专利名称：一种含有包封物的脂质体的分离提纯方法
技术领域：
本发明涉及包含药物的脂质体的分离提纯，属于生物医用领域。
背景技术：
脂质体药物在现代医学领域受到了越来越多的重视，同时也发挥着越来越重要的 作用。脂质体包封药物不仅可以有效地提高药物的生物活性，还可以通过靶向的方法改进 并调控药物的吸收及释放，防止敏感药物的破坏，减少副作用等等。脂质体作为药物的载 体，可以包封亲水、疏水药物及蛋白和核酸，已经被广泛应用于治疗癌症，抗菌，疫苗和基因 治疗等多个生物医用领域。将药物包封在脂质体内常用的方法是将药物在脂质体制备的过程中混入，或是在 脂质体形成后利用融合将药物包封其中。这些方法根据包封药物性质的不同，脂质体的组 成、尺寸及制备方法的不同，包封率不尽相同，一般为20% -70%。剩余的药物残留在脂质 体外，不能很好的被吸收利用，同时会增加药物的副作用，降低药物的有效利用率。从而不 能使脂质体这种药物载体的优点得到充分的发挥。有效地将脂质体与未被包封的药物进行 分离，是提高药物利用率，降低药物毒性的必然选择和有效手段。目前常用的分离手段主要包括凝胶管柱层析法和离心沉降法。这两种方法在本质 上都是利用重力进行分离，适用于分离密度梯度差别较大的脂质体与小分子药物的体系。 对于凝胶管柱层析法而言，由于色谱柱本身对脂质体有吸附，因此在实际操作中需要预先 用空白的脂质体将色谱柱进行饱和，这就造成磷脂原料的大量消耗；而对于离心沉降法而 言，因为脂质体与包封药物的分子量差别不大，因此往往需要较高的转速和较长的时间，不 仅需要较高转速的离心机，而且费时费力效果不佳。
发明内容
为了克服现有分离手段存在的诸多不足，本发明旨在提供一种将脂质体与未被包 封的药物分离的新方法，不仅分离效率高，而且操作简便。本发明采取的方案如下步骤一根据包封药物的类型及所需脂质体的大小，选择合适的方法将药物包封 在脂质体内；步骤二 根据脂质体的大小类型，制备适当浓度的高分子凝胶；步骤三根据包封药物与脂质体的带电性质选择设定合适的pH、温度、盐度和分 离电压，利用电泳来实现脂质体与未被包封药物的有效分离。步骤四进一步通过电洗脱、透析等方法实现脂质体与未被包封药物的回收再利用。本发明利用凝胶电泳将脂质体与未被包封的药物分离的方法与现有技术相比，具 有如下特点1)当脂质体与包封物的电荷密度不同时，在电场存在下，可以实现脂质体与未被包封的药物的有效分离；如中性脂质体包封了带电的小分子药物或高分子(如DNA、siRNA 或者蛋白)，则在电场的作用下，包封物自身的迁移率高于脂质体，在凝胶电泳中，表现为迁 移的距离不同，因此可以将两组分分开。脂质体和包封物的电荷密度可以通过溶液PH进行 调节，使二者的差距变大，图1为利用动态光散射(30° )测得的分离前后脂质体的流体力 学半径。2)以高分子凝胶为介质，可以通过改变凝胶的孔径实现对不同尺寸、不同类型脂 质体与未被包封药物的分离；3)适用范围广，不仅可用于小分子药物的分离，还适用DNA、siRNA和蛋白；4)分离电场强度大小可调，根据脂质体与药物的性质选择最佳分离条件；5)分离技术操作简便，分离后脂质体及未被包封的药物可实现高效回收。
图1为利用动态光散射(30° )测得的分离前后脂质体的流体力学半径。图2为实施例一最终的电泳照片。从左至右分别为，包封了模型药物的脂质体，后 加入5%模型药物的脂质体与未利用脂质体包封的单纯的模型药物。照片中，白色为含有钙 黄绿素的部分，灰色为背景。照片从下到上为从负极到正极。左下方的部分即为包封了药 物的脂质体的部分，其他为自由的药物。
具体实施例方式实施例一、以包封物为带负电的小分子(如常用模型荧光分子钙黄绿素、常用止 痛药布洛芬)为例1、电泳缓冲液的配制将Tris(10. 78g)、硼酸(5. 50g)、EDTA(0. 74g)在 IOOmL 水中充分溶解，用孔径 0. 45um的滤膜过滤后得到电泳缓冲液的贮存液。稀释20倍使用。2、药物模型溶液的配制这里选取钙黄绿素作为模型药物分子来测试本方法的分离效果。钙黄绿素的分子
结构式为
它不是实际使用的药物，没有药效。但
是因为有荧光，方便表征。将钙黄绿素(311mg，0. 5mmol)加入5mL电泳缓冲液中，搅拌均勻 至钙黄绿素全部溶解后，滴加4mol/L的NaOH溶液调节pH为7. 4。最后用电泳缓冲液至定 容为10mL，此时钙黄绿素的浓度为0. 05mol/L。 其他药物如布洛芬，其分子结构式为
配制与钙黄绿素溶液相同.
布洛芬溶液的
4
3、将药物包封在脂质体内的制备方法包封了药物的脂质体的制备方法有反相溶剂蒸发法、薄膜水化超声法和聚碳酸酯 膜挤出法等。这里以薄膜水化超声法为例来对药物进行包封。具体如下将二棕榈酰磷脂 酰胆碱(59mg，0. 080mmol)及胆固醇(31mg，0. 080mmol)充分溶于20mL氯仿中，而后利用旋 转蒸发仪将氯仿除去，得到磷脂薄膜。这个过程可加入20g直径为0. 5cm的玻璃珠，以增加 薄膜面积。在真空烘箱中静置至少过夜以除去残余的氯仿。然后加入事先加热到45摄氏 度的IOmL缓冲溶液或者溶解了药物模型的溶液，振荡20分钟至混合均勻后，用探头式超声 机超声至溶液澄清。4、高分子凝胶的配制可用于制备凝胶的高分子包括聚甲基丙烯酰胺、琼脂糖、Pluronic (普流尼克) F127、壳聚糖、透明质酸衍生物、海藻酸钠等。这里仅以琼脂糖为例来制备分离用的凝胶。称 取琼脂糖0. 5g(所需要的量与凝胶的网孔相关)加入到盛有50mL电泳缓冲液的烧瓶中，在 沸水浴中加热至琼脂糖充分溶解。在琼脂糖溶液稍冷却时，倒入托盘中，用合适的梳子形成 加样孔。待凝胶溶液完全凝结，取出梳子，将凝胶安放到电泳槽内。加电泳缓冲液至刚好没 过凝胶1mm。5、含有药物模型的脂质体的凝胶电泳分离在对脂质体进行凝胶电泳分离时，合理的温度、缓冲液的pH及盐浓度、及分离电 压等参数应处于合适的范围，以保证分离的效果。具体的参数设定要综合考虑脂质体、脂质 体内容物、凝胶体系的类型。当以二棕榈酰磷脂酰胆碱作为脂质体，分离的温度应控制在 脂质体的转变温度40°C以下，否则温度过高，脂质体内容物大量渗透，造成脂质体包封率下 降。选择Tris-硼酸盐缓冲液，PH为7.5-7.8，保证脂质体处于不带电的状态，与内容物的 带电性质反差较大，分离效果最好。分离电压控制在5-10V，既保证了带电内容物的迁移，又 保证了脂质体结构的稳定。用吸管将样品缓慢加至凝胶的加样孔，关好电泳槽盖，接好电极插头。本方案选用 的药物模型钙黄绿素携带负电荷，因此将样品加入负极。电泳开始后，药物模型向正极泳 动。在5V/cm的电压下，电泳进行1.5小时后，钙黄绿素迁移到适当距离停止了电泳。关上 电源，打开电泳槽盖，可以看到琼脂糖凝胶上呈不同颜色。6、含有药物模型的脂质体及药物的提纯回收将琼脂糖凝胶上不同颜色的部分割下，放入透析袋中透析1天，即得到了不含游 离药物的脂质体，同时也可实现未被包封的药物的回收再利用。实施例二、以包封物为带正电的小分子(如常用抗癌药物阿霉素)为例
权利要求
1.一种含有包封物的脂质体的分离提纯方法，其特征在于，包括如下步骤1)制备含有包封物的脂质体；2)制备高分子凝胶；3)使用凝胶电泳法将包封药物的脂质体与未被包封物分离。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述包封物为带电的小分子药物 或高分子，如DNA、siRNA或者蛋白。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中，制备脂质体的方法选自下列方法 之一反相溶剂蒸发法、薄膜水化超声法或聚碳酸酯膜挤出法。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述高分子凝胶选自聚甲基丙烯 酰胺、琼脂糖、Pluronic (普流尼克)F127、壳聚糖、透明质酸衍生物或海藻酸钠中的一种。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，分离的温度控制在脂质体的转变 温度以下。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，选择缓冲液的pH及盐浓度使脂 质体与包封物的带电性质反差大，分离电压控制在5-10V。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)后，进一步通过电洗脱、透析等方法 实现脂质体与未被包封药物的回收再利用。
全文摘要
本发明公开了一种利用凝胶电泳分离提纯含有包封物的脂质体的方法，属于生物医用领域。该方法首先制备含有包封药物的脂质体，然后制备高分子凝胶，使用凝胶电泳法分离脂质体与未被包封的药物。本发明与现有技术相比，具有如下特点1)利用不同组分在电场下的迁移率不同，实现脂质体与未被包封药物的有效分离；2)以高分子凝胶为介质，通过改变凝胶的孔径实现对不同尺寸、不同类型脂质体与未被包封药物的分离；3)适用范围广，不仅可用于小分子药物的分离，还适用DNA、siRNA和蛋白；4)分离技术操作简便，分离后脂质体及未被包封的药物可实现高效回收。
文档编号A61K9/127GK102113998SQ201110045389
公开日2011年7月6日 申请日期2011年2月24日 优先权日2011年2月24日
发明者刘赟, 周纪寒, 夏玉琼, 孙建波, 杨旭燕, 梁德海, 牛林, 苏翠翠, 郑萃 申请人:北京大学