-6个碳原子的烷基的醇类，如甲醇、乙醇、l-丙醇、2-丙醇(异丙醇)、丁醇、戊醇或己醇。
非极性溶剂或非极性溶剂混合物是指极性指数比参考溶剂或参考溶剂混合物小0.3或小更多的溶剂或溶剂混合物。优选极性指数小0.5，尤其是极性指数小1，更优选极性指数小2以上。因此，根据斯奈德，所述非极性溶剂或溶剂混合物的极性指数值为5-1,尤其为2-4，优选为3.5-2.5。例如，根据斯奈德，60%甲醇/40%二氯甲垸溶剂混合物的极性指数为3.1。因此，合适的非极性溶剂的例子为卤化溶剂，如氯仿、二氯甲垸或四氯甲烷。还应提到的有脂肪族溶剂，如戊烷、己烷、庚垸或环己垸。除这些以外，还应提到芳香族溶剂如甲苯或苯作为非极性溶剂。同样合适的还有醚类，如二乙醚、叔丁基甲醚或四氢呋喃。
在本方法进一步优选的实施方式中，溶剂以溶剂混合物的形式，尤其是以包括极性难非极性溶剂的溶剂混合物的形式使用。
所述极性和非极性溶剂优选以1: 1的比率，尤其以1: 2的比率，更优选以l: 10 (极性/非极性)的比率使用。
该量度具有的优点是溶剂混合物可根据生物材料的特征来制备。以这种方式可能处理大量的分离问题。
在本方法进一步优选的实施方式中，还使用表面活性剂，尤其是非离子表面活性剂。
在本方法进一步优选的实施方式中，使用共聚物，尤其是聚乙烯氧化物和聚丙烯氧化物的共聚物作为表面活性剂。
发现的有利结果是，通过添加表面活性物质，即所谓的表面活性剂可延迟凝胶形成。由于凝胶形成的延迟，有机化合物和生物材料之间有更长的时间经历凝胶化。成分的提取得到改善，尤其是亲脂性成分的提取。成分，尤其是亲脂性成分的改善的提取，对于血液来说可能来源于该成分从细胞膜的转移，尤其对于脂质来说是从蛋白结合的转移。表面活性剂的应用有利地导致待研究的上清液中成分的光谱性质的改善，优选增加该成分的吸收。
优选使用的表面活性剂是可溶于溶剂混合物、没有毒性和/或对上清液中成分的分析没有影响的那些表面活性剂。优选保持成分的吸收和/或荧光的可测性不受损害的表面活性剂。
所述表面活性剂优选以防止血液溶血的浓度使用。使用的有利的表面活性剂为共聚物，尤其是聚乙烯氧化物和聚丙烯氧化物的共聚物。合适的共聚
物表面活性剂的例子为商业上可获得的普朗尼克(Plunmic)表面活性剂，优选Pluronic 101。
在进一步优选的实施方式中，生物材料用有机溶剂以1: 50的比率，尤其以l: IO的比率，优选以l: 3的比率处理。
根据生物材料的特性和有机溶剂的提取能力，适当时可能选择生物材料与有机溶剂的更大或更小的比例，而这尤其取决于随后的分析。选择优选比例以便在成分的分析中分别考虑检测限和定量限。在进一步的实施方式中，该方法是在5"C-6(TC温度下进行，优选10°C-40°C。
在进一步的实施方式中，该方法是在0.5bar-5bar压力下进行，优选0.8bar-2bar。
该方法从理论上讲可在预期形成凝胶的温度和/或压力范围下进行。此外，必须考虑溶剂性质，尤其是熔点、沸点、闪点。根据本发明，该方法是在室温和大气压力下实施。
在该方法进一步优选的实施方式中，生物材料被处理约10s-10min，优选10s-5min，更优选10s-3min，以提取所述成分。
根据本发明有利的是生物材料的凝集与成分的提取同时进行。通过用溶剂混合物处理生物材料，凝集时段可被控制在所需的方式。凝胶因子的添加縮短提取时间，而表面活性剂的添加延长提取时间。令人惊讶的发现是，经过本发明的方法处理，生物材料，尤其是血液，优选全血，在几分钟之内被凝集。完全通过重力，通过生物材料下沉至底部而形成凝集沉淀物，并在它上面形成上清液。如果需要，上清液可简单地去除。溶解于上清液中的生物材料的成分将接受更详细的分析。没有必要通过离心和/或过滤从提取物中分离生物材料。根据本发明实施的方法的有利结果是节省了分析的时间。优选地，生物材料在用有机溶剂处理前转移至抗溶剂(solvent-resistant)的环境。在进一步优选的实施方式中，使用的抗溶剂环境是具有疏水性表面的容器，尤其是具有经硅垸化使其疏水的表面的容器。
在进一步的实施方式中，使用具有疏水性表面的容器，尤其是塑料容器，优选由聚丙烯制成。
有利地，本发明的方法可能使用具有疏水性表面的容器。对于玻璃容器，疏水性表面可以通过玻璃表面的硅垸化或者用氢氟酸蚀刻产生。除了这些以外，本发明的方法中还可能使用塑料容器，优选由聚丙烯制成。还有可能使用复合材料作为容器，尤其是塑料涂层旳容器。优选使用的容器具有适合光谱研究的特征。
在该方法进一步优选的实施方式中，所述成分在提取前被转化为亲脂性形式和/或被亲脂性地修饰。
上清液优选用于亲脂性成分的研究。亲脂性成分在生物材料中可能以受束缚的形式存在，尤其是以物理和/或化学束缚的形式。除此之外，研究具有疏脂的或亲水性质的成分也可能很有意义。
成分的亲脂化可通过化学和/或物理手段有利地实现。对于化学上产生的亲脂化应提到生成确定产物的酶-底物反应。提到的例子是由脂肪酶引fe的脂肪酸酯的裂解或由其它酶引起的亲脂性地修饰底物的反应。因此，例如，尽
管染料为亲脂性，与染料分子如Dabcyl-NHS酯耦合的淀粉分子仍然易溶于水。淀粉大分子被淀粉酶引起的消化力逐渐降解成较小的单元。这导致亲水部分的尺寸减少，并且整个分子变得更加亲脂，直至染料分子主导溶解性质并转移至有机相。物理方法产生的合适的亲脂性是结合到亲脂性物质上。例如，亲水性物质可以与抗体结合，该抗体通过它们的亲脂性部分，为这样的整个络合物带来亲脂性。另外还可能使用螯合剂作为亲脂分子。例如，铁通过与亲脂螯合剂结合从血液进入有机相，并且可在有机相中进行分析。
在该方法进一步的实施方式中，至少一种成分包含碳水化合物、脂质、核酸、蛋白质、宏量元素、微量元素和/或维生素。
合适的碳水化合物是糖类，尤其是多糖，优选单糖。合适的脂质是脂肪酸类，甘油三酯类(三酰基甘油酯，甘油的脂肪酸酯)，甘油磷脂类如磷脂
酸、卵磷脂、心磷脂、縮醛磷脂等；鞘脂类如鞘氨醇、神经酰胺、神经鞘磷脂和神经鞘糖脂；类异戊二烯(萜类)如类固醇，尤其是类固醇衍生物，类胡萝卜素等；蜡类(长链脂肪醇的不饱和脂肪酸酯)和脂多糖类(革兰氏阴性菌细胞表面的成分)。合适的维生素的例子为亲脂性的维生素，尤其是维生素A、维生素D、维生素E和/或维生素K。除此之外，维他命源、profactors和/或维甲酸类(维生素A的衍生物)也可作为合适的成分。脂质优选为甘油三酸脂、脂肪酸、胆固醇和/或胡萝卜素，尤其是(3-胡萝卜素。关于成分应特别提到激素，其出现在多种物质种类中。
在本方法进一步优选的实施方式中，成分为次级植物成分。合适的次级植物成分为生物碱、黄酮类和/或类胡萝卜素，尤其是叶黄素和/或胡萝卜,素，优选P-胡萝卜素。通过本发明方法获得的所有的生物材料成分可随后进行分析。这尤其包括上述成分的衍生物。
在本方法进一步优选的实施方式中，所述成分用光谱法，尤其是比色法，优选荧光测定法研究。所有己知或者未知的分析技术适用于随后成分的分析。成分的分离，例
如通过色谱方法，尤其用高效液相色谱法(HPLC)，将有利于进一步分析。 上清液方便地接受通过光谱研究成分的分析方法。合适的光谱法是通过与电 磁辐射如NMR、 IR、紫外可见、激光拉曼先谱相互作用来研究成分。除此之 外，可以使用所有已知的质谱方法。
本发明还通过将有机溶剂或有机溶剂混合物用于分析生物材料的成分， 解决了潜在的技术问题，其中该分析是用于疾病，尤其是代谢紊乱症和/或营 养失调症的诊断和/或治疗的监测。
代谢紊乱症和/或营养失调症通常导致人类或动物有机体中物质的过多或 缺乏，尤其是物质的缺乏。由此可能会导致疾病。本发明可用于诊断这类疾 病。本发明尤其可有利地进行治疗的监测，尤其用于分析为治疗使用的药理 活性成分和/或营养物，优选用于监测营养物的补充。
所述成分优选本质上为亲脂性的物质。
本发明还通过提供一种分光光度计，尤其是手持光度计(hand photometer)，解决了潜在的技术问题，用于在一个圆柱形容器中测量生物材 料的成分，通过调整光度计的光路使得测量覆盖容器的上半部。
在本发明上下文中，圆柱形容器是指侧面在其整个长度上保持相同的容 器。保持相同的合适的侧面可以是矩形截面，尤其是正方形截面，象光谱池 中使用的一样。用于测量生物材料的成分的容器可在其中有利地实施本发明 的方法。成分的分析最好在提取后进行，无需在本发明的分光光度计中拖 延。
总的说来，本发明使得从生物材料中提取成分成为可能，并进一步简化 了该成分的分析。血液的分析从而被简化。在实施本发明的方法的时候，温 度几乎不发生可测量的变化，并且没有观察到血液的溶血现象。此外，复杂 的分离步骤，如样本的过滤和/或离心是不需要的。该发明可一步完成。因 此，它特别适用于微型化的方法，尤其是以实验室芯片的形式为人所知的高 通量方法，并优选用在所谓的即时照护系统中。
通过实施例结合附属的权利要求，从以下优选实施方式的说明中可明显 看出本发明进一步的特点与优点。就此而论，该独有的特点可单独实施或与 其它若干特点相互结合而实施。
具体实施例方式
以下通过选择的示范性实施方式结合附图，对本发明做详细的说明和解 释。其中
图1:来自牛血清的P-胡萝卜素在紫外可见区被溶血污染所得的光谱 (紫外-可见光谱)，
图2:与图1相比较的来自牛血清的卩-胡萝卜素的紫外可见光谱，但无 溶血，
图3:根据本发明从人全血提取类胡萝卜素后的HPLC色谱图，
图4:在添加表面活性剂的影响下，根据本发明的P-胡萝卜素提取物的 列表比较，
图5:含有两种溶剂的溶剂混合物及其对P-胡萝卜素、视黄醇和生育酚 的回收I的影响，
图6:含有三种溶剂的溶剂混合物及其对(3-胡萝卜素、视黄醇和生育酚
的回收n的影响，
图7:根据本发明所得的血清提取物和全血提取物的比较
图8:提取中使用不同乙醇:异丙醇溶剂混合物的各种成分的回收III，以
及
图9:血液在表面不疏水的容器和具有疏水表面的容器中的凝集。 实施例
全血中维生素A 、维生素E和类胡萝卜素的提取和测定
首先用抗凝血剂。优选乙二胺四乙酸(EDTA)使来自牛、马、狗、 猫、蝙蝠或人的全血不能凝集，然后将全血样本放入塑料管(聚丙烯，PP) 或表面处理过的(硅垸化的)玻璃管，再将该样本与有机溶剂的混合物相混 合。使用注射器或吸液管将极性和非极性溶剂的混合物(乙醇/异丙醇/异辛
烷；1: 4: 10)添加到容器的血液中。将以这种方式获得的混合物小心地用
手强烈振动10s。血液样本显示出粘度增加。然后沉淀5min发生相分离。2 至3分钟后，重复振动和静置。在管的下部形成血液样本的凝胶状凝集，有 机相在管的上部形成为上清液。有机相实质上包括异辛烷和从血液中提取的成分。有机相由于提取的类胡萝卜素而呈微黄色。样本中的着色更加强烈， 取决于类胡萝卜素的浓度。上清液可以在分光光度计中直接测量，或者先用 吸液管移除，浓縮，置于适当溶剂，然后用例如高效液相色谱法(HPLC ) 测量。
血清中维生素A、维生素E和类胡萝卜素的提取和测定
继续上述的测试程序以及上清液的测量。 初乳中维生素A、维生素E和类胡萝卜素的提取和测定
用牛或人的初乳作为生物材料。测试步骤和测量按如上进行。 肝组织中维生素A、维生素E和类胡萝卜素的提取和测定
将肝组织经已知方法通过紫外线处理在缓冲液中匀浆化。 用粘的匀浆流体作为生物材料，测试步骤和测量按如上进行。 全血、血清、初乳或肝组织中的胆固醇的提取和检测
首先将亲脂性成分用前面例子所述的有机上清液提取。然后在等份的有 机提取液中用已知的酶方法测定胆固醇。 全血、血清或初乳中非酯化脂肪酸(NEFA )的提取和检测
首先将亲脂性成分按照前面实施例所述提取到有机上清液。NEFA先与 铜络合，随后用显色反应检测该脂肪酸铜络合物。在分光光度计中测量该显 色反应。该方法中所有步骤有利地是在相同的提取管中进行。使用的铜试剂 为铜-三乙醇胺溶液的混合物(1MTEA、 1N乙酸、6.45% Cu(N03)2， 9:1:10 v/v)。在全血明显的凝集发生后，将铜试剂添加到有机上清液。强烈振动 20s并培养约30分钟，接着向上清液中添加显色剂(溶于甲醇的0.5%的二苯 卡巴腙和二苯卡巴肼(5: 95%)溶液或0.5%的二苯卡巴腙强溶液)并振 动。在分光光度计中550nm处测定颜色变化。
脂肪酶活性的检测
为了检测全血或血清的脂肪酶辨性，首先为全血样本或血清样本提供底 物。使用的底物是在胆汁酸中乳化过的含荧光脂肪酸的脂肪酸酯。样本中存 在的脂肪酶分解底物。孵育该样本，接着用所述溶剂混合物之一提取它，并 测量释放的标记的脂肪酸。信号强度与酶在血液中的浓度成正比。
图1
图1显示了提取自牛血清样本(BS73 ， BS75 ， BS76 , BS79 ， BS80 )的P-胡萝卜素在波长360nm-580nm范围内的5种不同的紫外-可见光 谱。用现有技术方法从血液样本中除去血细胞并获得血清。在血清中直接测 量P-胡萝卜素。预计在这种提取物中，P-胡萝卜素的特征谱带通常在450nm 和480nm，并且425nm处有轻微肩峰。所有样本均产生被红细胞溶血损害的 光谱。结果发现，特征谱带转移至较大波长。其中三个样本被溶血严重污染 使得由于强的血清着色而不可能做出评估。 图2
图2进一步显示了 |3-胡萝卜素的5种紫外可见光谱。|3-胡萝卜素是从图1 所述的牛血中获得，但从全血中的提取是用本发明的方法进行。此时在所有 的样本中仅看见典型的(3-胡萝卜素的光谱。 图3
图3显示了用本发明方法所得的提取物的HPLC色谱图。类胡萝卜素的 提取物是从人全血中获得。对应以分计的保留时间来绘制吸收单位。获得以 下信号，称为"峰"1=叶黄素，2=玉米黄质，3=角黄素，4 = 3-隐黄质，5 -a-胡萝卜素和13-顺-(3-胡萝卜素，6 = 6-胡萝卜素，7 = 9-顺-(3-胡萝卜素，8 和9 =番茄红素的顺式异构体形式，10 =反-番茄红素。这些信号实质上是对 称的，即实质上没有所谓的信号拖尾(峰尾)，以及某些情况下的基线分 离。 图4
图4显示了一份表格，说明(3-胡萝卜素浓度作为不同表面活性剂添加物 的函数的曲线图。使用的表面活性剂是不同浓度(0.1%-3.0%)的Pluronic 101。将表面活性剂以所述浓度添加到等份的两种不同的牛血样的样本。用分 光光度计测定卩-胡萝卜素的吸收，并以mg/1计的平均士标准偏差计算(3-胡萝 卜素的浓度。表面活性剂浓度的增加在两种血液样本中均导致提取物中P-胡 萝卜素浓度的增加。 图5
图5显示了 oc-生育酚(维生素E)、视黄醇(维生素A)和卩-胡萝卜素回收的实验结果。牛全血是等分成四份并通过本发明的方法提取。每等份包
括25(^1。以下溶剂混合物按所述体积比用于提取1=乙醇/异辛烷(1:2 V/V) ， 2 =甲醇/异辛烷(1:2 V/V) ， 3 =乙酸乙酯/异辛烷(1:2 V/V) ， 4 = 异丙醇/异辛烷1l:2 V/V)。用高效液相色谱法作为标准分析。视黄醇作为分 析物被测定时，其回收率在甲醇/异辛烷混合物中为65%的最小量和异丙醇/ 异辛烷混合物中88%的最大量。(x-生育酚是以在乙酸乙酯/异辛烷混合物中 21%的最小量，和在异丙醇/异辛烷混合物中107%的最大量被回收。在溶剂 混合物1-3中P-胡萝卜素所测的回收率比其它分析物差，为13%的最小量和 40%的最大量。结果发现所有组分在异丙醇/异辛垸混合物中为最佳回收。 图6
图6显示了 a-生育酚(维生素E)、视黄醇(维生素A)和p-胡萝卜素 的回收实验结果。回收按图5的说明中所示方法进行。使用溶剂混合物5-11:其中5=乙醇/异丙醇/异辛烷(1:1:4; V/V) ， 6 =甲醇/异丙醇/异辛烷
(1:1:4; V/V) ， 7 =乙酸乙酉旨/异丙醇/异辛烷(1:1:4; V/V) ， 8 =水/异丙醇 /异辛垸(1:1:4; V/V) ，9 =氯化钠溶液(0.9%) /乙醇/异丙醇/异辛烷
(1:1:4; V/V) ， 10=N 丁醇/异丙醇/异辛烷(1:1:4; V/V) ， 11 =异丙醇/异 辛烷(2:4; V/V)。用溶剂混合物5-10与溶剂混合物11相比较，溶剂混合 物11对应于图5中的溶剂混合物4，但此处为两倍量。此外，将各种质子溶 剂，如醇、水、盐水溶液加入到"碱性异丙醇/异辛烷混合溶剂中。结果显示 a-生育酚和p-胡萝卜素在溶剂混合物5-10中的回收率均显示出类似的减小和 增大。除了异丙醇/异辛垸作为所有组分的最佳溶剂混合物外，乙醇/异丙醇/ 异辛烷混合物也对所有组分表现出高的回收率。 图7
图7显示了常规的血清提取物和本发明方法的全血提取物的提取结果的 比较。所研究的分析物是来自奶牛的IO个不同的血液样本中的p-胡萝卜素。 对于所有血液样本，本发明方法中的分析物的回收实质上与经典方法相同。 图8
图8考察了乙醇/异丙醇/异辛垸溶剂混合物中乙醇/异丙醇的溶剂比率对 分析物a-生育酚(维生素E) /视黄醇(维生素A )和(3-胡萝卜素的提取的影 响。图表数据指以pl计的各极性溶剂的量。用1^1作为非极性溶剂异辛烷的量，采用的牛全血样本为250^1。
图9
图9显示了容器表面对血细胞粘附与凝集结果的影响。图9A显示在未 处理表面的容器中的提取，而图9B为在表面经硅烷化疏水处理的容器中的 提取。图9C说明了通过翻转管，约10min后血细胞的完全凝集。
在来自奶牛和马的血液样本中，各分析物的平均回收率为ct-生育酚(维 生素E) 106%，视黄醇(维生素A) 89%， (3-胡萝卜素为95%。
权利要求
1、一种分析来自生物材料的成分的方法，尤其是分析脂质和/或维生素和富含该成分的生物材料，其中所述生物材料用至少一种有机溶剂处理提取所述成分，所述生物材料在提取中被转化为凝集的形式，以形成凝集的沉淀物和液体有机相的上清液，并研究提取到上清液的成分。
2、 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述生物材料包括尤其得自细胞培养的植物、动物、人类和/或微生物材料。
3、 如权利要求l或2所述的方法，其特征在于，所述生物材料在使用前 被预处理，尤其是纯化处理。
4、 如前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，用组织、器官和/ 或体液作为生物材料。
5、 如权利要求4所述的方法，其特征在于，用血液、血浆、血清、尿 液、羊水、子宫液、卵泡液、滑液、精液、肺液和/或分泌物作为体液。
6、 如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，用动物和Z或蔬 菜来源的食品，尤其是食品的匀浆作为生物材料。
7、 如前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，以极性质子溶剂， 尤其是醇类作为有机溶剂。
8、 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述极性质子溶剂选自甲 醇、乙醇、l-丙醇，2-丙醇(异丙醇)、丁醇、戊醇、己醇及其混合物。
9、 如权利要求l至6任一项所述的方法，其特征在于，尤其以烷烃，优 选C5-C12的烷烃，作为非极性溶剂。
10、 如权利要求9所述的方法，其特征在于，以正己烷、正庚烷和/或辛 烷，尤其是异辛烷，优选其混合物，作为非极性溶剂。
11、如前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述溶剂以溶剂 混合物的形式，尤其是以包括极性和非极性溶剂的溶剂混合物的形式使用。
12、 如前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，还使用表面活性 剂，尤其是非离子表面活性剂。
13、 如权利要求12所述的方法，其特征在于，以共聚物，尤其是聚乙烯 氧化物和聚丙烯氧化物的共聚物，作为表面活性剂。
14、 如前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述生物材料用 有机溶剂以l: 50比率，尤其是l: IO的比率，优选l: 3的比率处理。
15、 如前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述方法在温度5。C-60。C范围，尤萁在10。C-40。C范围进行。
16、 如前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述方法在压力 0.5bar-5bar之间，尤其在0.8bar-2bar之间进行。
17、 如前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，将所述生物材料 处理IO秒-IO分钟，尤其10秒-5分钟，优选10秒-3分钟，用于提取所述成 分。
18、 如前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述成分在提取 前被转化为亲脂性形式和/或被亲脂性修饰。
19、 如权利要求18所述的方法，其特征在于，水溶性成分在提取前与亲 脂性分子和/或亲脂性修饰的分子形成亲脂性复合物。
20、 如前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，水溶性成分是通 过提取由酶-底物反应获得的亲脂性或亲脂性修饰的产物来检测。
21、 如前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述成分的至少 一种包括碳水化合物、脂质、核酸、蛋白质、宏量元素、微量元素和/或维生 素。
22、 如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述脂质的至少一种包括 甘油三酸脂、脂肪酸、胆固醇和/或胡萝卜素，尤其是(3-胡萝卜素。
23、 如前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述成分通过光 谱测定法，尤其是比色法，优选荧光测定法来研究。
24、 有机溶剂或有机溶剂混合物在分析生物材料的成分中的应用，其中 该分析被用于疾病的诊断和/或治疗的监测，尤其是代谢紊乱症和/或营养失调 症。
25、 如权利要求24所述的应用，其特征在于，所述分析被用于监测药理 活性成分和/或营养物的服用，尤其用于监测药理活性成分和/或营养物的补充。
26、 如权利要求24或25所述的应用，其特征在于，所述成分实质上包 括亲脂性物质。
27、 如权利要求24或25所述的应用，其特征在于，所述成分含有在带 有亲脂性分子的亲脂性复合物中的亲脂性修饰的或水溶性的物质。
28、 一种用于在圆柱形容器中测定生物材料的成分的分光光度计，尤其 是手持光度计，其特征在于，所述光度计的光路可调整以便测定覆盖该容器 的上半部分。
全文摘要
本发明涉及分析生物材料的成分的方法，尤其是脂质和/或维生素和富含该成分的生物材料，还涉及相关的有机溶剂或有机溶剂混合物的应用，以及用于测量生物材料成分的分光光度计。本发明提出用至少一种有机溶剂处理生物材料，提取所述成分，使生物材料在提取中转化为固化的形式，由此形成固化沉淀物和成为上清液的液态有机相，并在上清液中检测所提取的成分。
文档编号G01N1/28GK101535791SQ200780041576
公开日2009年9月16日 申请日期2007年9月13日 优先权日2006年9月13日
发明者弗洛里安·史威格特 申请人:弗洛里安·史威格特