提取茶叶核酸的试剂及用该试剂提取茶叶核酸的提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物技术领域，更具体地说，涉及一种破除茶叶细胞壁，提取茶叶 DNA和RNA的试剂及使用该试剂提取茶叶DNA和RNA的提取方法。
【背景技术】
[0002] 优良品种的茶树都是长期精心选育而成的，传统的茶树品种的鉴定是根据其物理 特性（例如芽叶肥瘦、大小、叶色、叶片厚薄等）和鲜叶化学成分进行鉴别。随着分子诊断 技术的发展，使聚合酶链式反应（PCR)、探针杂交、核酸测序等分子生物学方法直接检测茶 树和茶叶的遗传特性和基因表达情况成为可能。通过对茶叶DNA的检测可以判断茶叶遗传 特性，而对茶叶RNA的检测，可以判断茶叶的基因表达情况，以推测茶叶的性状。利用遗传 背景相同的茶叶，在不同地域或接受不同培养方法，其生长情况会发生变化，茶叶性状也发 生变化。分子诊断技术的第一步就是模板核酸的制备，即样品中核酸的提取，这直接影响着 检测的结果。
[0003] 茶叶中含有的次生代谢物质最为复杂，特别是对DNA提取影响极大的多酚类物质 在茶叶中的含量是所有植物中最高的，因此，茶叶样品中核酸的提取和纯化一直是耗时，繁 琐的过程。虽然目前有分别提取茶叶DNA和RNA的方法，但是这些方法的原理和操作过程 各不相同，没有一个公认的可以同时对茶叶的DNA和RNA进行高效的共同提取的方法。
[0004] 众所周知，茶叶由于细胞壁比较难以破裂，因此在其核酸提取（尤其是RNA)方面， 效果一直不很理想。目前茶叶的核酸提取主要采用裂解细胞后提取核酸的方法，其中常用 的破壁方法主要包括：超声研磨，加入表面活性剂或变性剂，以及一些提取试剂盒等。目前 被广泛采用的市场销售的RNA提取试剂盒价格昂贵，操作步骤繁琐，并且提取效果也并不 理想。因此，如何从茶叶中高效、快捷的共同提取DNA和RNA核酸，已成为了目前分子诊断 技术等技术在茶叶品种、品质鉴定领域中应用的一个瓶颈。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的多酚类物质影响茶叶破壁及RNA 的提取的缺陷，提供一种破除茶叶细胞壁，提取茶叶DNA和RNA的试剂及使用该试剂提取茶 叶DNA和RNA的提取方法。
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种提取茶叶核酸的试剂，包括试 剂A、试剂B、试剂C、试剂D;
[0007]其中，试剂A包括Tris、EDTA、3-[(3-胆固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸、 十二烷基肌氨酸钠、0 -巯基乙醇以及作为溶剂的水；其中Tris的浓度为5-10mM;EDTA的 浓度为5-10mM;3-[(3_胆固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸的体积百分含量浓度为 0. 05% -0. 2%、十二烷基肌氨酸钠体积百分含量浓度为0. 05% -0. 2% ; 0 -巯基乙醇的体 积百分含量浓度为0. 1-0. 5% ;
[0008] 试剂B包括水饱和酚、吡咯烷酮、乙醇；水饱和酚、吡咯烷酮、乙醇的体积比为 (99-98):1:1 ；
[0009] 试剂C包括氯仿和异戊醇；氯仿和异戊醇的体积比为25:1 ;
[0010] 试剂D为无水乙醇。
[0011] 本发明所述的提取茶叶核酸的试剂，其中，所述试剂A的pH值为7. 2-7. 8。
[0012] 本发明所述的提取茶叶核酸的试剂，其中，所述试剂B的pH值为5-8。
[0013] 本发明所述的提取茶叶核酸的试剂，其中，所述试剂A按照如下方法制备：将十二 烷基肌氨酸钠、0 _巯基乙醇、Tris、EDTA、3-[ (3-胆固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸 和水混合，得到试剂A。
[0014] 本发明所述的提取茶叶核酸的试剂，其中，所述试剂B按照如下方法制备：将水饱 和酚、乙醇、吡咯烷酮混合，得到试剂B。
[0015] 本发明所述的提取茶叶核酸的试剂，其中，所述试剂C按照如下方法制备：将氯仿 和异戊醇混合，得到试剂C。
[0016] 本发明还包括一种茶叶核酸的提取方法，利用上述的提取茶叶核酸的试剂进行提 取，包括如下步骤：
[0017] S1、茶叶的研磨：将茶叶磨碎得到茶叶粉末；
[0018] S2、去除茶叶的细胞壁，得到去细胞壁的茶叶裂解液：使用试剂A与茶叶粉末混 匀，再加入试剂B，混匀，进行裂解反应，得到反应液；将反应液离心收集上层水相，即得到 去除细胞壁的茶叶裂解液；
[0019] S3、纯化去细胞壁的茶叶裂解液：在去除细胞壁的茶叶裂解液中加入等体积的试 剂C，进行纯化反应，得到纯化裂解液；
[0020] S4、得到茶叶的DNA和RNA:在纯化裂解液中加入等体积的试剂D，混匀，离心得到 茶叶细胞内的DNA和RNA。
[0021] 本发明所述的茶叶核酸的提取方法，其中，所述茶叶、试剂A和试剂B的配比为 1ug-lg：400y1 ：400y1〇
[0022] 本发明所述的茶叶核酸的提取方法，其中，S2中所述的裂解反应时间为 30-60min〇
[0023] 本发明所述的茶叶核酸的提取方法，其中，S3中所述纯化反应温度为60-70°C。
[0024] 实施本发明的一种破除茶叶细胞壁，提取茶叶DNA和RNA的试剂及使用该试剂提 取茶叶DNA和RNA的提取方法，具有以下有益效果：
[0025] (1)通过调整试剂A的配方比以及在试剂A中加入抗氧化剂等手段，减少茶叶中多 酚、多糖类物质对核酸抽提的影响，进而可从茶叶中高效、快捷地提取DNA和RNA核酸（可 去掉核酸）。
[0026] (2)该茶叶的DNA和RNA提取方法操作简单，成本非常低，提取效果好。
【附图说明】
[0027] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0028] 图1为本发明较佳实施例1中茶叶提取的核酸与CTAB法提取的核酸的甲醛变性 胶电泳对比图。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0030] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0031] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032] 下述实施例所用的试剂：
[0033] 试剂六包括1^8、￡014、3-[(3-胆固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸、十二烷 基肌氨酸钠、0 -巯基乙醇；Tris在试剂A中的浓度为5-10mM;EDTA在试剂A中的浓度为 5-10mM;3-[ (3-胆固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸、十二烷基肌氨酸钠在试剂A中的 体积百分含量浓度均为0. 05% -0. 2% ; 0 -巯基乙醇在试剂A中的体积百分含量浓度为 0. 1-0. 5%；
[0034] 所述试剂A按照如下方法制备：将十二烷基肌氨酸钠、0 -巯基乙醇、Tris、EDTA、 3_[ (3-胆固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸和水混合，得到试剂A;所述试剂A的pH值 为7. 2-7. 8。试剂A的配方组分中，除了Tris外都有抗氧化的作用，这个组分的作用主要 是针对如何减少多酚类物质而设想的。
[0035] 试剂B包括水饱和酚、吡咯烷酮、乙醇；水饱和酚、吡咯烷酮、乙醇的体积比为 (99-98):1:1 ；
[0036] 所述试剂B按照如下方法制备：将水饱和酚、乙醇、吡咯烷酮混合，得到试剂B;其 中，所述试剂B的pH值为5-8。因未饱和的酚会吸收水相而带走一部分核酸。酚也易氧化 发黄，而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联，故在制备酚饱和液时 要加入一特殊物质，以防止酚氧化。
[0037] 试剂C包括氯仿和异戊醇；氯仿和异戊醇的体积比为25:1 ;所述试剂C按照如下 方法制备：将氯仿和异戊醇混合，得到试剂C;氯仿可去除脂肪，使更多蛋白质变性，从而提 高提取效率。异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。
[0038] 试剂