专利名称：一种用于分离抗栓物质的定向进化方法及其分离的抗栓物质与纯化方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体的说涉及一种定向进化方法及其分离的抗栓物质和初步纯化方法。
背景技术：
血栓会导致冠心病和卒中。冠心病和卒中是当今世界人类非自然死亡的主要病因之一。在我国，每年因此死亡的的病人达二百万左右，占我国所有疾病总死亡人数的31％(中华人民共和国卫生部，2003年中国卫生统计提要)。因此而出现后遗症的人数更多，给患者及其家属造成了巨大的痛苦和经济负担。随着生活压力及生活方式的改变以及社会的日趋老龄化，这类疾病的发病率还有逐年增长的趋势。血栓栓塞导致器官衰竭或功能障碍、致残、丧失工作能力、甚至死亡。如房颤病人每年发生脑部血栓栓塞的危险为5％左右，房颤导致的血栓占脑梗塞的10％-15％，房颤后脑卒中具有更高的致死率和致残率。寻找显效的抗血栓药物日益受到各国卫生界的重视。
分离肽类药物或肽类先导化合物是医药研究的重点之一，其主要研究方法包括噬菌体显示及相关方法、全自动化学合成等。前者有一定局限，后者比较昂贵，一般实验室不具备相应的设施和足够的经费。如果能在生物体系合成寡肽和小肽，则能大大缩小成本。现有的定向进化方法一般要求对较大的基因进行操作。一般生物可及性好的药物分子量都在几百道尔顿。如能建立高效的小肽定向进化技术，则能开发更多的功能小肽。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有定向进化方法存在的问题，提供一种高效的小肽定向进化方法。
本发明的另一个目的是提供利用上述定向进化方法分离得到的抗栓物质。
本发明的另一个目的是提供上述抗栓物质的初步纯化方法。
本发明的目的是通过以下技术措施实现的
(1)构建酵母α交配因子前导肽与部分随机肽的融合DNA片段；用于部分随机肽的分泌表达；(2)插入双酶切并用碱性磷酸酶处理的含有诱导型启动子的穿梭载体；(3)穿梭载体电激转化大肠杆菌，提取质粒后电激转化酿酒酵母；(4)转接转化子至棉子糖/半乳糖液体诱导培养基，诱导培养；(5)取培养物，离心取上清，调pH至中性，加入凝血酶，混匀；1分钟后加入纤维蛋白原，混匀；取无沉淀产生、沉淀量少或产生沉淀时间相对长的活性转化子；上述步骤(2)所述的双酶切为用EcoR I和Xba I双酶切。
上述步骤(2)所述的穿梭载体为酿酒酵母穿梭载体。
上述步骤(4)所述的诱导培养为在30℃下，摇床诱导培养7天；从酵母阳性转化子扩增插入片段，测序，或用提取的酵母质粒电激转化大肠杆菌，测序。
本发明方法适用于分离各种抗栓肽，酵母α交配因子前导肽与部分随机肽的融合DNA片段分泌表达后有一个Kex2蛋白酶酶切位点，将切下部分随机肽，分泌至胞外。本发明分离得到1个抗栓物质为DNA序列为TCCTGAGATTTTGAAGAAACGCCAGAAGAATATTTGTGA，第二个密码子为终止密码子，氨基酸序列为Ser，为丝氨酸，其具有一个潜在的糖基化位点，在酵母表达时Ser的羟基通常发生甘露糖糖基化。酵母分泌的肽一般在丝氨酸等位点进行糖基化修饰。上述DNA序列具有水蛭素C端12肽的部分随机化片段的非随机部分。但由于第二个密码子为终止密码子，因此TGA后面水蛭素C端12肽片段没有表达。本发明方法分离所得的1个抗栓物质可作为药物开发的先导化合物。
上述分离得到的抗栓物质的纯化方法，包括如下步骤(1)将强酸性苯乙烯系阳离子树脂置于交换柱内，用酸液浸泡，流出酸液，用无离子水洗至中性；(2)用碱液浸泡，流出碱液，用无离子水洗至中性；(3)加入活性转化子诱导液，静置，滤去诱导液；(4)加入双蒸水洗脱，静置，分管收集洗脱液。
上述步骤(1)为将强酸性苯乙烯系阳离子树脂置于交换柱内，用10％的盐酸液浸泡24小时，流出酸液，用无离子水洗至中性。
上述步骤(2)为用10％氢氧化钠溶液浸泡24小时，流出碱液，用无离子水洗至中性。
上述步骤(3)或步骤(4)所述的静置的时间为30分钟。
本发明所公开的新的定向进化方法包括以下具体步骤(1)构建酵母α交配因子前导肽与部分随机肽的融合DNA片段，用于部分随机肽的分泌表达。用具有高保真活性的Pfu DNA聚合酶、Pyrobest DNA聚合酶或其它具有高保真活性的热稳定的DNA聚合酶扩增，扩增模板为质粒pPICZαA(质粒pPICZαA含酵母α交配因子前导肽DNA序列，Invitrogen产品)，扩增产物用乙醇沉淀；电吹风吹干；悬浮在无菌蒸馏水里；用EcoR I和Xba I双酶切6小时至过夜；70℃热失活。
(2)用EcoR I和Xba I双酶切pYES2/CT(Invitrogen产品)过夜，同时加碱性磷酸酶CIP脱5’磷酸。70℃热失活20分钟。取双酶切的pYES2/CT，加入双酶切的PCR产物，16℃连接过夜。乙醇沉淀和70％乙醇洗涤后电激转化大肠杆菌。涂板，于30℃生长，略有毒性的基因在此温度下会因其毒性降低而提高质粒产量。
(3)提取大肠杆菌质粒，加RNase消化RNA。限制性内切酶Nde I和NotI酶切鉴定，空载体切出两个条带，有插入片断的质粒切出一个6.1kb的条带。质粒经乙醇沉淀和70％乙醇洗涤后取10μl准备做酵母电激。
(4)首先制备酵母感受态细胞。将在30℃摇床培养到OD值1.3-1.5的酿酒酵母菌离心，去上清；重悬在醋酸锂/二硫苏糖醇预处理液中，20-30℃保温1小时；用冰预冷的无菌水洗涤两次；再用冰预冷的1mol/L山梨醇中洗涤一次；重悬于0.2-0.5ml冰预冷的1mol/L山梨醇中，冰浴；每个无菌管中加80μl酵母悬浮液和100ng的DNA(总体积为10μl)及20μg ssDNA(鲑鱼精DNA)，轻轻混匀，转移至0.2-cm无菌电激杯，10℃水浴5分钟。1.8千伏、25微法、200欧姆做电激。立刻加入650μl 1mol/L山梨醇到电激杯中。轻轻混匀，转移到培养管，加650μl 2X YPD/1mol/L山梨醇，混匀之后30℃摇床培养1小时。
(5)将电激混合物涂布葡萄糖/山梨醇选择平板，于30℃生长3天；(6)接转化子和对照(仅含有空载体的转化子)至棉子糖/半乳糖液体诱导基，于30℃摇床诱导7天。因为1.5ml Eppendorf离心管透气性不好，因此，每48小时在无菌条件下开盖一次，以保证酵母生长充足的氧气。
(7)取诱导了7天的培养物，13000rpm离心1分钟，取上清。
(8)诱导液用1MTris-HCl pH7.5缓冲液调pH至7.0。取诱导液30μl，加入0.5μl(0.1单位)凝血酶，混匀。1min后加入50μl(5mg/ml)纤维蛋白原，立即混匀。观察有无沉淀的产生、沉淀量多少和记录产生沉淀时间。
(9)保存无沉淀产生、沉淀量少和产生沉淀时间相对长的转化子。
(10)从酵母转化子扩增插入片段。取生长于葡萄糖选择培养基的对数生长晚期的酵母菌，离心去上清。用双蒸水洗涤一次，13000rpm离心15秒。沉淀悬浮于TE缓冲液。在沸水上煮3min。13000rpm离心1min。将上清储存在-20℃。取3μl用来做PCR。根据载体pYES2/CT序列设计上下游引物。<3>CCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACCCCGGATCG。<4>GGCGTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATGCG。扩增条件为95℃5分钟预变性；94℃30秒，68℃2分钟，72℃30秒，4个循环；94℃30秒，68℃40秒，72℃30秒，41个循环；72℃5分钟补平。选用上海博亚公司的Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶。100μl反应加5单位Taq DNA聚合酶和2单位Pfu DNA聚合酶。扩增片段长为580bp，由上海博亚生物技术有限公司纯化并全自动测序。测序引物为<5>TAATACGACTCACTATAGGG；<6>TAGGATCAGCGGGTTTAAACTC。或用提取的酵母质粒电激转化大肠杆菌，测序。
本发明所公开的抗栓物质初步纯化方法包括以下具体步骤将50ml强酸性苯乙烯系阳离子树脂置于交换柱内，用10％的盐酸溶液浸泡24小时，流出盐酸，用无离子水洗至中性。用10％氢氧化钠溶液浸泡24小时，流出碱液，用无离子水洗至中性。加入10ml活性转化子诱导液。静置30min后，滤去诱导液。加入10ml双蒸水洗脱。静置30min，分管收集洗脱液，每管1ml。测定洗脱液抑制凝血酶的活性。取洗脱液30μl，加入0.5μl(0.1单位)凝血酶，混匀。1min后加入50μl(5mg/ml)纤维蛋白原，立即混匀。观察有无沉淀的产生、沉淀量多少和记录产生沉淀时间。
本发明的有益效果本发明的定向进化方法能够对小肽有效进行定向进化。由于对变异部分进行随机合成，因此产物具有随机性大、位点限定性强等优点。如果要进行有限的改变如氨基酸的保守性改变，也可以在合成引物时进行。一般一人一年可分离数条活性寡肽和多肽。利用该方法的原理可以进行混合多肽疫苗的研制，以对付快速变异的病毒如爱滋病病毒、禽流感病毒、口蹄疫病毒等等。
小肽一般免疫原性低。由于分子量小，生物可及性好。由于在酿酒酵母系统进行分泌表达，相当于利用真核系统进行了一个初步的生物安全性测试。而且，可以利用酵母基因工程进行生产。编码序列可以产生很多组合。在酿酒酵母系统分泌表达的蛋白和多肽经常在丝氨酸、苏氨酸和天冬酰氨位点受到糖基化修饰。而本发明分离到的抗栓物质存在甘露糖糖基化位点，并表现出了强烈抗栓活性，提示糖基化-甘露糖修饰可能与丝氨酸作为一个整体而起作用。甘露糖化丝氨酸可以作为抗栓药物先导化合物进行开发，以用来预防中风。本发明的纯化方法可以去掉培养基的无机盐离子，为进一步纯化打下基础。
图1为转化子诱导液抑制凝血酶活性结果图；图2为茚三酮显色反应定性检测空载体转化子和活性重组转化子表达诱导液所含寡肽或氨基酸的差异图；其中，图1a为空载体转化子诱导液对凝血酶抑制图，作为负对照，无效果；图1b为重组质粒转化子诱导液对凝血酶活性抑制结果图；图2a为6μl空载体转化子诱导液茚三酮显色反应；图2b为6μl活性重组转化子诱导液茚三酮显色反应；图2c为6μl 5mg/ml Ser(丝氨酸)茚三酮显色反应。
具体实施例方式
实施例1(1)构建酵母α交配因子前导肽与水蛭素C端12肽的部分随机化片段的融合DNA片段，用于部分随机肽的分泌表达。两个引物分别为<1>GCGAATTCAAAAATGAGATTTCCTTCAA。<2>CGTCTAGATCACAAATATTCTTCTGG(N)3TTCTTCAAAATC(N)6TCTTTTCTCGAGAGATAC。用具有高保真活性的Pfu DNA聚合酶扩增。扩增模板使用量为每1ml PCR反应液50ng质粒pPICZαA(Invitrogen产品，含酵母α交配因子前导肽DNA序列)。扩增条件为94℃5分钟预变性；94℃30秒，48℃30秒，72℃20秒，25个循环；72℃5分钟补平。扩增产物用1/102.5M NaAc，pH5.2和2.5倍绝对乙醇于13000rpm沉淀7分钟。用70％乙醇洗涤，13000rpm沉淀3分钟。电吹风吹干。悬浮在无菌蒸馏水里。用EcoR I和Xba I双酶切过夜，总体积为30μl。70℃热失活20分钟。
(2)5μg pYES2/CT(Invitrogen产品)用EcoR I和Xba I双酶切过夜，同时加碱性磷酸酶CIP，总体积为30μl。70℃热失活20分钟。取6.5μl双酶切的pYES2/CT，加入6μl双酶切的PCR产物，1.5μl 10X连接酶缓冲液，1μl T4DNA连接酶，16℃连接过夜。13000rpm乙醇沉淀5分钟和70％乙醇洗涤后电激转化大肠杆菌。涂板，于30℃生长。
(3)大量提取大肠杆菌质粒，加RNase消化RNA。限制性内切酶Nde I和Not I酶切鉴定，空载体切出两个条带，有插入片断的质粒切出一个6.1kb的条带。质粒经13000rpm乙醇沉淀5分钟和70％乙醇洗涤后取10μl准备做酵母电激。
(4)首先制备酵母感受态细胞。用过夜培养的酿洒酵母菌种INVSc1接种200ml YPD。30℃摇瓶培养到OD值1.3，将培养物分装在50ml离心管，5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬在总体积100ml醋酸锂/二硫苏糖醇预处理液中，25℃保温1小时。重悬在总体积200ml冰预冷的无菌水中。5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬在总体积100ml冰预冷的无菌水中。5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬在20ml冰预冷的1mol/L山梨醇中。5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬于0.2ml冰预冷的1mol/L山梨醇中。10℃温浴。每个无菌管中加80μl酵母悬浮液和100ng的DNA(总体积为10μl)及20μg ssDNA(鲑鱼精DNA)，轻轻混匀，转移至0.2-cm无菌电激杯，10℃水浴5分钟。1.8千伏、25微法、200欧姆做电激。立刻加入650μl 1mol/L山梨醇到电激杯中。轻轻混匀，转移到培养管，加650μl 2X YPD/1mol/L山梨醇，混匀之后30℃摇床培养1小时。
(5)将电激混合物涂布葡萄糖/山梨醇选择平板，于30℃生长3天。
(6)转接转化子和对照(仅含有空载体的转化子)至棉子糖/半乳糖液体诱导基，于30℃摇床诱导7天。因为1.5ml eppendorf离心管透气性不好，因此，每48小时在无菌条件下开盖一次，以保证酵母生长充足的氧气。
(7)取诱导了7天的培养物，13000rpm×离心1分钟，取上清。
(8)诱导液用1MTris-HCl pH7.5缓冲液调pH至7.0。取诱导液30μl，加入0.5μl(0.1单位)凝血酶，混匀。1min后加入50μl(5mg/ml)纤维蛋白原，立即混匀。观察有无沉淀的产生、沉淀量多少和记录产生沉淀时间。
(9)保存无沉淀产生、沉淀量少和产生沉淀时间相对长的转化子。阳性转化子见图1。
(10)从酵母转化子扩增插入片段。取生长于葡萄糖选择培养基的对数生长晚期的酵母菌1.5ml，13000rpm离心15秒，去上清。用双蒸水洗涤一次，13000rpm离心15秒。沉淀悬浮于30μlTE缓冲液。在沸水上煮3min。13000rpm离心1min。将上清储存在-20℃。取3μl用来做PCR。根据载体pYES2/CT序列设计上下游引物。<3>CCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACCCCGGATCG。<4>GGCGTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATGCG。扩增条件为95℃5分钟预变性；94℃30秒，68℃2分钟，72℃30秒，4个循环；94℃30秒，68℃40秒，72℃30秒，41个循环；72℃5分钟补平。选用上海博亚公司的Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶。100μl反应加5单位Taq DNA聚合酶和2单位Pfu DNA聚合酶。扩增片段长为580bp，由上海博亚生物技术有限公司纯化并全自动测序。测序引物为<5>TAATACGACTCACTATAGGG；<6>TAGGATCAGCGGGTTTAAACTC。测得的1个抗栓序列为DNA序列为TCCTGAGATTTTGAAGAAACGCCAGAAGAATATTTGTGA，其非随机部分为水蛭素，由于第二个密码子引入了一个终止密码子，因此只有第一个密码子与酵母α交配因子前导肽进行了融合表达，氨基酸序列为Ser，为丝氨酸。其具有一个潜在的糖基化位点。经信号肽剪切后会分泌出表达产物。
实施例2(1)构建酵母α交配因子前导肽与水蛭素C端12肽的部分随机化片段的融合DNA片段，用于部分随机肽的分泌表达。两个引物分别为<1>GCGAATTCAAAAATGAGATTTCCTTCAA。<2>CGTCTAGATCACAAATATTCTTCTGG(N)3TTCTTCAAAATC(N)6CTTTTCTCGAGAGATAC。用具有高保真活性的PyrobestDNA聚合酶(宝生物工程(大连)有限公司)扩增。扩增模板使用量为每1ml PCR反应液50ng质粒pPICZαA(Invitrogen产品，含酵母α交配因子前导肽DNA序列)。扩增条件为94℃5分钟预变性；94℃30秒，46℃30秒，72℃20秒，30个循环；72℃5分钟补平。扩增产物用1/102.5M NaAc，pH5.2和2.5倍绝对乙醇于13000rpm沉淀7分钟。用70％乙醇洗涤，13000rpm沉淀3分钟。电吹风吹干。悬浮在无菌蒸馏水里。用EcoR I和Xba I双酶切过夜，总体积为30μl。70℃热失活20分钟。
(2)4μg pYES2/CT(Invitrogen产品)用EcoR I和Xba I双酶切过夜，同时加碱性磷酸酶CIP，总体积为30μl。70℃热失活20分钟。取6.5μl双酶切的pYES2/CT，加入6μl双酶切的PCR产物，1.5μl 10X连接酶缓冲液，1μl T4DNA连接酶，16℃连接过夜。13000rpm乙醇沉淀5分钟和70％乙醇洗涤后电激转化大肠杆菌。涂板，于30℃生长。
(3)大量提取大肠杆菌质粒，加RNase消化RNA。限制性内切酶Nde I和Not I酶切鉴定，空载体切出两个条带，有插入片断的质粒切出一个6.1kb的条带。质粒经13000rpm乙醇沉淀5分钟和70％乙醇洗涤后取10μl准备做酵母电激。
(4)首先制备酵母感受态细胞。用过夜培养的酿酒酵母菌种INVSc1接种300ml YPD。30℃摇瓶培养到OD值1.3，将培养物分装在50ml离心管，5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬在总体积100ml醋酸锂/二硫苏糖醇预处理液中，25℃保温1小时。重悬在总体积200ml冰预冷的无菌水中。5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬在总体积100ml冰预冷的无菌水中。5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬在20ml冰预冷的1mol/L山梨醇中。5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬于0.2ml冰预冷的1mol/L山梨醇中。冰浴。每个无菌管中加80μl酵母悬浮液和100ng的DNA(总体积为10μl)及20μg ssDNA(鲑鱼精DNA)，轻轻混匀，转移至0.2-cm无菌电激杯，10℃水浴5分钟。1.8千伏、25微法、200欧姆做电激。立刻加入650μl 1mol/L山梨醇到电激杯中。轻轻混匀，转移到培养管，加650μl 2X YPD/1mol/L山梨醇，混匀之后30℃摇床培养1小时。
(5)将电激混合物涂布葡萄糖/山梨醇选择平板，于30℃生长3天。
(6)转接转化子和对照(仅含有空载体的转化子)至棉子糖/半乳糖液体诱导基，于30℃摇床诱导7天。因为1.5ml Eppendorf离心管透气性不好，因此，每48小时在无菌条件下开盖一次，以保证酵母生长充足的氧气。
(7)取诱导了7天的培养物，13000rpm×离心1分钟，取上清。
(8)诱导液用1MTris-HCl pH7.5缓冲液调pH至7.0。取诱导液30μl，加入0.5μl(0.1单位)凝血酶，混匀。1min后加入50μl(5mg/ml)纤维蛋白原，立即混匀。观察有无沉淀的产生、沉淀量多少和记录产生沉淀时间。
(9)保存无沉淀产生、沉淀量少和产生沉淀时间相对长的转化子。
(10)从酵母转化子扩增插入片段。取生长于葡萄糖选择培养基的对数生长晚期的酵母菌1.5ml，13000rpm离心15秒，去上清。用双蒸水洗涤一次，13000rpm离心15秒。沉淀悬浮于30μl TE缓冲液。在沸水上煮3min。13000rpm离心1min。将上清储存在-20℃。取3μl用来做PCR。根据载体pYES2/CT序列设计上下游引物。<3>CCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACCCCGGATCG。<4>GGCGTGAATG TAAGCGTGACATAACTAATTACATGATGCG。扩增条件为95℃5分钟预变性；94℃30秒，68℃2分钟，72℃30秒，4个循环；94℃30秒，68℃40秒，72℃30秒，41个循环；72℃5分钟补平。选用上海博亚公司的Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶。100μl反应加5单位Taq DNA聚合酶和2单位Pfu DNA聚合酶。扩增片段长为580bp，由上海博亚生物技术有限公司纯化并全自动测序。测序引物为<5>TAATACGACTCACTATAGGG；<6>TAGGATCAGCGGGTTTAAACTC。
上述实施例1和2中所用的醋酸锂/二硫苏糖醇预处理液配方为(每100ml)0.1M醋酸锂(终浓度)，10mM Tris(终浓度)，pH7.5，1mM EDTA(终浓度)，高压灭菌后加入过滤灭菌的10ml 0.1M二硫苏糖醇至90ml上述溶液(终浓度为10mM)。
上述实施例1和2中所用的葡萄糖/山梨醇选择平板培养基配方为(每升)1.7g YNB(无氨基酸酵母氮源，Amresco，Inc.)，1M山梨醇，10g葡萄糖，30mg亮氨酸，20mg组氨酸，30mg色氨酸，20g琼脂。高压灭菌。倒平板。
上述实施例1和2中所用的棉子糖/半乳糖诱导表达液体培养基配方为(每升)1.7g YNB(无氨基酸酵母氮源，Amresco，Inc.)，30mg亮氨酸，20mg组氨酸，30mg色氨酸。高压灭菌。加入过滤除菌的1％的棉子糖和1％的半乳糖。
上述实施例1和2中所用的LB配方为(500ml)5g蛋白胨，2.5g酵母抽提物，5g氯化钠，蒸馏水，pH7.0。
实施例3将诱导液pH值调至5.5，取诱导液6μl稀释于2.00ml蒸馏水中，加入1.00ml茚三酮显色剂。混匀后置沸水浴中加热15分钟。
茚三酮显色剂成分为茚三酮0.5g、果糖0.3g、Na2HPO4·10H2O 10g及KH2PO46g，定容至100ml。Ser(丝氨酸)溶液成分为5mg/ml。茚三酮显色反应定性检测空载体转化子和活性重组转化子表达诱导液所含寡肽或氨基酸的差异见图2。
实施例4本实施例研究了活性重组转化子表达诱导液的纸层析Rf值。选用国产新华1号滤纸，剪裁成12cm×14cm，在滤纸一边距边缘1cm处用铅笔划一条线，在线上隔一定距离点样。点样量20μl，在第一点样品干后再点第二滴，点的扩散直径控制在1cm以内。将点好样品的滤纸两侧边缘比齐，用线缝好，揉成筒状。将圆筒状的滤纸放入结晶皿中，滤纸不要与皿壁接触，皿周围放入3个小烧杯，内盛平衡溶剂，盖好钟罩，平衡1小时后打开钟罩上端的的塞子，将加溶剂漏斗插入罩内，使漏斗长管下端进到结晶皿底部，通过漏斗加入层析溶剂(展层剂)。当溶剂展层至距离纸的上沿约1cm时取出滤纸，立即用铅笔标出溶剂前缘位置，再挂在绳上晾干。把已经去除溶剂的层析滤纸用25ml0.5％茚三酮溶液在纸的一面均匀喷雾，待自然晾干后，置于65℃烘箱内，准确地烘30分钟(鼓风，保持温度均匀)后取出。用铅笔轻轻描出显色斑点的形状。用一直尺量度每一显色斑点中心与原点之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，求其比值，即得该氨基酸的Rf值。对照丝氨酸Rf(1)＝0.083，样品Rf(2)＝0.012。结果表明表达产物并非纯粹的丝氨酸，在酿酒酵母丝氨酸经常发生羟基的甘露糖糖基化修饰。
滤纸层析实验试剂Ser(丝氨酸)溶液5mg/ml平衡溶剂12％氨水层析溶剂正丁醇∶12％氨水∶95％乙醇＝13∶3∶3(体积比)显色剂0.5％茚三酮丙酮溶液实施例5将50ml强酸性苯乙烯系阳离子树脂(北京鼎国生物技术有限公司生产)置于交换柱内，用10％的盐酸溶液浸泡24小时，流出盐酸，用无离子水洗至中性。用10％氢氧化钠溶液浸泡24小时，流出碱液，用无离子水洗至中性。加入10ml活性转化子诱导液。用玻璃棒慢慢搅拌，注意避免有气泡产生。静置30min后，滤去诱导液。加入10ml双蒸水洗脱，用玻璃棒慢慢搅拌，同样要注意避免有气泡产生。静置30min，分管收集洗脱液，每管1ml。取30μl测定洗脱液抑制凝血酶的活性。取洗脱液30μl，加入0.5μl(0.1单位)凝血酶(用50mM Tris，pH7.0配置)，混匀。1min后加入50μl(5mg/ml)纤维蛋白原(用50mM Tris，pH7.0配置)，立即混匀。观察有无沉淀的产生、沉淀量多少和记录产生沉淀时间。
强酸性苯乙烯系阳离子交换层析分管收集的洗脱液抑制凝血酶活性的时间如表1。洗脱液抑制凝血酶活性的时间逐渐增长，到第7管洗脱液抑制时间达到最长14min，而后抑制时间又逐渐减短。
表1、分管收集的洗脱液抑制凝血酶活性的时间
权利要求
1.一种用于分离抗栓物质的定向进化方法，其包括如下步骤(1)构建酵母α交配因子前导肽与部分随机肽的融合DNA片段；(2)插入双酶切并用碱性磷酸酶处理的含有诱导型启动子的穿梭载体；(3)穿梭载体电激转化大肠杆菌，提取质粒后电激转化酿酒酵母；(4)转接转化子至棉子糖/半乳糖液体诱导培养基，诱导培养；(5)取培养物，离心取上清，调pH至中性，加入凝血酶，混匀；1分钟后加入纤维蛋白原，混匀；取无沉淀产生、沉淀量少或产生沉淀时间相对长的活性转化子；
2.如权利要求1所述的定向进化方法，其特征在于步骤(2)所述的穿梭载体为酿酒酵母穿梭载体。
3.如权利要求1所述的定向进化方法，其特征在于步骤(4)所述的诱导培养为在30℃下，摇床诱导培养7天；
4.一种权利要求1所述方法分离的抗栓物质，其核苷酸序列为TCC，氨基酸序列为Ser，在酵母表达时Ser的羟基发生甘露糖糖基化。
5.一种权利要求4所述抗栓物质的纯化方法，包括如下步骤(1)将强酸性苯乙烯系阳离子树脂置于交换柱内，用酸液浸泡，流出酸液，用无离子水洗至中性；(2)用碱液浸泡，流出碱液，用无离子水洗至中性；(3)加入活性转化子诱导液，静置，滤去诱导液；(4)加入双蒸水洗脱，静置，分管收集洗脱液。
6.如权利要求5所述的纯化方法，其特征在于步骤(1)为将强酸性苯乙烯系阳离子树脂置于交换柱内，用10％的盐酸液浸泡24小时，流出酸液，用无离子水洗至中性。
7.如权利要求5所述的纯化方法，其特征在于步骤(2)为用10％氢氧化钠溶液浸泡24小时，流出碱液，用无离子水洗至中性。
8.如权利要求5所述的纯化方法，其特征在于步骤(3)或步骤(4)所述的静置的时间为30分钟。
全文摘要
本发明公开了一种用于分离抗栓物质的定向进化方法及其分离的抗栓物质与纯化方法。本发明通过构建酵母α交配因子前导肽与部分随机肽的融合DNA片段；插入双酶切并用碱性磷酸酶处理的含有诱导型启动子的穿梭载体；电激转化大肠杆菌，提取质粒后电激转化酿酒酵母；转接转化子至棉子糖/半乳糖液体诱导培养基；取诱导了7天的培养物，离心取上清；做抑制凝血酶试验，筛选阳性转化子。本发明的定向进化方法能简单、高效地发现抗栓肽；这将为抗栓药物和其它药物开发开辟新途径。
文档编号C07K1/14GK1737149SQ20051003563
公开日2006年2月22日 申请日期2005年7月7日 优先权日2005年7月7日
发明者刘秋云, 何建国, 李子劲 申请人:刘秋云, 何建国