专利名称：玉米品种农大108纯度检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用SSR技术进行玉米品种纯度检测的专用试剂盒。
背景技术：
对当前推广面积较大的玉米品种农大108的纯度检测目前主要有田间形态鉴定、同工酶鉴定及RAPD鉴定，但形态鉴定昂贵、耗时和工作量大；同工酶鉴定需要种子发芽，且具有组织特异性，故费时费力，准确度不高；RAPD技术虽已筛选出若干引物，但稳定性差。SSR技术具有多态性丰富、准确可靠、简单快速、易于自动化的优点，成为玉米品种纯度鉴定首选技术之一。然而由于该技术出现较晚，在农大108纯度检测上尚未应用。
发明内容
为了克服现有检测方法费时费力、稳定性差的不足，本发明在SSR技术的基础上，开发了一套适于农大108纯度检测的试剂盒产品，利用该产品不仅检测结果稳定可靠，而且操作简单方便。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是首先从DNA提取、PCR扩增、电泳检测等环节对现有SSR技术进行了优化，建立了一套快速准确的适于玉米纯度检测的SSR操作程序如下(1)DNA提取采用郭景伦等[1]的玉米单粒种子DNA快速提取法并加以改进将单粒干种子的胚剥下，放入1.5ml离心管中，加入300μl氯仿后研磨，然后加入300μl DNA提取液(100mM Tris-HCl，100mM EDTA 8.0，500mM NaCl，1.5％SDS)混匀后于10000r/min离心2min，吸上清液加入预先装有300μl异丙醇和300μl NaCl(500mM)的1.5ml离心管中，等DNA成团后用灭菌枪尖挑出，经70％乙醇洗涤后加入200μl TE8.0，待充分溶解后备用。改进后提取的DNA质量提高。该方法比常规的液氮提取法简单快速。
(2)SSR扩增反应体系20μl反应液中包括10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，0.001％Gelatin，2.5mmol/L MgCl2，0.16mmol/L 4dNTP，0.25μmol/L SSR引物，1单位Taq DNA聚合酶，2μl DNA模板。
反应程序94℃预变性5min，一个循环；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，共35个循环。PCR扩增仪上进行扩增。
(3)电泳PCR产物变性后在4.5％测序胶上分离。预电泳85W，20min；电泳80W，40min。与其它电泳方法相比，使用测序胶电泳时间短，分辨率高。
(4)银染检测10％冰醋酸固定3min；双蒸水快速漂洗1次，不超过10s；0.2％AgNO3溶液染色5min；显影液(3％NaOH，0.5％甲醛)显影；10％冰醋酸定影。该银染法仅需约15分钟，而一般银染法需约1.5小时。
其次筛选农大108纯度鉴定的特征引物适用于玉米品种纯度鉴定的SSR引物应具有以下两个特征①引物本身多态性信息量要高，从而具有较强的鉴别杂株的能力；②在玉米杂交种及其双亲表现多态性，从而可以鉴别杂交种中最常见的自交苗。基于以上认识，首先根据文献资料，从Maize Database上公布的SSR引物中初步选择500个SSR引物进行合成，从中筛选出多态性高、带型清晰、重复性好的引物50个作为玉米品种鉴定的一套核心引物；从核心引物中进一步筛选出在农大108父本、母本和杂交种间表现差异的引物，并通过田间常规鉴定与室内鉴定比较，验证引物可靠性，确定出农大108纯度鉴定的特征引物10个bnlg439、bnlg161、bnlg125、umc1196、phi037、phi080、umc1165、bnlg666、umc1904、phi115(引物序列可查询Maize Database)。
最后，制作一套农大108的的纯度检测试剂盒(包括以上10个不同的引物)该试剂盒提供优化后的操作程序、PCR全套反应体系及农大108标准电泳图谱。使用其中任一试剂盒均可对农大108进行纯度检测，不同试剂盒的检测结果可相互验证；使用整套试剂盒还可对农大108进行真伪检测。本发明的有益效果是简单快速地检测农大108样品的纯度，检测结果稳定，容易统计，检测一份样品(100粒种子)从送样到出结果仅需4-5小时，保证了送检样品当日即可出结果。利用该试剂盒，一般种子质检室只需具备常规的分子生物学设备就可按提供的操作步骤进行实际检测。
2)所用DNA样品也可通过籽粒发芽，用微量CTAB法、SDS法等获得。其它步骤同上。
3)扩增产物也可用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，常规银染法检测。其它步骤同上。
附参考文献1.郭景伦，赵久然，孔艳芳等。玉米单粒种子DNA提取新方法及在玉米种质鉴定中的应用研究。种子，1999，237-38。
权利要求
1.一套玉米品种农大108纯度及真伪检测专用试剂盒(共10个)，包括操作程序、PCR全套反应体系、农大108标准电泳图谱。其特征是每个试剂盒分别包含农大108纯度鉴定的特征引物bnlg439、bnlg161、bnlg125、umc1196、phi037、phi080、umc1165、bnlg666、umc1904、phi115，每个试剂盒均可用于农大108纯度检测，不同试剂盒检测结果可相互验证。全套试剂盒还可用作农大108真伪检测。
2.一种适于玉米品种纯度检测的优化的SSR操作程序，包括DNA提取、PCR扩增、电泳、银染检测等环节的优化组合。其特征是DNA提取法在郭景伦等的玉米单粒种子DNA快速提取法基础上进一步提高DNA提取质量；PCR扩增时间仅需约2小时；银染检测在快速银染法基础上进一步简化，仅需约15分钟。优化组合后的操作程序仅需4-5个小时即可完成1份送检样品(100粒)的纯度检测。
全文摘要
一套适于农大108纯度检测的简单快速、准确稳定的试剂盒产品(共10个)，提供操作步骤、PCR全套反应体系、农大108标准电泳图谱。其特征是每个试剂盒分别包含农大108纯度鉴定的一个特征引物。使用其中任一试剂盒均可对农大108进行纯度检测，不同试剂盒的检测结果可相互验证；使用整套试剂盒还可对农大108进行真伪检测。使用该试剂盒仅需4－5个小时即可完成1份送检样品(100粒)的纯度检测。
文档编号G01N27/447GK1456682SQ0311941
公开日2003年11月19日 申请日期2003年3月12日 优先权日2003年3月12日
发明者王凤格, 赵久然, 郭景伦 申请人:北京市农林科学院玉米研究中心