一种制备透明质酸纳米微球的方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备透明质酸纳米微球材料的方法，提供了一种基于碱基配对作用交联透明质酸纳米微球的手段。采用反相乳液交联技术，通过碱基配对作用，实现了透明质酸纳米微球的交联，得到了结构稳定的透明质酸纳米微球。本发明避免使用了有毒化学交联剂，能保留被包埋药物的生物活性，可显著改善纳米微球材料的使用安全性。本发明工艺和设备简单、易行、操作安全，具有制备温度低、固化速度快、处理周期短等优点，在活性药物、蛋白或基因的包埋与传递方面有应用价值。
【专利说明】一种制备透明质酸纳米微球的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医用高分子材料领域，具体涉及一种利用碱基配对交联制备透明质酸纳米微球的方法。
【背景技术】
[0002]天然多聚糖纳米微球具有优异的生物相容性和可调的生物降解性，可用于药物、蛋白或基因的包埋和释放，目前已广泛用于药物控释、组织工程和再生医学等领域的研究。通常，药物在体内代谢较快，而频繁注射给药则会给病人带来极大的痛苦。选择合适的纳米微球体系，可实现药物在体内的缓慢释放，达到理想的治疗效果。在组织工程和再生医学领域，多聚糖纳米微球常用于包埋细胞生长因子和基因，提高细胞支架的生物活性，增加支架在体内的组织诱 导能力。常用来制备纳米微球的多聚糖包括:透明质酸、海藻酸、硫酸软骨素、壳聚糖、淀粉及纤维素等。
[0003]多聚糖纳米微球在制备工程中必须添加化学交联剂处理，其结构才能稳定。这些化学交联剂主要有多聚甲醛、戊二醛、水溶性碳化二亚胺和京尼平等，其作用是将多聚糖分子中的活性基团(氨基、羧基和羟基)经过缩合而达到交联的目的。化学交联剂具有细胞毒性，虽然能使纳米微球在物理结构上比较稳定，但是会导致包埋的活性蛋白类药物(如细胞生长因子等)变性而失活，因此不适合用于活性蛋白的传递，同时交联剂也容易残留在材料中。避免使用有毒的化学交联剂，则有望得到高生物活性的多聚糖纳米微球材料，是降低材料毒性及提高药物输送效率的有效途径。但是，现有技术中尚不存在采用无毒化学试剂交联制备多聚糖纳米微球的方法。
[0004]
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种制备透明质酸纳米微球的方法，避免使用了有毒化学交联剂，可保证被包埋药物的生物活性。
[0006]实现本发明目的的技术解决方案为:通过碱基配对作用，采用反相乳液交联技术制备透明质酸纳米微球，具体包括以下步骤:
步骤1、室温下配制透明质酸水溶液，加入多磷酸酯，搅拌均匀；滴加胸腺嘧啶盐酸溶液，搅拌反应；
步骤2、将反应完成后的透明质酸溶液冷却至沉淀析出未反应的胸腺嘧啶，然后用氨水将上清溶液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，最后将有机溶剂蒸干，得到胸腺嘧啶功能化透明质酸；
步骤3、室温下配制透明质酸水溶液，加入多磷酸酯，搅拌均匀；滴加腺嘌呤盐酸溶液，搅拌反应；
步骤4、将反应完成后的透明质酸溶液冷却至沉淀析出未反应的腺嘌呤，然后用氨水将上清溶液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，最后将有机溶剂蒸干，得到腺嘌呤功能化透明质酸；
步骤5、分别将上述两种碱基功能化透明质酸溶于石蜡油，各自加入司班80，超声下按比例混合乳化后搅拌挥发过夜；
步骤6、将搅拌完成后的乳液倒入异丙醇中，待透明质酸纳米微球析出后进行高速离心，随后用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后室温真空干燥。
[0007]本发明所用到的试剂来源:透明质酸、胸腺喃唳、腺嘌呤,购于Sigma公司；司班80、乙酸乙酯，分析纯，南京化学试剂有限公司；异丙醇、正己烷、丙酮，分析纯，上海化学试剂有限公司；盐酸、氨水，分析纯，上海化学试剂厂。氯化钠、氯化钾，分析纯，上海试剂三厂；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾，分析纯，杭州化学试剂有限公司。DMEM培养基，Giboco公司；小牛血清，杭州四季青生物材料工程研究所；青霉素、链霉素，华北制药股份有限公司。
[0008]本发明所用到的仪器:扫描电子显微镜(JSM-6330F，JE0L);纳米粒度分析仪(Malvern Zetasizer Nano ZS);酶标仪(Biorad, Model 550);喷金仪(Cressington 108Auto)ο
[0009]与现有技术 相比，本发明的特征在于:1)避免使用了有毒化学交联剂，因此纳米微球中不存在毒性残留，保证了纳米微球的安全性；2)所涉及的碱基配对基于分子间的氢键作用，不与被包埋活性药物发生化学反应，能有效保护药物的生物活性，特别适用于活性蛋白类药物的包埋与传递；3)本发明工艺和设备简单、易行、操作安全，具有制备温度低、固化速度快、处理周期短、对环境不产生污染等优点，适合商业化生产。
[0010]下面通过实施例来进一步说明本发明。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1是透明质酸纳米微球制备示意图。
图2是成球率与透明质酸中碱基对配比(1/2、1/1和2/1)的关系。
[0012]图3是纳米微球的直径与透明质酸溶液浓度的关系。
[0013]图4是透明质酸纳米微球的粒径分布与扫描电子显微图。
[0014]图5是透明质酸纳米微球在磷酸盐缓冲溶液中的失重。
[0015]图6是透明质酸纳米微球的细胞毒性。
【具体实施方式】
[0016]本发明提供的一种制备透明质酸纳米微球的方法，其步骤包括:
步骤1、室温下配制质量/体积百分比为0.5~2%的透明质酸水溶液，加入f 4倍质量的多磷酸酯，搅拌均匀；滴加质量/体积百分比为0.04、.2%的胸腺嘧啶盐酸溶液，其体积为透明质酸水溶液的1/5~1/2，然后在4(T60°C下搅拌反应16~24小时；
步骤2、将反应完成后的透明质酸溶液冷却至沉淀析出未反应的胸腺嘧啶，然后用氨水将上清溶液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，最后将有机溶剂蒸干，得到胸腺嘧啶功能化透明质酸；
步骤3、室温下配制质量/体积百分比为0.5^2%的透明质酸水溶液，加入f 4倍质量的多磷酸酯，搅拌均匀；滴加质量/体积百分比为0.04、.2%的腺嘌呤盐酸溶液，其体积为透明质酸溶液的1/5~1/2，随后在4(T60°C下搅拌反应16~24小时；步骤4、将反应完成后的透明质酸溶液冷却至沉淀析出未反应的腺嘌呤，然后用氨水将上清溶液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，最后将有机溶剂蒸干，得到腺嘌呤功能化透明质酸；
步骤5、分别将上述两种碱基功能化透明质酸以质量/体积百分比为0.5^2.0%溶于石蜡油，各自加入0.2^0.5毫升司班80，超声下将两种碱基功能化透明质酸溶液按照体积比1/2~2/1混合乳化5~10分钟，然后以80(Tl500rpm搅拌挥发过夜；
步骤6、将搅拌完成后的乳液倒入10倍以上体积的异丙醇中，待透明质酸纳米微球析出后进行高速离心，随后用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后室温真空干燥。
[0017]其中磷酸盐缓冲溶液(PBS)的配制:称取分析纯氯化钠8克、氯化钾0.2克、磷酸氢二钠2.9克、磷酸二氢钾0.2克，溶于1000毫升蒸馏水中，调节pH为7.4。
[0018]多磷酸酯的制备:将0.07mmol 二乙醚、0.035mmol三氯甲烧、0.035mmol五氧化二磷混合搅拌，50°C下加热回流12小时，减压蒸馏得到多磷酸酯产物。
[0019]纳米微球的形貌与粒径检测:将干燥后的纳米微球喷金(Cressington 108Auto)，在扫描电子显微镜(JSM-6330F，JEOL)上观察微观形貌。纳米微球的直径通过纳米粒度分析仪(Malvern Zetasizer Nano ZS)测算。 [0020]纳米微球的失重检测:取一定干燥纳米微球称重(Wci),置于37°C下的磷酸盐缓冲溶液中孵育。测试时，将纳米微球从溶液中离心，用蒸馏水和丙酮分别清洗，真空干燥后称重(Wt)，每个样品平行测试5次。计算纳米微球失重的公式为100%X (Wtl -Wt)/Wtl，纳米微球保留质量为1- 100%X (W0 - Wt)/W。。
[0021]纳米微球的细胞毒性检测:将称重后的纳米微球用75%乙醇浸泡2小时消毒，用灭过菌的磷酸盐缓冲溶液反复漂洗除去乙醇，置于24孔培养板(Nunc?，Denmark)中，然后接种数量为3 X IO4的人体成纤维细胞，并加入I毫升培养液(DMEM培养基+10%小牛血清+100单位/毫升青霉素/链霉素)，将其放于37°C下孵育。测试时，每孔加入20微升0.5wt%MTT的磷酸盐缓冲溶液，置于37°C下孵育4小时后加入200微升二甲基亚砜，振荡均匀后采用酶标仪(Biorad，Model 550)于570纳米处测定紫色物质的吸光度。
[0022]本发明采用ANOVA方差分析法，显著差异值/7设为< 0.05。
[0023]下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但这些实例并不用来限制本发明。
[0024]实施例1:
(O室温下配制50毫升质量/体积浓度为0.5%的透明质酸水溶液，加入0.5克多磷酸酯，搅拌形成均匀溶液；滴加25毫升质量/体积浓度为0.04%的胸腺嘧啶盐酸溶液，50°C下搅拌反应16小时；
(2)将反应完成后的透明质酸溶液冷却至0°C，沉淀析出未反应的胸腺嘧啶，然后用氨水将上清溶液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，最后将有机溶剂蒸干，得到胸腺嘧啶功能化透明质酸；
(3)采用步骤I)和2)中同样的方法，制备腺嘌呤功能化透明质酸；
(4)分别将上述两种碱基功能化透明质酸溶于50毫升石蜡油，分别配制成质量/体积浓度为0.5%的溶液，各自加入0.2毫升司班80，超声下等体积1/1混合乳化5分钟，然后以800rpm的转速搅拌挥发过夜；(5)将搅拌完成后的乳液倒入10倍体积的异丙醇中，待纳米微球析出后进行高速离心，随后用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后室温真空干燥24小时。
[0025]实施例2:
(1)室温下配制50毫升质量/体积浓度为2%的透明质酸水溶液，加入4克多磷酸酯，搅拌形成均匀溶液；滴加25毫升质量/体积浓度为0.2%的胸腺嘧啶盐酸溶液，60°C下搅拌反应24小时；
(2)将反应完成后的透明质酸溶液冷却至0°C，沉淀析出未反应的胸腺嘧啶，然后用氨水将上清溶液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，最后将有机溶剂蒸干，得到胸腺嘧啶功能化透明质酸；
(3)采用步骤1)和2)中同样的方法，制备腺嘌呤功能化透明质酸；
(4)分别将上述两种碱基功能化透明质酸溶于50毫升石蜡油，分别配制成质量/体积浓度为2.0%的溶液，各自加入0.5毫升司班80，超声下按胸腺嘧啶/腺嘌呤体积比1/2混合乳化10分钟，然后以1000rpm的转速搅拌挥发过夜；
(5)将搅拌完成后的乳液倒入10倍体积的异丙醇中，待纳米微球析出后进行高速离心，随后用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后室温真空干燥24小时。
[0026]实施例3:
(O室温下配制50毫升质量/体积浓度为1%的透明质酸水溶液，加入0.5克多磷酸酯，搅拌形成均匀溶液；滴加20毫升质量/体积浓度为0.08%的胸腺嘧啶盐酸溶液，40°C下搅拌反应18小时；
(2)将反应完成后的透明质酸溶液冷却至0°C，沉淀析出未反应的胸腺嘧啶，然后用氨水将上清溶液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，最后将有机溶剂蒸干，得到胸腺嘧啶功能化透明质酸；
(3)采用步骤I)和2)中同样的方法，制备腺嘌呤功能化透明质酸；
(4)分别将上述两种碱基功能化透明质酸溶于50毫升石蜡油，分别配制成质量/体积浓度为1.2%的溶液，各自加入0.3毫升司班80，超声下按胸腺嘧啶/腺嘌呤体积比2/1混合乳化6分钟,然后以1200rpm的转速搅拌挥发过夜；
(5)将搅拌完成后的乳液倒入10倍体积的异丙醇中，待纳米微球析出后进行高速离心，随后用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后室温真空干燥24小时。
[0027]实施例4:
(O室温下配制50毫升质量/体积浓度为1.5%的透明质酸水溶液，加入1.2克多磷酸酯，搅拌形成均匀溶液；滴加20毫升质量/体积浓度为0.13%的胸腺嘧啶盐酸溶液，50°C下搅拌反应20小时；
(2)将反应完成后的透明质酸溶液冷却至0°C，沉淀析出未反应的胸腺嘧啶，然后用氨水将上清溶液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，最后将有机溶剂蒸干，得到胸腺嘧啶功能化透明质酸；
(3)采用步骤I)和2)中同样的方法，制备腺嘌呤功能化透明质酸；
(4)分别将上述两种碱基功能化透明质酸溶于50毫升石蜡油，分别配制成质量/体积浓度为1.8%的溶液，各自加入0.4毫升司班80，超声下等体积混合乳化8分钟，然后以1300rpm的转速搅拌挥发过夜；(5)将搅拌完成后的乳液倒入10倍体积的异丙醇中，待纳米微球析出后进行高速离心，随后用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后室温真空干燥24小时。
[0028]实施例5:
(O室温下配制50毫升质量/体积浓度为0.5%的透明质酸水溶液，加入0.5克多磷酸酯，搅拌形成均匀溶液；滴加15毫升质量/体积浓度为0.04%的胸腺嘧啶盐酸溶液，40°C下搅拌反应16小时；
(2)将反应完成后的透明质酸溶液冷却至0°C，沉淀析出未反应的胸腺嘧啶，然后用氨水将上清溶液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，最后将有机溶剂蒸干，得到胸腺嘧啶功能化透明质酸；
(3)采用步骤I)和2)中同样的方法，制备腺嘌呤功能化透明质酸；
(4)分别将上述两种碱基功能化透明质酸溶于50毫升石蜡油，分别配制成质量/体积浓度为0.5%的溶液，各自加入0.2毫升司班80，超声下按胸腺嘧啶/腺嘌呤体积比1/2混合乳化5分钟,然后以1500rpm的转速搅拌挥发过夜；
(5)将搅拌完成后的乳液倒入10倍体积的异丙醇中，待纳米微球析出后进行高速离心，随后用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后室温真空干燥24小时。
[0029]实施例6:
(O室温下配制50毫升质量/体积浓度为0.5%的透明质酸水溶液，加入0.5克多磷酸酯，搅拌形成均匀溶液；滴加10毫升质量/体积浓度为0.04%的胸腺嘧啶盐酸溶液，60°C下搅拌反应16小时；
(2)将反应完成后的透明质酸溶液冷却至0°C，沉淀析出未反应的胸腺嘧啶，然后用氨水将上清溶液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，最后将有机溶剂蒸干，得到胸腺嘧啶功能化透明质酸；
(3)采用步骤I)和2)中同样的方法，制备腺嘌呤功能化透明质酸；
(4)分别将上述两种碱基功能化透明质酸溶于50毫升石蜡油，分别配制成质量/体积浓度为0.5%的溶液，各自加入0.2毫升司班80，超声下按胸腺嘧啶/腺嘌呤体积比2/1混合乳化5分钟,然后以800rpm的转速搅拌挥发过夜；
(5)将搅拌完成后的乳液倒入10倍体积的异丙醇中，待纳米微球析出后进行高速离心，随后用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后室温真空干燥24小时。
[0030]本发明制备的透明质酸纳米微球分布均匀，平均直径可控制在65~120纳米，纳米微球呈现完整的球形。纳米微球的直径随着透明质酸溶液的浓度的增加而变大。一定条件下，当胸腺嘧啶功能化透明质酸与腺嘌呤功能化透明质酸溶液的体积比为1:1时，成球率最闻，达到87%。
[0031]本发明所制备的多聚糖纳米微球在培养7天后失重很小，约92%的纳米微球质量依然保留，说明该纳米微球结构稳定，适用于体内药物治疗。将细胞与该纳米微球共培养，结果表明细胞活性未受影响，说明该纳米微球没有毒性，生物相容性好。
[0032]以上实施例涵盖了最具代表性的实验数据。
【权利要求】
1.一种透明质酸纳米微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤1、室温下配制透明质酸水溶液，加入多磷酸酯，搅拌均匀；滴加胸腺嘧啶盐酸溶液，搅拌反应； 步骤2、将反应完成后的透明质酸溶液冷却至沉淀析出未反应的胸腺嘧啶，然后用氨水将上清溶液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，最后将有机溶剂蒸干，得到胸腺嘧啶功能化透明质酸； 步骤3、室温下配制透明质酸水溶液，加入多磷酸酯，搅拌均匀；滴加腺嘌呤盐酸溶液，搅拌反应； 步骤4、将反应完成后的透明质酸溶液冷却，沉淀析出未反应的腺嘌呤，然后用氨水将上清溶液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，最后将有机溶剂蒸干，得到腺嘌呤功能化透明质酸； 步骤5、分别将上述两种碱基功能化透明质酸溶于石蜡油，各自加入司班80，超声下混合乳化后搅拌挥发过夜； 步骤6、将搅拌完成后的乳液倒入异丙醇中，待透明质酸纳米微球析出后进行高速离心，随后用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后室温真空干燥。
2.根据权利要求1所述的透明质酸纳米微球的制备方法，其特征在于，所述步骤I中透明质酸水溶液的质量/体积百分比为0.5~2%，胸腺嘧啶盐酸溶液的质量/体积百分比为0.04、.2% ;其中加入的多磷酸酯质量为透明质酸水溶液的1~4倍，胸腺嘧啶盐酸溶液的体积为透明质酸水溶液的1/5~1/2 ;在4(T60°C下搅拌反应16~24小时。
3.根据权利要求1所述的透明 质酸纳米微球的制备方法，其特征在于，所述步骤3中透明质酸水溶液的质量/体积百分比为0.5~2%，腺嘌呤盐酸溶液的质量/体积百分比为0.04、.2% ;其中加入的多磷酸酯质量为透明质酸水溶液的1~4倍，腺嘌呤盐酸溶液的体积为透明质酸水溶液的1/5~1/2 ;在4(T60°C下搅拌反应16~24小时。
4.根据权利要求1所述的透明质酸纳米微球的制备方法，其特征在于，所述步骤5中制备出的碱基功能化透明质酸以质量/体积百分比为0.5^2.0%溶于石蜡油；加入的司班80为0.2^0.5毫升；两种碱基功能化透明质酸溶液按照体积比1/2~2/1混合；乳化时间为5~10分钟；搅拌转速为80(Tl500rpm。
5.根据权利要求1所述的透明质酸纳米微球的制备方法，其特征在于，所述步骤6中异丙醇的体积为搅拌完成后的乳液的10倍以上。
【文档编号】C08L5/08GK103848995SQ201210516294
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年12月4日 优先权日:2012年12月4日
【发明者】谈华平 申请人:南京理工大学