特异识别猪H11位点的sgRNA及其编码DNA和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及能够特异识别猪H11位点的sgRNA及其 编码DNA和应用。
【背景技术】
[0002] 2010年，斯坦福大学的SimonHippenmeyer及其研宄团队在小鼠的第11号染色体 上分离并鉴定出了一个良好的基因插入位点，命名为hippll位点，简称H11位点。H11位点 位于Eif4enifl与Drgl两个基因的间隙，与Eif4enifl基因的19号外显子和Drgl基因的 9号外显子相邻，大小约5kb。H11位点由于位于两个基因之间，因此安全性较高，无基因沉 默效应，具有广谱的细胞表达活性。实验证实Hippll位点定点基因修饰的小鼠与野生型小 鼠生长发育无区别。目前类似的还有R〇s26位点，但是该位点为一个基因，其启动子为全身 性广谱表达，难以做到组织特异性表达，然而H11位点则不存在类似的困难，由于其位于两 基因之间，并且不存在启动子，所以可以选择实验所需的启动子完成目的基因的时空特异 性表达，更好的达到任务目标。如果在猪的基因组中定位hippll这样安全有效的基因修饰 位点，将有利于稳定转基因猪培育的技术体系。
[0003] ZFN和TALEN打靶技术是目前研宄较为成熟的两种定点突变技术，但是这两种技 术构建程序较为繁琐，每一个位点需要构建一对相应的核酸酶，而CRISPR/Cas9系统对特 异位点的识别靠小的crRNA的引导，CRISPR区可以有一系列的crRNA组成，每个针对特异 位点的crRNA只有几十个碱基，整个载体较小，相对于ZFN和TALEN载体，更加容易构建。
[0004] (CRISPR) /CRISPR-associated(Cas)是细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防 御机制。CRISPR/Cas9利用一段小RNA来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。Cong等及 Mali等证明Cas9系统能在293T、K562、iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重 组（NHEJ)、同源重组（HR)效率在3-25%之间，与TALEN酶切效果相当。他们还证明，多个 靶点可以同时进行靶向酶切。借助于这一技术，动植物基因功能研宄及育种等等都将得到 迅猛的发展。
[0005] 因此，寻求能高效的特异性识别猪的H11位点的序列，并借助Cas9酶对该位点进 行高效的定点切割，将会为后面的针对猪H11位点高效定点整合实验打下了坚实的基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供了能高效特异识别猪H11位点sgRNA。本发明是利用编 码sgRNA部分序列的短片段DNA构建表达载体，该表达载体能够表达出该sgRNA的识别染 色体上特定的DNA序列的片段序列，该sgRNA的部分序列能够特异性地识别猪H11位点。 本发明还利用该sgRNA引导Cas9核酸酶（即Cas9切刻酶）对猪H11位点进行准确、高效 地靶向修饰。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 特异识别猪H11位点基因的SgRNA，由101个核苷酸组成，其中5'末端20nt的RNA 片段可以识别染色体上特定的DNA序列，其余81nt称为骨架RNA片段。骨架RNA片段可形 成发夹结构，与Cas9核酸酶结合，从而引导Cas9核酸酶切割靶标DNA双链，DNA双链断裂 后，细胞利用自身修复功能，使得靶标位点附近的序列发生变化；
[0009] 其中识别染色体上特定的DNA序列片段的核苷酸序列如下1)或2):
[0010] 1)序列表中的序列1或序列2所示的核苷酸序列；
[0011] 2)将所述1)的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且 具有与1)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列。
[0012] 本发明还提供了上述的编码特异识别猪H11位点的sgRNA的DNA分子。
[0013] 上述的编码特异识别猪H11位点的sgRNA的DNA分子包括但不限于编码序列1) 的分子或序列2)分子。
[0014] 进一步的，上述的编码特异识别猪H11位点的sgRNA的DNA分子由编码序列1的 分子甲或序列2分子乙组成。
[0015] 其中，上述DNA分子甲的核苷酸序列如序列表中的序列3所示。
[0016] 其中，上述DNA分子乙的核苷酸序列如序列表中的序列4所示。
[0017] 本发明的另一个目的是提供所述sgRNA在特异识别和靶向修饰猪HI1基因中的应 用。
[0018] 本发明的再一个目的是特异sgRNA在构建猪H11基因突变库中的应用。所述的猪 H11基因，其基因组序列是如序列表中的序列5所示。
[0019] 本发明提供的特异识别猪H11基因的sgRNA，特异性强，能有效减少CRISPR/Cas9 系统存在的脱靶现象，进而减少非特异性切割所引起的基因组非靶向位点的突变带来的影 响。此外，本发明提供的编码该sgRNA的DNA片段，能通过构建Cas9-sgRNA表达系统实现 在细胞或个体水平上对猪HI1基因进行敲除或修饰，以解析猪H111基因的功能、构建猪HI1 基因突变库，为培育优良品系的猪提供前期技术支持。
【附图说明】
[0020] 图1为测序检测分析酶切载体结果图。
【具体实施方式】
[0021] 以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本 发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
[0022] 实施例1sgRNA表达质粒的构建
[0023] 1、在基因库中调出猪的H11位点序列，其核苷酸序列如序列表中的序列5所示，根 据PAM序列选择用于基因敲除的sgRNA靶点，PAM序列为NGG:
[0024] sgRNA靶位点位置 1 (命名为HI1-sgl) :GITCCTGGAAGTTTAGATCAGGG，相对应的 sgRNA序列中识别该靶点的核苷酸序列如序列表中序列1所示；编码该上述序列的DNA序 列如序列表中的序列3所示。
[0025] sgRNA靶位点位置 2 (命名为HIl-sg2) :AGATCAGGGTGGGCAGCTCTGGG，相对应的 sgRNA序列中识别该靶点核苷酸序列如序列表中序列2所示；编码该上述序列的DNA序列 如序列表中的序列4所示。
[0026] 2、sgRNA表达质粒构建
[0027] 使用唯尚力德公司的cas9/gRNA构建试剂盒（Catalog.No.VK001-01)完成构建， 构建过程如下：
[0028] (1)根据前面所述的两个靶点序列，设计相应的引物序列，由北京天一辉远公司合 成，具体序列见表1 :
[0029] 表1两个sgRNA靶点引物序列
[0030]
【主权项】
1. 特异识别猪H11位点的sgRNA，其序列包括识别染色体上特定的DNA序列片段和骨 架RNA片段，其特征在于，识别染色体上特定的DNA序列片段的核苷酸序列如下1)或2): 1) 序列表中的序列1或序列2所示的核苷酸序列； 2) 将所述1)的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具有 与1)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列。
2. 编码权利要求1所述的特异识别猪H11位点的sgRNA的DNA分子。
3. 根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，由编码所述序列1)的分子或编码序 列2)的分子组成。
4. 根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，由编码所述序列1的分子甲或序列2 的分子乙组成。
5. 根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子甲的核苷酸序列如序列 3所示。
6. 根据权利要求5所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子乙的核苷酸序列如序列 4所示。
7. 权利要求1所述的特异sgRNA在特异识别和靶向修饰猪H11基因中的应用。
8. 权利要求1所述的特异sgRNA在构建猪H11基因突变库中的应用。
【专利摘要】本发明提供了特异识别猪H11位点的sgRNA及其编码DNA和应用，该sgRNA序列包括识别染色体上特定的DNA序列片段和骨架RNA片段，识别染色体上特定的DNA序列片段的核苷酸序列如下1)或2)：1)序列表中的序列1或序列2所示的核苷酸序列；2)将所述1)的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具有与1)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列。本发明所提供的sgRNA能高效的识别猪的H11位点，并借助Cas9酶对该位点进行高效的定点切割，其为后面的针对猪H11位点高效定点整合实验打下了坚实的基础。
【IPC分类】C40B50-06, C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104531685
【申请号】CN201410697338
【发明人】李奎, 阮进学, 杨述林, 李和刚, 牟玉莲, 吴添文, 魏景亮, 徐奎, 黄雷, 周荣, 刘楠
【申请人】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年11月27日