含有s1－5的蛋白质制剂的制作方法

专利名称：含有s1－5的蛋白质制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及S1-5基因缺损、呈现老化性疾患或症状的非人基因敲除动物及其制备方法。此外，本发明还涉及以给与上述动物候选物质为特征的老化性疾患或症状的预防或治疗药物的筛选方法。
背景技术：
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，以下简称RA)是可见关节滑膜组织内异常增生的全身性慢性炎症疾病。滑膜细胞(synovial cell)是在关节的滑膜处形成1～6层上皮样层的成纤维细胞样细胞，被认为向滑膜液提供蛋白聚糖和透明质酸。在RA患者的关节处可见滑膜组织增生及其引起的多层结构、炎症细胞浸润等各种症状。
本发明人在阐明RA发病及进展背后的分子水平机制的研究的过程中，发现了在RA患者的滑膜组织中强力表达的新基因。该基因编码的蛋白与表达组织即滑膜细胞(synovial cell)相关，因而被命名为滑膜素(Synoviolin)(专利文献1)。
此外，本发明人通过蛋白的生化结合实验证明存在滑膜素结合因子S1-5(又名EFEMP-1、FBNL或FBLN-3等)。S1-5是由本发明人首次作为滑膜素结合因子分离的蛋白。
S1-5是作为人二倍体成纤维细胞中的过量表达基因而被分离的(Lecka-Czernik，B.et al.，Molecular and Cellular Biology，15，120-128，1995)，在结构上具有促进DNA合成(细胞增殖活性)的EGF样结构域(EpidermalGrowth Factor-like domain)及血纤蛋白样结构域。此外，最近还有报道称S1-5的变异与Malattia Leventinese(ML)及多因蜂窝状视网膜营养不良(Doyne honeycomb retinal dystrophy)(DHRD)相关(非专利文献1)。
然而，S1-5的详细功能至今未知，关于S1-5缺损时的个体表现型也尚未明确。
专利文献1国际公开第WO02/052007号小册子非专利文献1Stone，E.M.等人，Nature Genetics 22，199-202，1999发明的公开本发明所解决的课题本发明的目的是提供S1-5基因缺损、出现老化性疾患的非人基因敲除动物及其制备方法。本发明的目的还在于提供以给与上述动物候选物为特征的老化性疾患治疗药物等的筛选方法。此外，本发明目的还有提供从该非人基因敲除动物分离的细胞及其用途，以及S1-5蛋白及其用途。
解决本课题的手段本发明人致力于解决上述课题的研究，结果发现丧失S1-5基因功能的基因敲除小鼠会出现老化性疾患或症状。而且，组织学分析表明，该基因敲除小鼠的骨盐量、骨密度、骨强度下降而骨组织中破骨细胞数增加。进一步，体外使用该基因敲除小鼠来源的骨髓细胞进行的破骨细胞形成能力分析结果表明，与野生型小鼠相比，该基因敲除小鼠中破骨细胞形成能力亢进且破骨细胞的大小增大。此外，研究还表明，在该体外体系中加入纯化后的S1-5蛋白可以抑制破骨细胞形成能力，且该细胞的大小减小。
即，本发明如下所述。
(1)丧失全部或部分S1-5基因功能的呈老化性疾患或症状的非人基因敲除动物。
(2)(1)中所述的动物，其中全部或部分S1-5基因功能的丧失是由S1-5基因的损坏或变异引起的。
(3)(1)中所述的动物，其中老化性疾病或症状为选自骨变形、骨质疏松症、脱毛、组织损伤或坏死、肿瘤、胸部肥大、腹水、贫血、出血、皮肤老化及指甲老化中的至少一种。
(4)(1)中所述的动物，可以是选自斑马鱼、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、猪、绵羊、山羊、犬、牛、猴及黑猩猩中的任意一种。
(5)由(1)～(4)任意一项所述的非人基因敲除动物中分离的细胞。
(6)(5)中所述的细胞，可以是破骨细胞、角质化上皮细胞、血细胞、癌细胞、骨髓细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、真皮细胞、肌细胞、神经细胞、成骨细胞、淋巴细胞、血管平滑肌细胞、滑膜细胞、毛乳头细胞、肝细胞、色素细胞、脂肪细胞、子宫内皮细胞或肺泡上皮细胞。
(7)出现老化性疾患的非人基因敲除动物的制备方法，其中使S1-5基因的全部或部分功能丧失。
(8)(7)中所述方法，其中S1-5基因全部或部分功能丧失是由S1-5基因的损坏或变异引起的。
(9)(7)中所述方法，其中老化性疾患或症状为选自骨变形、骨质疏松症、脱毛、组织损伤或坏死、肿瘤、胸部肥大、腹水、贫血、出血、皮肤老化及指甲老化中的至少一种。
(10)(7)中所述方法，其中动物可以是斑马鱼、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、猪、绵羊、山羊、犬、牛、猴及黑猩猩中的任意一种。
(11)老化性疾患或症状的预防或治疗药物的筛选方法，其中针对(1)～(4)任意一项所述的基因敲除动物给与所述预防或治疗药物的候选物质。
(12)老化性疾患或症状的预防或治疗药物的筛选方法，其中使预防或治疗老化性疾患或症状的药物的候选物质与由(1)～(4)任意一项所述的基因敲除动物中分离的细胞相接触。
(13)(12)中所述的方法，其中细胞可以是破骨细胞、角质化上皮细胞、血细胞、癌细胞、骨髓细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、真皮细胞、肌细胞、神经细胞、成骨细胞、淋巴细胞、血管平滑肌细胞、滑膜细胞、毛乳头细胞、肝细胞、色素细胞、脂肪细胞、子宫内皮细胞或肺泡上皮细胞。
(14)(11)～(13)任意一项所述的方法，其中老化性疾患或症状为选自骨变形、骨质疏松症、脱毛、组织损伤或坏死、肿瘤、胸部肥大、腹水、贫血、出血、皮肤老化及指甲老化中的至少一种。
(15)破骨细胞功能抑制剂的筛选方法，其特征是使破骨细胞功能抑制剂候选物质与(1)～(4)任意一项所述的非人基因敲除动物来源的破骨细胞相接触。
(16)下面(a)-(d)任意一项所述的分离的蛋白质。
(a)包含SEQ ID NO2或4所述氨基酸序列的蛋白质。
(b)由包含SEQ ID NO1或3所述碱基序列的编码区的DNA编码的蛋白质。
(c)包含在SEQ ID NO2或4所述氨基酸序列中发生一个或多个氨基酸替换、缺失、插入及/或增加的氨基酸序列的、在功能上与包含SEQ ID NO2或4所述氨基酸序列的蛋白等同的蛋白质。
(d)由可在严紧条件下与包含SEQ ID NO1或3所述碱基序列的DNA杂交的DNA编码的、在功能上与包含SEQ ID NO2或4所述氨基酸序列的蛋白质等同的蛋白质。
(17)(16)所述蛋白质的部分肽。
(18)(17)所述的肽，其包含SEQ ID NO6记载的氨基酸序列。
(19)老化性疾患或症状的预防或治疗药物，其含有(16)所述蛋白质、或者(17)或(18)所述肽的。
(20)(19)所述的预防或治疗药物，其老化性疾病或症状为选自骨变形、骨质疏松症、脱毛、组织损伤或坏死、肿瘤、胸部肥大、腹水、贫血、出血、皮肤老化及指甲老化中的至少一种。
(21)一种破骨细胞功能抑制剂，其含有(16)所述的蛋白质，或者(17)或(18)所述的肽。
(22)一种抗体，其能够与(16)所述的蛋白质、或者(17)或(18)所述的肽结合的。
本发明的效果本发明提供S1-5基因缺损，出现老化性疾病的基因敲除动物及其生产方法。本发明的动物呈骨变形、脱毛、组织损伤、肿瘤发生等各种老化性疾患或症状，因此该动物可用作模型动物，通过给与该动物对老化性疾病治疗或预防有效的物质，可以筛选具有治疗或改善效果的药物组合物。此外，本发明提供从该基因敲除动物分离的细胞。使用该细胞可以筛选治疗或预防老化性疾患的药物。与野生型小鼠的骨髓细胞相比，由该基因敲除动物分离的骨髓细胞分化成破骨细胞时具有更高的TRAP阳性多核巨细胞形成能力，因此可以用TRAP阳性多核巨细胞的数量及/或大小为指标进行筛选破骨细胞功能抑制剂。
本发明进一步提供分离而得的S1-5蛋白及可与S1-5蛋白结合的抗体。通过利用分离而得的S1-5蛋白，可以进行老化性疾病的治疗或预防以及破骨细胞活性的抑制。
实施本发明的最佳方式以下，就本发明进行详细说明。
1.S1-5基因编码S1-5的基因是公知的，可利用登录号AAA65590(核苷酸登录号U03871)、I38849、NP_061489(核苷酸登录号NM 018894)、NP_004096(核苷酸登录号NM 004105)或Q12805所限定的S1-5蛋白及与之类似的、具有人滑膜素蛋白结合活性的蛋白(Lecka-Czernik，B.等人，Mol.Cell.Biol.15，120-128，1995；Heon，E.等人，Arch.Ophthalmol.114，193-198，1996；Ikegawa，S.等人，Genomics 35，590-592，1996；Katsanis，N.等人，Hun.Genet.106，66-72，2000；Giltay，R.等人，Matrix Biol.18，469-480，1999；Stone，E.M.等人，Nat.Genet.22，199-202，1999)。
S1-5基因可以从小鼠、大鼠等的基因组文库中获得。例如，可采用杂交法从细菌人工染色体(BAC)文库中获取目的克隆。此外，也可通过PCR方法获得。
2.非人基因敲除动物本发明提供1)丧失全部或部分S1-5基因功能的、呈现老化性疾患或症状的非人基因敲除动物，及2)出现老化性疾患的非人基因敲除动物的制备方法，其特征是使S1-5基因的全部或部分功能丧失。S1-5基因的全部或部分功能丧失，可以由例如S1-5基因的损坏或者变异引起。
本发明中，丧失全部或部分S1-5基因功能的基因敲除动物的制备，可采用基因打靶方法。
S1-5基因的打靶载体用于通过破坏S1-5基因而使该基因的全部或部分功能丧失。这里，“使功能丧失”包括使基因完全失去功能或使基因的功能处于比野生型更低的状态两方面含义。
为使功能丧失而实施的改变可以是单纯地破坏或缺损基因，也可以进行修饰，如在基因中引入变异而使翻译阶段阅读框出现偏移等。
本发明的“基因敲除动物”可按以下方法制备。
首先，将碱基序列部分或全部发生修饰的S1-5基因导入分化全能性细胞，并筛选出导入了发生改变的S1-5基因的分化全能性细胞。接下来，将筛选出的实施了基因修饰(缺损、破坏、变异等)的分化全能性细胞导入受精卵制备嵌合个体，通过所得嵌合个体的交配，可以产生敲除了同源染色体中一条或两条上的S1-5基因的个体。
本发明所使用的动物的种类没有特别限制。例如，可以是除人之外的斑马鱼、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、猪、绵羊、山羊、犬、牛、猴及黑猩猩等。本发明优选容易操作和繁殖的小鼠。
本说明书中，为使S1-5基因丧失功能，可以修饰S1-5基因的部分或全部碱基序列。所谓“修饰”是指向S1-5基因DNA的一部分加入可以引起缺损、替换或添加的变异。这种变异，例如可以是由基因工程方法造成的碱基序列的部分或全部去除(缺失)、或者其它基因或碱基序列的插入或替换。例如，可以通过使密码子阅读框发生偏移、破坏启动子或外显子的功能等方法制备S1-5缺损基因。这样可以使S1-5基因的表达产物S1-5蛋白的功能消失。
本发明的基因敲除小鼠可采用公知的基因重组方法(基因打靶法)制备。基因打靶方法是本领域中为人熟知的技术，在本领域的各种实验手册中均有讲述。
在设计基因打靶载体时，可造成S1-5基因结构变化的位点，只要S1-5基因功能缺失，没有特别的限定。然而，考虑到S1-5基因的功能及结构，特别优选设计使得S1-5基因的EGF样结构域或血纤蛋白样结构域缺失。
此外，关于导入了载体的重组体的挑选，优选联合运用利用通过基因打靶载体导入的药物抗性基因的筛选方法与利用Southern杂交和PCR的筛选方法。作为药物选择性标记基因，可以使用新霉素抗性基因、潮霉素B磷酸转移酶基因等。此外，在阴性选择基因方面，可以使用HSV胸苷激酶基因、白喉毒素A基因等。
使用按上述方法制备的基因打靶载体进行同源重组。在本说明书中，同源重组是指人工地使发生修饰的S1-5基因重组于基因组中S1-5基因的DNA区域。
为获得目标同源重组体，需要对多个重组体进行筛选。但是，从技术层面讲在受精卵中进行多个筛选是困难的。因此，优选使用与受精卵同样具有多分化能力且可体外培养的细胞。作为分化全能性细胞，对小鼠(Nature292154-156，1981)、大鼠(Iannaccone，P.M.等人，Dev.Biol.163.(1)288-292，1994))、猴(Thomson，J.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(17)7844-7848，1995)及兔(Schoonjans，L.等人，Mol.Reprod.Dev.45(4)439-443，1996)而言，已建立的有ES细胞等。此外，对家猪而言，已建立的有EG(embryonic germ，胚胎生殖干)细胞(Shim，H.等人，Biol.Reprod57(5)1089-1095.1997)。
因而，本发明中优选以上述动物物种为对象，特别是以在基因敲除动物制备方面技术完备的小鼠为最佳。在小鼠ES细胞方面，现在已建立起数个小鼠来源的ES细胞株，例如可以使用TT-2细胞株，AB-1细胞株、J1细胞株、R1细胞株等。至于究竟使用上述哪一种ES细胞株，可以根据实验目的与方法做出合适的选择。
在建立ES细胞时，通常使用受精后第3.5天的胚泡，除此之外，如果对8细胞期胚进行采卵，然后培养至形成胚泡，使用该胚泡可以高效地获得多个初期胚。
以上述方式获得的ES细胞株通常具有极好的增殖性能，但也容易丧失能够个体发育的再生能力，因此传代培养时必须特别注意。例如，可在诸如STO成纤维细胞这样的合适的滋养细胞(feeder cell)上、在LIF(1～10000U/mL)存在下，在二氧化碳培养箱内(优选5％二氧化碳、95％空气或5％氧气、5％二氧化碳、90％空气)、约37℃条件下进行培养；传代时，例如可以采用通过胰蛋白酶/EDTA溶液处理实现单细胞化，然后接种在新鲜制备好的滋养细胞上的方法。这样的传代通常每1～3天进行一次，优选同时进行细胞形态观察。
关于针对ES细胞的基因导入，可以采用磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、脂质体转染法、反转录病毒转染法、凝集法、显微注射法、基因枪法等方法，但因其可简便地对多个细胞进行处理而优选电穿孔法。
对所获得的重组ES细胞进行筛选以确定其是否发生了同源重组。即，首先通过抗新霉素等的药物抗性因子进行筛选。药物抗性基因包括例如新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因、潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因等；报告基因包括例如β-半乳糖苷酶(lacZ)基因、氯霉素乙酰转移酶(cat)基因等。
进一步，对于获得的重组ES细胞，可以用位于S1-5基因上或其附近的DNA序列为探针进行Southern杂交分析，或者以基因打靶载体上的DNA序列和在基因打靶载体上使用的小鼠来源的S1-5基因以外的邻近区域DNA序列为引物进行PCR，来筛选是否确实发生了同源重组。
通过上述测定，可以选择出存在于染色体上的野生型S1-5基因与导入的S1-5基因片段间正确地发生同源重组、从而使变异转移至染色体S1-5基因的细胞。
将已确认发生导入基因整合的ES细胞返回到同种非人哺乳动物来源的胚内，可整合至宿主胚细胞团形成嵌合胚。将ES细胞导入胚泡等胚中的方法已知有显微注射法、凝集法等，但无论采用何种方法均是可以的，本领域技术人员可进行适当的改变。
当使用小鼠时，首先采用激素剂(例如，使用具有FSH样作用的PMSG或具有LH样作用的hCG)对雌性小鼠实施过排卵处理，然后使之与雄性小鼠交配。此后，如使用胚泡，在自受精始的第3.5天、如使用8细胞期胚则在第2.5天，分别由子宫回收早期发育胚。在体外将利用基因打靶载体实施了同源重组的ES细胞注射到如此回收的胚中，从而制备嵌合胚。或者摘除小鼠二日胚(8细胞期胚)的透明带，然后与ES细胞一起培养使之形成细胞团。该细胞团经一日培养后形成胚泡。将该胚泡移植入代孕母鼠体内经发育生长可以获得嵌合小鼠。作为代孕母鼠的假孕雌小鼠，可以采用使处于正常性周期的雌小鼠与通过输精管结扎等方式去势的雄小鼠交配的方式获得。针对上述假孕雌小鼠，将按上述方法制备的嵌合胚移植入其子宫内，使之受孕并生产，可以制备嵌合小鼠。为能够切实地引发嵌合胚的着床和妊娠，优选采集受精卵的雌小鼠与作为代孕母鼠的假孕小鼠来自于处于同一性周期的雌小鼠群。
接下来从代孕母鼠产下的幼仔中筛选嵌合小鼠。如果小鼠个体来源于ES细胞移植胚，则使这些嵌合小鼠与野生型小鼠交配，然后验证第二代个体是否表现出来源于ES细胞的性状。当第二代个体表现出ES细胞来源的性状时，可认为存在ES细胞已经导入嵌合小鼠种系(germ-line)的可能性。验证ES细胞已经导入种系可采用许多性状作为指标，从验证容易的角度考虑，优选以毛色为指标。已知小鼠的毛色可以是野鼠灰色(刺豚鼠色)、黑色、土黄色、巧克力色和白色等。此外，也可以从小鼠身体的某部位(例如尾尖)提取染色体DNA，然后通过Southern印迹分析或PCR测定进行挑选。嵌合的贡献率(寄与率)高的小鼠，ES细胞导入嵌合小鼠种系的可能性高。按上述方法挑选出嵌合小鼠后，使该嵌合小鼠与野生型雌小鼠交配，获得F1，从而建立变异小鼠系统。
按上述方法获得的嵌合动物，是仅同源染色体中的一条存在基因缺失的杂合子。为了获得两条同源染色体上均存在S1-5基因缺失的纯合子基因敲除动物，可以让F1动物中仅同源染色体中的一条存在S1-5基因缺失的杂合子间互相杂交。
所获基因敲除动物的确认，通过从组织中提取染色体DNA然后进行Southern杂交或PCR的方式进行。此外，解剖时可见各组织、器官的异常。进一步，由组织中提取RNA，通过Northern印迹可以分析基因的表达模式。更进一步，必要时可以采血，然后实施血液检查或血清生化检查。
这里，制备的纯合子基因敲除动物可能不能够发育成为成熟个体甚至胚胎致死，从而不适于作为模型动物。这种情况下，优选在必要的时期进行基因敲除。此外，为了研究生物体内某特定组织中基因的功能，优选组织特异性地进行基因敲除。这样的只在特定时期、特定的细胞系中进行基因敲除及仅在体细胞的限定区域进行基因敲除的动物称为条件性敲除动物。(生物手册系列丛书8，基因打靶利用ES细胞制备变异小鼠，相沢慎一著，羊土社，1995)。
关于条件性基因敲除动物的制备方法，例如可在基因打靶方法中使用细菌噬菌体P1来源的重组系统即Cre-loxP系统(R.Kuhn等人.Science，269，1427-1429，1995)。Cre是一种重组酶，它可识别称作loxP的34碱基序列，并在该位点引起重组。因而，通过将欲基因打靶的基因插入两loxP序列之间并将Cre重组酶基因整合至特异启动子的下游，可以位点特异性地且时期特异性地产生Cre，从而切除夹在loxP序列之间的基因(即在特定的位点和时期使目的基因丧失功能)。在本发明中，使用Cre-loxP设计基因打靶载体时，造成S1-5基因结构变化的位点，只要S1-5基因缺损，没有特别的限定。然而，考虑到S1-5基因的功能及结构，特别优选设计使得S1-5基因的EGF样结构域或血纤蛋白样结构域的区域发生缺失。
3.从非人基因敲除动物分离的细胞本发明还提供从本发明的基因敲除动物分离的细胞。如后述，从本发明的基因敲除动物分离的细胞可用于预防或治疗老化性疾患或症状的药物的筛选。
作为上述的细胞，例如可以是破骨细胞、角质化上皮细胞、血液细胞、癌细胞、骨髓细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、真皮细胞、肌细胞、神经细胞、成骨细胞、淋巴细胞、血管平滑肌细胞、滑膜细胞、毛乳头细胞、肝细胞、色素细胞、脂肪细胞、子宫内皮细胞或肺泡上皮细胞，但不仅限于此。
上述细胞可以通过本领域技术人员公知的方法从该基因敲除动物分离获得。
4.老化性疾患本发明的非人基因敲除动物呈现老化性疾患或症状。已知的老化模型小鼠方面， 已知有Klotho变异小鼠(Kuro-o，M.等人，Nature，6；390(6655)18～19，1997)、快速老化模型小鼠(SAM)(Takeda，T.等人，MechAgeing Dev.，17(2)，183-184，1981)、韦尔纳综合征(Werner Syndrome)小鼠，但上述小鼠呈现早老，而且寿命很短。本发明的非人基因敲除动物(例如S1-5基因敲除小鼠)的一个特点是与野生型小鼠相比寿命无变化，且可见多种老化性疾患或症状的严重化。本发明中，“老化性疾病和症状”包括骨变形、骨质疏松症、脱毛、组织损伤或坏死、肿瘤、胸部肥大、腹水、贫血、出血、皮肤老化(斑点、无光、松弛、细纹、黑痣)及指甲的老化等，上述疾病或症状可以单独或共同出现。这里，“骨变形”是指由老化、RA、骨质疏松症等引起的骨软骨强度下降、骨及软骨变形。“骨质疏松症”是指全体骨成分减少，易骨折的状态。90％以上的骨质疏松症是未发现明确病因的原发性骨质疏松症，而几乎全部的原发性骨质疏松症都是发生于中老年时期的退行性疾病。与此相区别的是继发性骨质疏松症，其发病原因可以是巴泽多病(Basedow’s disease)、库欣综合征(Cushing’s syndrome)、重症糖尿病、RA、胃部手术、饮酒过量、服用类固醇药物等。“肿瘤”是指全部肿瘤发生细胞的成长和增殖以及全部的癌前及癌性细胞和组织，而不论其为恶性或良性。本发明的肿瘤可以是原发性肿瘤，也可以是转移性肿瘤。术语“癌”及“癌性”，典型地是指处于以无法控制的细胞生长为特征的生理学状态，本发明中，“肿瘤”的实例包括癌、肉瘤、白血病及恶性淋巴瘤。本发明中，癌包括例如乳腺癌、前列腺癌、大肠癌、鳞状上皮细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、胰癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝脏癌、膀胱癌、肝细胞瘤、结肠直肠癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌及各种头部和颈部癌症。本发明中，肉瘤包括例如恶性骨瘤和恶性软组织肉瘤，具体地说包括骨肉瘤、软骨肉瘤、尤因氏(Ewing’s)肉瘤、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤及滑膜肉瘤等。
5.老化性疾患治疗药物或预防药物的筛选本发明提供老化性疾病或症状的治疗药物或预防药物的筛选方法，其中对非人基因敲除动物给与候选物质。
该筛选方法是从老化性疾患或症状预防或治疗药物的候选物质中选择出具有与基因敲除动物表现型互补的活性的物质。与基因敲除动物的表现型互补并非仅指完全互补，还包括非完全互补。
具体地讲，首先使候选物质与本发明的基因敲除动物或其部分相接触，然后测定接触了前述候选物质的非人动物或其部分中与目标疾病具有相关关系的指标值并与对照相比较，最后基于比较结果，评价候选物对指定老化性疾患的效果。例如，可以用骨密度上升、抗肿瘤效果、血细胞等增加、止血能力提高、破骨细胞活性抑制等为指标，测试候选物的预防、治疗、改善效果。此外，也可用于筛选针对出现皮肤老化(斑点、无光、松弛、细纹、黑痣等)的动物具有美白及抗老化效果的化妆品。
“基因敲除动物或其部分”包括动物个体全身及限定的组织或器官两方面含义。当指限定的组织或器官时，包括已从动物体内取出的组织或器官。
候选物质可以包括例如肽、蛋白质、非肽类化合物、合成化合物、发酵产物、细胞抽提液、植物抽提液、动物组织抽提液、血浆等，上述化合物可以是新化合物，也可以是公知的化合物。上述候选物质可以成盐，作为候选物质的盐类，可以使用候选物质与生理上允许的酸(例如无机酸等)、碱(例如有机酸等)形成的盐，特别优选与生理上允许的酸加成盐。作为这样的盐类，例如可以使用候选物与无机酸(例如盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸等)或有机酸(例如醋酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸等)等的盐。
作为以候选物质处理实验动物的方法，例如可以采用口服、静脉注射、涂抹、皮下给药、皮内给药、腹腔给药等，可结合实验动物的症状、候选物的性质等做出适合地选择。此外，候选物质的给药量及给药方法，可根据候选物质的性质等做出合适的选择。
例如，筛选预防、治疗、改善骨质疏松症的药物时，对本发明的基因敲除动物等给与候选物质，然后通过随时间测定该动物的骨密度值、X光照片及体重变化等，可以筛选出显示有效性的物质。特别是根据本发明基因敲除动物中骨质疏松症与脊柱后凸具有相关性，因此可以明确基因敲除动物出现后凸的程度可以作为测定骨质疏松症进展程度的一项指标。从上述事实来看，对本发明的基因敲除动物给与候选物，并随时间利用X光照片等测定该动物脊柱后凸的程度，即可非侵入性地、高效地判断候选物质是否显示出对于骨质疏松症的有效性。
此外，使用从本发明的基因敲除动物分离的细胞可进行预防或治疗老化性疾患或症状的药物的筛选。具体地说，这里提供了预防或治疗老化性疾患或症状的药物的方法，包含使预防或治疗老化性疾患或症状的药物的候选物质与从本发明的基因敲除动物分离的细胞相接触的步骤。
本发明中的“接触”，例如可以通过向从本发明的基因敲除动物分离的细胞的培养液中添加该候选物质的方式进行。此外，当该候选物质是蛋白质时，例如可以通过将携带编码该蛋白的DNA的载体导入从基因敲除动物分离的细胞的方式进行。
本发明中，从预防或治疗老化性疾患或症状的药物的候选物质中，选择具有与从基因敲除动物分离的细胞的表现型互补的活性的物质。关于由基因敲除动物分离的细胞的表现型，没有特别的限定，例如对于破骨细胞而言可以是破骨细胞活性的抑制、对于骨髓细胞而言可以是破骨细胞形成的抑制，对于角质化上皮细胞而言可以是角质化上皮细胞的增殖、对于血细胞而言可以是血细胞分化的促进、对于癌细胞而言可以是癌细胞增殖的抑制、对于成纤维细胞而言可以是成纤维细胞的增殖、对于血管内皮细胞可以是血管内皮细胞的增殖、对于真皮细胞而言可以是毛发形成、对于肌细胞而言可以是肌细胞变性的纠正、对于神经细胞而言可以是神经细胞变性的纠正、对于成骨细胞而言可以是成骨细胞增殖与分化的促进、对于淋巴细胞而言可以是淋巴细胞活化的抑制、对于血管平滑肌细胞而言可以是增殖的抑制、对于滑膜细胞而言可以是功能正常化、对于毛乳头细胞而言可以是生毛、对于肝细胞而言可以是功能正常化、对于色素细胞而言可以是黑色素产生抑制、对肺泡细胞而言可以是活化异常的纠正、对于脂肪细胞而言可以是分化增殖的抑制、对于子宫内皮细胞而言可以是内皮细胞增殖的抑制等。此外，与该细胞表现型互补并非仅指完全互补，还包括非完全互补的情况。
破骨细胞功能抑制剂的筛选本发明提供破骨细胞功能抑制剂筛选方法，其包括使破骨细胞功能抑制剂候选物质与从基因敲除动物分离的细胞相接触的步骤。“破骨细胞功能”包括例如吸收腔隙形成功能(吸收腔隙形成活性)、耐酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性细胞形成抑制功能(TRAP阳性细胞形成抑制活性)，但并不仅限于此，只要是可直接或间接导致骨破坏的功能，均在所述的“破骨细胞功能”之列。
破骨细胞功能抑制剂，例如可以用从本发明的基因敲除动物分离的破骨细胞的形成数多少、大小、TRAP活性值等为指标进行筛选，但并不仅限于此方法，例如可如实施例所述，使从本发明的基因敲除动物分离的骨髓细胞分化为多核巨细胞，然后以TRAP阳性多核巨细胞的数量和TRAP阳性多核巨细胞的大小等为指标进行筛选(Takahashi N.等人，Endocrinology，123(5)2660-2，1988、Yasuda H.等人，Proc Natl Acad Sci USA.，31；95(7)，3597-602，1998)。
此外，破骨细胞功能抑制剂可在pit assay系统中以吸收腔隙形成活性为指标进行筛选(Hirayama，T.等人，J Endocrinol.2002 Oct；175(1)155-63、Udagawa，N.等人，Bone.1999 Nov；25(5)517-23)。
通过上述方法选出的抑制破骨细胞活性的物质，可作为破骨细胞功能抑制剂应用于研究领域或医药领域。此外，本发明的破骨细胞活性抑制可作为老化性疾患或症状的预防或治疗药物加以应用。
此外，如果对RA患者的骨质破坏部分中增殖的滑膜向骨内侵入的最前沿进行病理学检查，可以观察到许多多核巨细胞。已经清楚这种细胞为TRAP阳性，即满足作为破骨细胞的表现型，可以推断在RA骨质破坏中破骨细胞起非常重要的作用(Arthritis Rheum.Mar；50(3)794-804，2004、Biochem Biophys Res Commun.Nov 17；240(2)279-86，1997)。因此，本发明的破骨细胞功能抑制剂也可作为RA的预防或治疗药物加以利用。
7.分离的S1-5蛋白本发明提供1)由包含序列号编号1或3所述碱基序列的编码区的DNA编码的经分离的S1-5蛋白、以及2)包含SEQ ID NO2或4所述氨基酸序列的经分离的S1-5蛋白。这里，“分离”是指已从天然环境中取出的状态。
上述蛋白，例如也可以重组体的形式制备。例如，对人S1-5蛋白而言，可以从表达人S1-5蛋白的细胞(例如，人二倍体成纤维细胞(human diploidfibroblast)、作为滑膜组织或培养细胞回收的RA患者来源的滑膜细胞)提取mRNA，以该mRNA为基础获得cDNA文库(Short，J.M.等人，Nucleic AcidResearch，16，7583，1988)。然后，通过使用基于SEQ ID NO1所示碱基序列而设计的探针从该文库中筛选杂交克隆，可以分离得到编码S1-5蛋白的DNA。利用本领域技术人员公知的蛋白表达系统可以获得由该DNA编码的S1-5蛋白。此外，可以从表达人S1-5蛋白的细胞的培养物中回收、纯化人S1-5蛋白。
此外，本发明还提供在功能上与上述S1-5蛋白等同的蛋白质。这样的蛋白质所来源的生物物种没有特别的限定，例如可以列举出人、斑马鱼、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、猪、山羊、绵羊、犬、牛、猴及黑猩猩等。
在功能上与上述S1-5蛋白等同的蛋白质包括例如1)包含在SEQ IDNO2或4所述氨基酸序列中发生一个或多个氨基酸替换、缺失、插入及/或添加的氨基酸序列的、在功能上与包含SEQ ID NO2或4所述氨基酸序列的蛋白质等同的分离的蛋白质，及2)由可在严紧条件下与包含SEQ IDNO1或3所述碱基序列的DNA杂交的DNA编码的、在功能上与包含SEQ ID NO2或4所述氨基酸序列的蛋白质等同的分离的蛋白质。
在功能上与上述S1-5蛋白等同的蛋白质可包括例如具有抑制人老化性疾患或症状的功能的蛋白质、具有与本发明的基因敲除动物或由本发明的基因敲除动物分离的细胞的表现型互补的功能的蛋白。
此外，在功能上与上述S1-5蛋白等同的蛋白质可包括例如免疫学上等同的蛋白质。本发明的“在免疫学上与S1-5蛋白等同的蛋白质”，只要可以与特异性识别S1-5蛋白的抗体反应，没有特别的限定。例如，作为在免疫学上与S1-5等同的蛋白，可以包括S1-5蛋白的表位肽段、含有该表位的S1-5蛋白结构域、或含有该结构域的蛋白。
S1-5蛋白的片段可通过蛋白酶消化获得。此外，也可通过随机切断SEQID NO1或3所示的编码S1-5蛋白的DNA、将其插入噬菌体载体，然后制成展示结构域肽(domain peptide)的噬菌体文库而获得。以识别S1-5蛋白的抗体对这些文库进行免疫筛选，可以确定免疫学活性结构域。对克隆的噬菌体而言，在测定插入片段的碱基序列后，即可明确活性结构域的氨基酸序列。
除免疫学特性之外，根据本发明的在功能上与S1-5蛋白等同的蛋白质，也可基于与滑膜素的结合特性进行定义。即，本发明包含具有滑膜素亲和性的S1-5蛋白的片段。通过用滑膜素对候选蛋白质进行筛选，本领域技术人员可以很容易地选择出这样的变异体。例如，S1-5蛋白需要对应于滑膜素cDNA上1233-1592位碱基的120个氨基酸作为与滑膜素结合的必要区域。因此，可与由构成该区域的氨基酸序列组成的蛋白质、或与包含该氨基酸序列的蛋白质相结合的蛋白质，均构成根据本发明的在功能上与S1-5蛋白等同的蛋白质。
并且，根据本发明的在功能上与S1-5蛋白等同的蛋白质，也可以基于S1-5蛋白具有的生化活性进行定义。S1-5蛋白的生化活性包括例如破骨细胞形成抑制活性和细胞增殖抑制活性(Lecka-Czernik，Mol.Cell.Biol.199515120-128)。
上述在功能上与S1-5蛋白等同的蛋白质，可与其它蛋白质形成融合蛋白。例如，添加有FLAG标签、HA标签或组氨酸标签等附加氨基酸序列的、并保持上述的作为在功能上与S1-5蛋白等同的蛋白的至少一种性状的蛋白质，均包含于上述功能等同的蛋白质之列。当添加的蛋白质具有异于S1-5蛋白的活性时，如果可以保持S1-5蛋白所具有的至少一种功能，则该融合蛋白也包含于本发明的功能上等同的蛋白之列。
上述在功能上与S1-5蛋白等同的蛋白，可由本领域技术人员采用公知的方法(实验医学分册·基因工程手册，pp246-251、羊土社、1991年发行)进行分离。例如，如果以关注的文库为对象，以SEQ ID NO1或3所示的碱基序列(或其片段)为探针进行筛选，则可以克隆具有高同源性碱基序列的DNA。这样的文库，可以包括例如针对SEQ ID NO1或3的碱基序列引入随机突变的文库、来源于人或人以外的物种的滑膜组织cDNA文库等。
作为针对给定的碱基序列引入随机突变的方法，例如通过DNA的亚硝酸处理引起碱基对替换的方法已为人所熟知(Hirose，S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，797258-7260，1982)。在该方法中，通过以亚硝酸处理需引入突变的片段，可在特定片段内随机引入碱基对替换。此外，可在任意位置引入目标突变的技术有缺口双链体(gapped duplex)方法等(Kramer W.和Fritz HJ.，Methods in Enzymol.，154350-367，1987)。将克隆有需引入突变的基因的环状双链载体变成单链，与在目标位点携带突变的合成寡核苷酸进行杂交。使来源于经限制性酶切割而线性化的载体的互补单链DNA与前述环状单链载体退火，使用DNA聚合酶填补其与前述合成核苷酸之间的缺口，进而通过连接可以形成完整的双链环状载体。
发生修饰的氨基酸的个数，典型地应该在50个氨基酸以内，优选30个氨基酸以内，更优选5个氨基酸以内(例如1个氨基酸)。
一般认为在人为地替换氨基酸时，如果替换成性质相近的氨基酸，则比较易于维持原蛋白质的活性。本发明的蛋白质包括在上述氨基酸替换中发生了保守替换的、在功能上与人S1-5蛋白(SEQ ID NO2或4)等同的蛋白。在替换对蛋白质活性重要的结构域的氨基酸等场合，保守替换被认为是十分重要的。这种氨基酸的保守替换已为本领域技术人员所熟知。
作为相当于保守替换的氨基酸组群，包括例如碱性氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)等。
此外，非保守替换被认为可以造成蛋白质活性等的进一步提高(例如包括组成性活化型蛋白等)或下降(例如包括显性负突变(dominantnegative))。
包含在SEQ ID NO2或4所述氨基酸序列中发生一个或多个氨基酸替换、缺失、插入及/或增加的氨基酸序列的、在功能上与包含SEQ ID NO2或4所述氨基酸序列的蛋白质等同的蛋白质，包括天然存在的蛋白质。一般地真核生物基因中存在如已知的干扰素基因那样的多态性(polymorphism)。起因于这种多态性的碱基序列变化，有时会引起一个或数个氨基酸的替换、缺失、插入及/或添加。这样的天然存在的、具有在SEQID NO2或4所述氨基酸序列中发生一个或多个氨基酸替换、缺失、插入及/或添加的氨基酸序列的、且在功能上与包含SEQ ID NO2或4所述氨基酸序列的蛋白质等同的蛋白质，包含在本发明中。
或者，在有些情况下，虽然多态性引起碱基序列的变化，但氨基酸序列并未发生改变。这样的碱基序列突变称为沉默突变。包含具有沉默突变的碱基序列的DNA所编码的蛋白，也包含在本发明中。而且，这里所说的多态性是指在团体内某基因具有个体间不同的碱基序列。多态性与不同基因出现的比例无关。
此外，获取功能上与S1-5蛋白等同的蛋白的方法，可以列举利用杂交的方法。即，以SEQ ID NO1或3所示的编码本发明的S1-5蛋白的DNA、或其片段为探针，分离出可与之杂交的DNA。如果杂交是在严紧条件下进行的，那么可以选择出碱基序列同源性高的DNA，而作为其结果，在所分离的蛋白中包含功能上与S1-5蛋白等同的蛋白的可能性也高。同源性高的碱基序列，例如是指70％以上、优选90％以上的同一性。
并且，严紧条件具体地例如在6×SSC、40％甲酰胺、25℃杂交，在1×SSC、55℃洗涤的条件。严紧度受盐浓度、甲酰胺浓度或温度等条件的影响，很明显，本领域技术人员可对这些条件进行设定以获得必要的严紧度。
利用杂交，例如可以分离出人以外的动物物种中编码S1-5蛋白同源物(homolog)的DNA。可从人以外的动物物种即斑马鱼、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、猪、绵羊、山羊、犬、牛、猴及黑猩猩等动物物种获得的DNA所编码的S1-5蛋白类似物，构成本发明的在功能上等同的蛋白。
上述的在S1-5蛋白(SEQ ID NO2或4)中引入突变而得的蛋白质及由利用如上所述的杂交技术分离的DNA编码的蛋白质，通常在氨基酸序列上与S1-5蛋白(SEQ ID NO2或4)具有高同源性。高同源性是指至少30％、优选至少50％、更优选至少80％(例如至少95％)的序列同一性。碱基序列或氨基酸序列的同一性，可通过利用因特网的同源性检索网站确定[例如在日本数据银行(DDBJ)中可利用FASTA、BLAST、PSI-BLAST及SSEARCH等同源性检索(例如日本数据银行网站的同源性检索(Search andAnalysis)网页http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html)。此外，在National Center for Biotechnology Information(NCBI)中可使用BLAST进行检索(例如NCBI主页网站的BLAST网页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/；Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.，1990，215(3)403-10；Altschul，S.F.和Gish，W.，Meth.Enzymol.，1996，266460-480；Altschul，S.F.等人，Nucleic Acids Res.，1997，253389-3402)]。
例如，Advanced BLAST 2.1中的氨基酸序列同源性计算，程序使用blastp、Expect值设定为10、Filter设定为全关闭(OFF)、Matrix使用BLOSUM62、Gap existence cost、Per residue gap cost和Lambda ratio分别设定为11.1和0.85(默认值)进行检索，可以获得同一性(identity)的值(％)(Karlin，S.和S.F.Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-68；Karlin，S.和S.F.Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-7)。
根据本发明的蛋白质及在功能上与之等同的蛋白质，可以是施加了糖链等生理性修饰、荧光或放射性物质标记或者与其它蛋白融合等各种修饰的蛋白。特别是对于后述的基因重组体而言，由于表达宿主的不同，糖链修饰可能存在差异。然而，即使蛋白质在糖链修饰方面有所差异，只要其显示出与本说明书中公开的S1-5蛋白相同的性状，均为根据本发明的S1-5蛋白或在功能上等同的蛋白质。
S1-5蛋白不仅可从生物材料中获得，还可将编码该蛋白质的基因导入适当的表达系统以基因重组体(recombinant)的形式获得。为了通过基因工程方法获得S1-5蛋白，可将前述的编码S1-5蛋白的DNA整合入适当的表达系统并使之表达。作为可应用于本发明的宿主/载体系统，包括例如表达载体pGEX与大肠杆菌(Escherichia coli)。pGEX可以与谷胱甘肽S-转移酶(GST)形成融合蛋白的形式表达外源基因(Gene，6731-40，1988)，因此采用热冲击方法将携带S1-5蛋白编码基因的pGEX导入BL21等大肠杆菌菌株，在经过适当的培养时间后，添加异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)可诱导GST融合的S1-5蛋白的表达。S1-5蛋白的编码基因可以滑膜细胞cDNA文库等为模板，通过PCR等方法扩增获得。根据本发明的GST可吸附于谷胱甘肽-Sepharose 4B，因此通过亲和层析可以很容易地对表达产物进行分离和纯化。
作为用于获取S1-5蛋白基因重组体的宿主/载体系统，除上述之外也可使用下述产品。首先，当采用细菌为宿主时，有许多商品化的携带组氨酸标签、HA标签、FLAG标签等的融合蛋白表达载体可供选择。在酵母方面，毕赤氏酵母属(Pichia)酵母可有效表达具有糖链的蛋白已是公知的事实。在糖基化修饰方面，利用以昆虫细胞为宿主的杆状病毒载体的表达系统也是十分有效的(Bio/Technology，647-55，1988)。进一步，利用哺乳动物细胞，可进行携带CMV、RSV或SV40等启动子的载体的转染，这些宿主/载体系统均可作为S1-5蛋白的表达系统加以应用。此外，也可利用反转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体(adeno-associated virus)等病毒载体进行基因导入。
所获得的本发明的蛋白质，可从宿主细胞内或细胞外(培养基等)分离，并被纯化为基本上纯且均一的蛋白质。蛋白质的分离、纯化可采用一般蛋白质纯化中使用的分离、纯化方法，而无任何的限制。例如可适当地选择、组合层析柱、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂抽提、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、透析、重结晶等方法进行蛋白质的分离和纯化。
层析方法包括例如亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析等(Marshak等人，Strategies for Protein Purification andCharacterizationA Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Gold SpringHarbor Laboratory Press，1996)。上述层析可采用液相层析，例如HPLC、FPLC等进行。
本发明的蛋白质的表达，优选使用无细胞系以外的表达系统。此外，本发明的蛋白优选具有生理的高级结构、糖基化、二硫键、脂质化、甲基化等修饰。此外，本发明的蛋白质优选基本上纯化的蛋白质。这里，“基本上纯化”是指本发明的蛋白质的纯化度(本发明的蛋白质占总蛋白质的比例)为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、100％或接近100％。纯化度接近100％的上限取决于本领域技术人员的纯化技术和分析技术，例如可以为99.999％、99.99％、99.9％、99％等。
并且，只要是具备上述纯化度的蛋白质，无论其采用何种纯化方法纯化，均包含于经基本上纯化的蛋白质之列。例如通过适当选择或组合上述的层析柱、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂抽提、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、透析、重结晶等方法基本上纯化的蛋白质，但不仅限于此。
此外，本发明还提供上述本发明的蛋白质的部分肽(部分片段)。该部分肽只要在功能上与本发明的蛋白等同，其长度没有特别限定。本发明的部分多肽可包括例如包含SEQ ID NO6所记载的氨基酸序列的、比本发明的蛋白短的肽。利用这种肽，可进行老化性疾患或症状的预防或治疗，还可以抑制破骨细胞的活性。
8、药物本发明提供含有本发明的蛋白质或其部分肽(以下简称蛋白质等)的预防或治疗老化性疾患或症状的药物。“老化性疾患或症状”如上所述。进而，本发明提供含有本发明的蛋白质等的破骨细胞功能抑制剂。这些药物中的蛋白，只要是分离的，对于其状态没有特别的限定；而只要可作为上述药剂使用，既可使用基本上纯化的蛋白质等，也可以使用处于粗品状态的蛋白质等。
这些药物可作为人或人以外的动物(例如实验动物、畜养动物、宠物动物等)的老化性疾病或症状的预防或治疗药物使用，也可作为破骨细胞功能抑制剂使用。
本发明的蛋白可与药学上可接受的载体或介质，例如灭菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、防腐剂、表面活性剂、螯合剂(EDTA等)、粘合剂等适当组合构成制剂并进行给药。
本发明的药物的形态(剂型)，可以包括例如注射剂、冻干剂、溶液剂等，但不仅限于此。
针对患者的给药方式可以是口服或非口服给药，优选非口服给药，例如可以是注射给药。作为注射给药的例子可以是通过静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射等方式进行全身或是局部给药。
给药量可根据患者的体重和年龄、给药方法、症状等变化，本领域技术人员可以适当地选择合适的给药量。一般的给药量因药物的有效血中浓度、代谢时间而异，1日的维持量为约0.1mg/kg～约1.0g/kg，优选约0.1mg/kg～约10mg/kg，更优选约0.1mg/kg～约1.0mg/kg。给药可以分为一次或多次进行。
9.抗体本发明提供识别S1-5蛋白等的抗体。以本发明的S1-5蛋白或其片段为免疫原，采用公知的方法可以获得S1-5蛋白等的抗体(Harlow，E.和Lane，D.；Antibodies；A Laboratory manual，Cold Spring Harbor，New York，1988，Kohler，G.和Milstein，C.，Nature 256495-7，1975)。
在免疫方面，可将本发明的S1-5蛋白或其片段与合适的佐剂一起针对免疫动物进行免疫。也可将S1-5蛋白的片段与载体蛋白相结合构成免疫原。用于获得免疫原的载体蛋白，可以使用钥孔血蓝蛋白(Keyholimethemocyanin，KLH)或牛血清白蛋白(BSA)等。
免疫动物一般可以利用兔、小鼠、大鼠、山羊或绵羊等。作为佐剂，一般可以使用弗氏完全佐剂(FCA)等(Adv.Tubercl.Res.，1130-148，1956)。以适当的时间间隔进行追加免疫，在确认抗体效价提高后采血，从而获得抗血清。进一步，纯化出其中的抗体成分，可制成纯化抗体(多克隆抗体)。
此外，采集抗体产生细胞，通过细胞融合等方法进行克隆，也可获得单克隆抗体。单克隆抗体是在免疫测定中实现高灵敏度和高特异性的重要工具。此外，作为其它方法，通过随机切断编码滑膜素的DNA，并将其插入噬菌体载体，制成展示结构域肽的噬菌体文库，也可以获得识别S1-5蛋白等的抗体。以识别滑膜素的抗体对上述文库进行免疫筛选，可确定具有免疫学活性的结构域。
作为抗体产生细胞，也可利用免疫动物来源的细胞。进一步，以这样获得的免疫动物来源的单克隆抗体产生细胞的抗体基因为基础，可以构建嵌合抗体或人源化抗体。当对人类给与抗体时，动物抗体将作为异物而被排斥，因此是不优选的。因此，必须使用将抗原性强的抗体恒定区替换为人类抗体的嵌合抗体，或者不仅是恒定区、甚至将可变区骨架也替换为人类基因的人源化抗体。
识别基于本发明而提供的S1-5蛋白等的嵌合抗体或人源化抗体对于药物送递系统(Drug Delivery System，DDS)而言是用的。在使用识别本发明的S1-5蛋白的抗体的DDS中，抗体连接后可能有用的物质包括例如Fas配体、抗滑膜素抗体等。
此外，本发明的抗体可以用作S1-5蛋白等的免疫学检测试剂。利用抗体在免疫学上检测存在于组织、血液中的蛋白质等的方法是公知的。
此外，本发明的抗体可以用于S1-5蛋白等或表达S1-5蛋白等的细胞的分离或检测。利用抗体进行蛋白质等的分离纯化的方法是本领域技术人员所周知的。此外，本发明的S1-5蛋白等可用作滑膜细胞、人二倍体成纤维细胞的标记。即以S1-5蛋白等的表达为指标，可进行滑膜细胞、人二倍体成纤维细胞的检测与分离。抗体可通过适当的荧光等进行标记。例如，可使用针对S1-5蛋白等的抗体，采用细胞分选等方式分离出表达S1-5蛋白等的细胞。
而且，本说明书中引用的所有现有技术文献均已作为参考并入本说明书中。
以下，通过实施例更具体地对本发明进行说明。但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1S1-5基因的克隆及基因打靶载体的制备使用RA患者滑膜细胞来源的cDNA表达文库进行结合滑膜素的因子的筛选(竹绳忠臣、渡边俊树编，生物手册UP系列“蛋白质分子间相互作用实验方法”.pp.66-67、羊土社；Kaelin，W.G.等人，Cell 70，351-364，1992；Skolnik，E.Y.等人，Cell 65，83-90，1991；Sambrook，J.等人，MolecularCloning，a laboratory manual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press12.16-12.20，1989)。37℃温育20min以使文库噬菌体侵染大肠杆菌(XL1-Blue MRF’)，然后使培养物与顶层琼脂糖混合后涂布于平板上。42℃培养3.5小时后，将10mM IPTG浸泡后经干燥处理的硝酸纤维素膜覆盖在平板上，再于37℃培养3.5小时。回收膜，用清洗缓冲液[10mM Tris-HCl(pH8.0)，0.5％脱脂乳，0.1％ TritonX-100，150mM NaCl，1mM EDTA，5mM MgCl2，1mM DTT，蛋白酶抑制剂(完全，Boehringer Mannheim公司)]清洗5次，每次5分钟，然后于封闭缓冲液[10mM Tris-HCl(pH8.0)，5％脱脂乳，0.1％TritonX-100，150mM NaCl，1mM EDTA，5mM MgCl2，1mM DTT，5％甘油，蛋白酶抑制剂(完全，Boehringer Mannheim公司)]中浸泡1小时。用清洗缓冲液清洗5次，每次5分钟，然后加入作为探针的使用蛋白激酶A进行32P标记处理的GST-滑膜素(约106cpm/ml)，温育。更换清洗液反复清洗，直至一张薄膜的放射计数约为1kcpm，通过放射自显影检测信号。结果表明获得了与滑膜素结合的克隆。针对该cDNA，测定了其5’末端附近100bp及3’末端附近100bp的碱基序列。基于所获得的碱基序列信息进行数据库检索，发现末端100bp的范围内是与称作S1-5(也称作EFEMP-1、FBNL或FBLN-3)[Lechka-Czernik，B.，等人，Molecular and Cellular Biology，15，120-128，1995；登录号U03877(cDNA)，AAA65590(蛋白质)，Stone，E.M.等人，Nature Genetics 22，199-202，1999；登录号Q12805(蛋白质)]的公知基因的共有序列。两者的基因及翻译产物的大小几乎相同，这暗示它们可能为同一种蛋白。本发明中，人S1-5的cDNA序列及氨基酸序列分别示于SEQID NO1和2。
在小鼠S1-5基因片段的翻译起始位点(翻译成第一个甲硫氨酸的ATG密码子)导入LacZ基因，构建基因打靶载体。插入新霉素抗性(neo)基因作为标记基因，同时连接白喉毒素A(DT-A)基因以允许排除发生非同源重组的细胞株。本发明中，小鼠S1-5的cDNA序列、氨基酸序列及基因组序列分别示于SEQ ID NO3、4和5。
实施例2S1-5基因敲除小鼠的制备采用电穿孔法将实施例1的基因打靶载体导入小鼠TT-2细胞株，并选出发生同源重组的细胞株。将所获细胞注射入8细胞期胚内，然后直接移植入代孕母鼠的输卵管，也可经一日培养发育成胚泡后移植入代孕母鼠的子宫。使所获杂合变异小鼠(F1)间相互交配，获得杂合或纯合变异小鼠。在这样获得的变异小鼠中，原本应该表达S1-5的组织将表达lacZ蛋白(β-半乳糖苷酶)而不是S1-5。
通过Southern印迹分析确认基因型。从出生后2周龄左右的小鼠尾尖约3mm处提取DNA，所获DNA以限制性酶BamHI消化，备用。在野生型中2.4kbp处可检测出条带，在纯合变异小鼠中5.4kbp处可检测出条带，在杂合变异小鼠中则可同时检测出以上两个位置的条带。此外，用Northern印迹方法进行S1-5基因mRNA表达的确认，结果未确认该基因mRNA的表达。
实施例3S1-5基因敲除动物分析对13～117周龄(3～29月龄)的S1-5基因敲除小鼠根据剖检和X光片进行分析。在高龄(8个月～)小鼠中可见脊柱后凸、骨量减少、脱毛、面部皮肤损伤、指甲坏死、胸部肥大、腹水、肝肿瘤、眼底及脂肪组织内的血块和子宫肥大(

图1～6)。
实施例4S1-5基因敲除动物止血分析针对8周龄～111周龄(26月龄)的S1-5基因敲除小鼠，切断其尾部，每隔10秒用滤纸吸取一次涌出的血液，考察止血程度。结果表明，S1-5基因敲除小鼠存在止血困难的倾向(图7)。
实施例5S1-5基因敲除动物的血细胞比容值分析将用于测定微量血细胞比容的毛细管(Capillary tubes formicro-hematocrits，长度75mm，肝素化，Drummond Scientific Co.)的一端插入血液中并保持适当的倾斜，由于毛细管现象血液会上升，由此采血直到血液其上升至毛细管全长的2/3处。用腻子(putty)封闭吸入血液的一端。将一端封闭的毛细管在离心机中11000rpm离心15分钟，然后使用计数板读出比值(％)。结果表明，S1-5基因敲除小鼠中存在血细胞比容值低的倾向，处于贫血状态(图8～9)。
实施例6S1-5基因敲除动物的外周血Giemsa染色使用15～110周龄的S1-5基因敲除小鼠，由尾静脉采血后，在PBS中稀释1000倍，细胞离心涂片(cytospin)(800rpm，5分钟)，进行外周血的Giemsa染色。结果可见S1-5基因敲除小鼠的贫血，具体地说，可以观察到红细胞数量减少、红细胞异常(环状红细胞)、染色性差异等(图10)。
实施例7S1-5基因敲除小鼠分析为将S1-5基因敲除小鼠的脊柱弯曲程度数值化，使用X光照片测量了弯曲的角度。结果表明，野生型小鼠中呈95°及95°以下角度的个体很少，与此相对，S1-5基因敲除小鼠中呈95°及95°以下角度的个体频繁出现。因此，将95°及95°以下定义为后凸的发病，并每隔21周龄统计发病率。可知与雄性相比，雌性的发病频率更高，而且发病时间较早，始于22周龄左右(图11、12)。进一步，骨吸收标记NTx(I型胶原交联的N-端肽)的测定结果表明，对于雌性S1-5基因敲除小鼠，43周龄以后该值呈高值状态(图13、14)，这暗示S1-5基因敲除小鼠的骨吸收亢进。并且，通过测定血清中或尿中的NTx，可以预测出骨密度降低。已知NTx与骨密度呈负相关(Taguchi Y等人，Calcif Tissue Int.62；395-399，1998)。
实施例8S1-5基因敲除小鼠的骨组织分析由于S1-5基因敲除小鼠中发现了骨组织异常，在ELK CORPORTION通过测定pQCT(外周定量计算机断层摄影术，peripheral quantitativeComputed Tomography)进行了详细分析。结果显示S1-5基因敲除小鼠中骨盐量、骨密度下降(图15)。该现象特别是在雌性个体中十分显著。此外，可知与野生型小鼠相比，极座标截面模量(断面係数)在S1-5基因敲除小鼠中显著减小，且骨强度下降。
进一步，进行TRAP染色，确定组织中的破骨细胞数。并且，将等倍数拍摄的各孔的图像采集入计算机，使用Image J(NIH发布)用线围起相当于破骨细胞的部分，再求出其以像素(pixel)计的面积。结果表明，在S1-5基因敲除小鼠中破骨细胞的数量增加(图16A)、大小增大(图16B)。
实施例9S1-5基因敲除小鼠来源的骨髓细胞的破骨细胞形成能力分析使用S1-5基因敲除小鼠来源的骨髓细胞，进行体外破骨细胞形成能力分析。在96孔板上接种1×105个骨髓细胞，加入终浓度为50ng/mL的M-CSF(macrophage colony stimulating facter，巨噬细胞集落刺激因子)，2日后再加入终浓度为10、30、100ng/mL的RANKL(Receptor Activator of NF-κBLigand，NF-κB配体的受体活化物)。7日后，固定细胞并进行TRAP染色，考察破骨细胞形成能力(图17A)。实验按n＝6进行。结果表明，在终浓度为30、100ng/mL的RANKL存在下，破骨细胞形成数显著上升(图17B)。TRAP溶解测定表明，S1-5基因敲除小鼠中TRAP活性值上升(图17C)。而且，加入终浓度为100ng/mL的RANKL时，TRAP染色结果表明，与野生型相比，S1-5基因敲除小鼠中TRAP阳性多核巨细胞的大小增大(图17D和E)。这些结果显示S1-5缺失影响RANKL存在下的破骨细胞形成，暗示S1-5与破骨细胞的分化抑制相关。
实施例10稳定表达S1-5-His的CHO-K1细胞的制备以大量纯化分泌型蛋白S1-5-His为目的，制备稳定表达人S1-5-His的CHO-K1细胞。使用Lipofectamine 2000，用20μg pCAGGS-S1-5-His及0.7μgpcDNA3共转染CHO-K1细胞(10cm盘×1)，第二天10倍稀释接种于6个10cm盘中。次日，在800μg/mL的遗传霉素(Geneticin)中开始选择，于11天后挑取集落。每个10cm盘挑取16个集落(合计96个克隆)接种于96孔板，然后放大至24孔板、6孔板。同时，选取6个总试样(バルク)分别接种于10cm盘中，待细胞达到铺满状态后，更换为无血清培养基，24小时后TCA沉淀培养上清，检查S1-5-His的表达情况(图18)。另一方面，对在6孔板中达到铺满状态的克隆细胞，同样检查S1-5-His的表达(图19)。对于6孔板的每一个孔使用1mL无血清培养基，将其TCA沉淀物的一半用于表达检查。结果可确定6个总试样的任意一个在细胞提取液和培养上清液中均有S1-5-His的表达，特别是总试样No.1、2、3表现为强表达。而且，确认了CHO-K1细胞内源性的S1-5蛋白被分泌到培养上清液中(图18)。另一方面，针对挑取的96个克隆中确认存在增殖的90个克隆，检查S1-5-His的表达(图19)。其中，针对克隆No.1、6、10、11、13、25、38、43、44、61、96再次检查S1-5-His的表达(图20)。结果检出在克隆No.1、6、44、96中，S1-5-His的表达比总试样1更强。最后选择克隆No.96用于以下实验。
实施例11从稳定表达S1-5-His的CHO-K1细胞的培养上清液纯化S1-5-His用滤器过滤稳定表达S1-5-His的CHO-K1细胞的培养上清液60mL，然后用Centriplus浓缩至约10mL。经浓缩的样品对纯化缓冲液(20mM Tris-HCl(pH7.5)、500mM NaCl、10％甘油)透析。透析后的样品加至1mL HisTrap层析柱中，以10mL纯化缓冲液清洗层析柱。以含10mM和250mM咪唑的纯化缓冲液(1mL/级分)洗脱吸附的蛋白。250mM咪唑洗脱级分中所含的蛋白经10％SDS-PAGE分离后，采用银染法(图21A)或使用S1-5抗体的Western印迹法(图21B)进行检测。结果使用抗S1-5抗体可检出一条带。
进一步，用滤器(0.22μm)过滤稳定表达S1-5-His的CHO-K1细胞的培养上清280mL，然后加至1mL HisTrap层析柱中。以10mL纯化缓冲液(20mM Tris-HCl(pH7.5)、500mM NaCl、10％甘油)和含10mM咪唑的纯化缓冲液清洗，以含50mM和100mM咪唑的纯化缓冲液(1mL/级分)洗脱吸附的蛋白。回收洗脱级分(约4mL)，对1L PBS溶液透析过夜，用滤器(0.22μm)过滤样品。50mM和100mM咪唑洗脱级分中所含的蛋白经10％SDS-PAGE分离后，采用银染法进行检测(图22)。结果表明，与50mM咪唑相比，在使用含100mM咪唑的纯化缓冲液的洗脱级分中多余条带消失，获得了纯度更高的S1-5蛋白。
实施例12S1-5截短蛋白质的制备在S1-5序列中具有6个EGF样结构域。为了研究S1-5的功能，从C末端开始将EGF样结构域一个一个地去除，从而制成了6个构建体(图23)。
使用FuGENE6(Roche)，用S1-5-E1-His/pME18S、S1-5-E1-2-His/pME18S、S1-5-E1-3-His/pME18S、S1-5-E1-4-His/pME18S、S1-5-E1-5-His/pME18S、S1-5-E1-6-His/pME18S和S1-5 full-His/pME18S转染CHO-K1细胞。转染后8小时，将培养基更换为无血清培养基，培养24小时。回收培养上清液，加Ni-琼脂糖，4℃回旋振荡8小时。以清洗缓冲液(20mM Tris-HCl(pH7.5)、500mM NaCl、10％甘油、10mM咪唑)清洗Ni-琼脂糖3次，然后用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl(pH7.5)、500mM NaCl、10％甘油、250mM咪唑)洗脱S1-5蛋白。通过透析将洗脱级分的缓冲液置换为PBS，采用Western印迹方法计算出S1-5蛋白的浓度(图24)。
实施例13FLAG-S1-5的纯化将HEK 293细胞(大日本制药)接种于150mm盘(IWAKI)，使其处于80％～90％铺满的状态。第二天，使用FuGENE6进行转染。操作方法遵照附带的说明书。2天后，回收细胞，加300μL溶解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.4)、420mM NaCl、1mM EDTA、1mM MgCl2、0.5mM DTT、1mMPMSF)，冰上保温20分钟。然后，加入100μL结合有抗FLAG抗体(SIGMA)的琼脂糖珠子，4℃在回旋振荡器上搅拌，保温过夜。在清洗缓冲液(50mMTris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、0.5mM DTT、1mM PMSF)中清洗珠子5次，加入100μL的100μg/mL的FLAG肽(SIGMA)，4℃在回旋振荡器上搅拌，保温2小时。离心收集上清，取其中10μL进行SDS-PAGE、采用Western印迹鉴定从细胞内纯化的FLAG-S1-5(图25A)，通过CBB染色算出其浓度。
另一方面，在转化后48小时回收培养上清液，加入100μL结合有抗FLAG抗体的琼脂糖珠子，4℃在回旋振荡器上搅拌，保温过夜。此后，进行与上述相同的操作，鉴定从培养上清液纯化的FLAG-S1-5，并算出其浓度(图25B)。结果表明，从细胞内和培养上清液中均可纯化获得S1-5蛋白(图25AB)。
实施例14GST-S1-5的纯化分离转化了表达GST融合S1-5-His的pGEX的大肠杆菌的菌落，接种于10mL的LB-氨苄青霉素培养基(50mg/mL氨苄青霉素，以下同)，37℃培养过夜(前培养)。将经前培养的大肠杆菌加入200mL的LB-氨苄青霉素培养基中，37℃培养2.5小时(主培养)，然后添加终浓度为0.5mM的IPTG，30℃继续培养3小时。离心收集菌体，加入5mL BC500(20mMTris-HCl(pH8)，0.5mM EDTA，500mM KCl，20％甘油，1％ NP-40，1mM DTT，0.5mM PMSF，1μg/mL的抑肽酶(aprotinin)、胃蛋白酶抑制剂(pepstatin)、和亮抑蛋白酶肽(leupeptin))及100μL的100mg/mL的溶菌酶，重悬，超声处理破碎菌体。离心收集上清，加入500μL GSH树脂(谷胱甘肽S-转移酶偶联的琼脂糖珠子(Pharmacia))，4℃在回旋振荡器上保温过夜。以BC500清洗GSH树脂5次，然后上微柱(Bio-Red)，加入500μL PreScission蛋白酶(Pharmacia)溶液(10U prescission蛋白酶，50mM Tris-HCl(pH7.0)、150mMNaCl、1mM EDTA、1mM DTT)，封盖，于4℃静置保温24小时。回收从微柱上洗脱的溶液，即为被切下的S1-5-His的溶液，采用Western印迹进行鉴定(图26)并用CBB染色测定浓度。结果显示从大肠杆菌纯化了S1-5蛋白(图26)。
实施例15在S1-5基因敲除小鼠来源的骨髓细胞中来源于CHO-K1细胞培养上清液的S1-5对破骨细胞形成能力的影响使用S1-5基因敲除小鼠来源的骨髓细胞和实施例11中从CHO-K1细胞纯化的S1-5蛋白，考察了体外条件下纯化的S1-5蛋白对破骨细胞形成能力的影响。取1×105个骨髓细胞接种于96孔培养板，加入终浓度为50ng/mL的M-CSF，2天后加入终浓度为100ng/mL的RANKL。以PBS稀释S1-5，从加入M-CSF时起，在培养液中连续加入S1-5蛋白，使其终浓度为0、10、30、100ng/mL。5天后，固定细胞，进行TRAP染色，考察S1-5对破骨细胞形成能力的影响。实施实验时取n＝5。实验结果确认了依赖于S1-5浓度，阳性多核细胞数被显著地抑制(图27、29)。并且，TRAP阳性多核巨细胞形成数也依赖于S1-5浓度而被抑制(图28、29)。进一步，在除添加终浓度为0、10、30、100、200、500ng/mL S1-5外、其它与实施例6相同的实验中，发现TRAP阳性多核巨细胞的大小依赖于S1-5浓度而减小(图30)。
实施例16在S1-5基因敲除小鼠来源的骨髓细胞中截短的S1-5蛋白(S1-5-truncate)对破骨细胞形成能力的影响使用S1-5基因敲除小鼠来源的骨髓细胞和实施例12中由CHO-K1细胞纯化的S1-5-E1-2蛋白，考察体外条件下纯化的S1-5-E1-2蛋白对破骨细胞形成能力的影响。实验方法除加入终浓度为0，10ng/mL的S1-5-E1-2外，其它均与实施例15相同。实验结果确认了TRAP阳性多核细胞数被截短的S1-5蛋白所抑制(图31、33)。并且，确认TRAP阳性多核巨细胞形成数被更显著地抑制(图32、33)。S1-5-E1-2的氨基酸序列示于SEQ ID NO6。
实施例17RAW264.7细胞中CHO-K1细胞培养上清液来源的S1-5对破骨细胞形成能力的影响使用RAW264.7细胞(小鼠巨噬细胞来源的细胞)和实施例11中纯化的CHO-K1细胞培养上清液来源的S1-5，考察了体外条件下CHO-K1细胞培养上清液来源的S1-5对破骨细胞形成能力的影响。取2.5×105个RAW264.7细胞接种于96孔培养板，添加终浓度为100ng/mL的RANKL。以PBS稀释S1-5，并以0、10、30、100、200、500ng/mL的终浓度连续地添加至培养液中。3天后，固定细胞，进行TRAP染色，考察S1-5对破骨细胞形成能力的影响。实施实验时取n＝5。实验结果确认了依赖于S1-5浓度的TRAP阳性多核细胞数抑制(图34、35)。
附图的简要说明(图1)显示26月龄S1-5基因敲除小鼠表现型的照片。S1-5-/-雄性(动物编号1101)、2002/1/14B。可见脊柱后凸、脱毛、面部皮肤损伤、指甲坏死、胸部肥大，解剖时可见腹水和肝脏肿瘤。
(图2)显示26月龄S1-5基因敲除小鼠表现型的照片。S1-5-/-雌性(动物编号1093)、2002/1/15B。可见脊柱后凸、止血困难、血细胞比容值低。指甲坏死、眼底血块，解剖时可见子宫肥大、脂肪组织内血块。
(图3)显示26月龄S1-5基因敲除小鼠表现型的照片。S1-5-/-雌性(动物编号1103)、2002/1/14B。可见脊柱后凸。
(图4)显示S1-5基因敲除小鼠骨变形情况的X光照片。
(图5)显示S1-5基因敲除小鼠骨变形情况的X光照片。
(图6)显示S1-5基因敲除小鼠骨变形情况的X光照片。
(图7)切断S1-5基因敲除小鼠的尾，用滤纸每隔10秒吸取一次涌出的血液，图7为显示其结果的照片。
(图8)显示S1-5基因敲除小鼠血细胞比容值的照片。
(图9)S1-5基因敲除小鼠血细胞比容值示意图。
(图10)由采自基因敲除小鼠的尾静脉的血液所制作的血液涂片标本的Giemsa染色照片。2004/2/27自尾静脉采血后，于PBS中稀释1000倍，细胞离心涂片(800rpm、5分钟)。2004/3/1 May-Grunwald-Giemsa染色(×200)。
(图11)A为显示S1-5基因敲除小鼠脊柱弯曲角度的照片。B为按周龄统计S1-5基因敲除小鼠脊柱弯曲角度发病率的图。对各周龄的小鼠进行X光照像后，测量脊椎弯曲的角度，该角度在95°或95°以下，认为是发生后凸。
(图12)按周龄统计S1-5基因敲除小鼠脊柱弯曲角度的图表。S1-5-/-雌性小鼠在21周龄之后发生后凸，且随年龄增长病情恶化。
(图13)显示S1-5基因敲除小鼠尿中NTx值的图表。针对每个个体，收集合并一周内的尿液进行测定。
(图14)按周龄统计S1-5基因敲除小鼠尿中NTx值的图表。
(图15)显示S1-5基因敲除小鼠的pQCT检测结果的图表。
(图16-A)S1-5基因敲除小鼠组织切片中破骨细胞的照片和图。
(图16-B)显示S1-5基因敲除小鼠中破骨细胞面积测定结果的图表。与野生型相比，破骨细胞面积增加。
(图17A-C)A为实验步骤示意图。B为显示S1-5基因敲除小鼠来源的骨髓细胞的破骨细胞形成能力的示意图。C为在S1-5基因敲除小鼠中进行TRAP溶解测定的结果。
(图17D-E)D为显示TRAP阳性多核巨细胞面积测定结果的图表。与野生型相比，TRAP阳性多核巨细胞的面积增加。E为显示S1-5基因敲除小鼠来源的骨髓细胞的破骨细胞形成能力的照片。表明在高浓度RANKL存在下，S1-5基因敲除小鼠来源的骨髓细胞具有促进向破骨细胞的分化的能力。
(图18)显示稳定表达S1-5-His的CHO-K1细胞株(总试样)中S1-5-His表达情况的照片。N为未进行转染的CHO-K1细胞，P为短暂表达S1-5-His的CHO-K1细胞。
(图19)显示克隆的稳定表达S1-5-His的CHO-K1细胞株中S1-5-His表达情况的照片。N为未进行转染的CHO-K1细胞，P为短暂表达S1-5-His的CHO-K1细胞。
(图20)显示克隆的稳定表达S1-5-His的CHO-K1细胞株中S1-5-His表达情况的照片。N为未进行转染的CHO-K1细胞。
(图21)250mM咪唑洗脱级分所含的蛋白质经10％SDS-PAGE分离，然后采用银染法(A)或使用抗S1-5抗体的Western印迹法(B)进行检测。图21为显示检测结果的照片。
(图22)50mM(A)和100mM(B)咪唑洗脱级分中所含的蛋白质经10％SDS-PAGE分离，然后采用银染法进行检测。图22为显示检测结果的照片。
(图23)S1-5截短蛋白的模式图。
(图24)显示S1-5截短蛋白制备结果的照片。
(图25)使用抗S1-5抗体，通过Western印迹法检测使用抗FLAG抗体从细胞内纯化的FLAG-S1-5(A)和使用抗FLAG抗体从培养上清液纯化的FLAG-S1-5(B)。图25为显示检测结果的照片。
(图26)使用抗S1-5抗体，通过Western印迹法检测纯化的GST-S1-5。图26为显示检测结果的照片。
(图27)A为实验步骤示意图。B为显示S1-5抑制S1-5基因敲除小鼠来源的骨髓细胞的破骨细胞形成能力的图表。
(图28)A为实验步骤示意图，B为显示S1-5抑制S1-5基因敲除小鼠来源的骨髓细胞的破骨细胞形成能力的图表。
(图29)显示S1-5抑制S1-5基因敲除小鼠来源的骨髓细胞的破骨细胞形成能力的照片。
(图30A-B)A为实验步骤示意图。B为显示TRAP阳性多核巨细胞面积由于S1-5而减少的图表。
(图30C)C是其形成依赖于S1-5浓度而被抑制的TRAP阳性多核巨细胞的染色照片。
(图31)A为实验步骤示意图。B为显示截短的S1-5蛋白抑制S1-5基因敲除小鼠来源的骨髓细胞的破骨细胞形成能力的图表。
(图32)A为实验步骤示意图。B为显示截短的S1-5蛋白抑制S1-5基因敲除小鼠来源的骨髓细胞的破骨细胞形成能力的图表。
(图33)显示S1-5截短蛋白抑制S1-5基因敲除小鼠来源的骨髓细胞的破骨细胞形成能力的照片。
(图34)A为实验步骤示意图。B为显示S1-5抑制RAW264.7细胞的破骨细胞形成能力的图表。
(图35)显示S1-5抑制RAW264.7细胞的破骨细胞形成能力的照片。
序列表<110>罗克莫基因株式会社(LOCOMOGENE INC.)<120>含有S1-5的蛋白质制剂<130>BHP-A0503P<150>JP 2004-197035<151>2004-07-02<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2742<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1ctagtattct actagaactg gaagattgct ctccgagttt tttttttgtt attttgttaa60aaaataaaaa gcttgagcag caattcatat tactgtcaca ggtatttttg ctgtgctgtg 120caaggtaact ctgctagcta agattcacaa tgttgaaagc ccttttccta actatgctga 180ctctggcgct ggtcaagtca caggacaccg aagaaaccat cacgtacacg caatgcactg 240acggatatga gtgggatcct gtgagacagc aatgcaaaga tattgatgaa tgtgacattg 300tcccagacgc ttgtaaaggt ggaatgaagt gtgtcaacca ctatggagga tacctctgcc 360ttccgaaaac agcccagatt attgtcaata atgaacagcc tcagcaggaa acacaaccag 420cagaaggaac ctcaggggca accaccgggg ttgtagctgc cagcagcatg gcaaccagtg 480gagtgttgcc cgggggtggt tttgtggcca gtgctgctgc agtcgcaggc cctgaaatgc 540agactggccg aaataacttt gtcatccggc ggaacccagc tgaccctcag cgcattccct 600ccaacccttc ccaccgtatc cagtgtgcag caggctacga gcaaagtgaa cacaacgtgt 660gccaagacat agacgagtgc actgcaggga cgcacaactg tagagcagac caagtgtgca 720tcaatttacg gggatccttt gcatgtcagt gccctcctgg atatcagaag cgaggggagc 780agtgcgtaga catagatgaa tgtaccatcc ctccatattg ccaccaaaga tgcgtgaata 840caccaggctc attttattgc cagtgcagtc ctgggtttca attggcagca aacaactata 900cctgcgtaga tataaatgaa tgtgatgcca gcaatcaatg tgctcagcag tgctacaaca 960ttcttggttc attcatctgt cagtgcaatc aaggatatga gctaagcagt gacaggctca 1020actgtgaaga cattgatgaa tgcagaacct caagctacct gtgtcaatat caatgtgtca 1080atgaacctgg gaaattctca tgtatgtgcc cccagggata ccaagtggtg agaagtagaa 1140
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<400>2Met Leu Lys Ala Leu Phe Leu Thr Met Leu Thr Leu Ala Leu Val Lys1 5 10 15Ser Gln Asp Thr Glu Glu Thr Ile Thr Tyr Thr Gln Cys Thr Asp Gly20 25 30Tyr Glu Trp Asp Pro Val Arg Gln Gln Cys Lys Asp Ile Asp Glu Cys35 40 45Asp Ile Val Pro Asp Ala Cys Lys Gly Gly Met Lys Cys Val Asn His50 55 60Tyr Gly Gly Tyr Leu Cys Leu Pro Lys Thr Ala Gln Ile Ile Val Asn65 70 75 80Asn Glu Gln Pro Gln Gln Glu Thr Gln Pro Ala Glu Gly Thr Ser Gly85 90 95Ala Thr Thr Gly Val Val Ala Ala Ser Ser Met Ala Thr Ser Gly Val100 105 110Leu Pro Gly Gly Gly Phe Val Ala Ser Ala Ala Ala Val Ala Gly Pro115 120 125Glu Met Gln Thr Gly Arg Asn Asn Phe Val Ile Arg Arg Asn Pro Ala130 135 140Asp Pro Gln Arg Ile Pro Ser Asn Pro Ser His Arg Ile Gln Cys Ala145 150 155 160A1a Gly Tyr Glu Gln Ser Glu His Asn Val Cys Gln Asp Ile Asp Glu165 170 175Cys Thr Ala Gly Thr His Asn Cys Arg Ala Asp Gln Val Cys Ile Asn180 185 190Leu Arg Gly Ser Phe Ala Cys Gln Cys Pro Pro Gly Tyr Gln Lys Arg195 200 205Gly Glu Gln Cys Val Asp Ile Asp Glu Cys Thr Ile Pro Pro Tyr Cys210 215 220His Gln Arg Cys Val Asn Thr Pro Gly Ser Phe Tyr Cys Gln Cys Ser225 230 235 240Pro Gly Phe Gln Leu Ala Ala Asn Asn Tyr Thr Cys Val Asp Ile Asn245 250 255Glu Cys Asp Ala Ser Asn Gln Cys Ala Gln Gln Cys Tyr Asn Ile Leu260 265 270Gly Ser Phe Ile Cys Gln Cys Asn Gln Gly Tyr Glu Leu Ser Ser Asp275 280 285Arg Leu Asn Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Thr Ser Ser Tyr Leu290 295 300
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agctggcagc aaacaactac acttgtgtgg atataaatga atgtgatgcc agcaaccagt 540gtgctcaaca atgctacaac attcttggct cattcatctg tcagtgtaat caaggatatg 600aactaagcag tgacagactc aactgtgaag acatcgacga atgcagaacc tcaagctacc 660tatgccaata tcaatgtgtc aatgaacctg ggaagttctc atgtatgtgc ccacagggtt 720acgaagtggt gcgcagcaga acctgtcagg atataaatga atgtgagacc accaatgaat 780gccgagaaga tgagatgtgc tggaattacc atgggggctt ccgctgttac ccacgaaacc 840catgtcaaga tcactatgtt ctaacatcag aaaaccgatg tgtttgccca gtctcaaaca 900ctatgtgccg ggagctgccc cagtccattg tctacaaata catgagcatc cgatctgaca 960ggtccgtgcc ttcagacatc ttccagatac aggcaacaat gatttatgca aacaccatta 1020atacttttcg gattaaatct ggaaatgaaa atggagagtt ctacctacga caaacaagcc 1080ctgtgagtgc aatgctggtg cttgtgaagt ctctatcagg accaagagaa tacatcgtgg 1140acctggagat gctgacagtc agtagtatag gaaccttccg cacaagctct gtgttaagat 1200tgacaataat agtggggcca ttttcatttt agccttttac tcatataaag cctactacaa 1260gcatttaaat cagccaaaca atatcattac cttaaaactc tattttattt atagctatat 1320ctagtacatg tatattcaaa tagctagact atggtaagaa gtgggcattt aatccataag 1380agtcaatgtt tatcgttatc actgtgtgta aattagacct ttatccaaca ttaagagagc 1440taatcatata ttatctagtg aaacttggat tctttcctgc aaaatgggac caagcaagga 1500tactgttctg tgttgtatag agaaatatac acctccacag accatcccgt gagaattggc 1560catcttagca tgaagatcaa gaaggagggt ttttttaact gctttgtaag aaaatggaaa 1620aaagtcaata aagatatatt tctttagaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1677<210>4<211>387<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>4Met Ala Thr Ser Gly Val Val Pro Gly Gly Gly Phe Met Ala Ser Ala1 5 10 15Thr Ala Val Ala Gly Pro Glu Val Gln Thr Gly Arg Asn Asn Phe Val20 25 30Ile Arg Arg Asn Pro Ala Asp Pro Gln Arg Ile Pro Ser Asn Pro Ser35 40 45
His Arg Ile Gln Cys Ala Ala Gly Tyr Glu Gln Ser Glu His Asn Val50 55 60Cys Gln Asp Ile Asp Glu Cys Thr Ser Gly Thr His Asn Cys Arg Thr65 70 75 80Asp Gln Val Cys Ile Asn Leu Arg Gly Ser Phe Thr Cys Gln Cys Leu85 90 95Pro Gly Tyr Gln Lys Arg Gly Glu Gln Cys Val Asp Ile Asp Glu Cys100 105 110Thr Val Pro Pro Tyr Cys His Gln Arg Cys Val Asn Thr Pro Gly Ser115 120 125Phe Tyr Cys Gln Cys Ser Pro Gly Phe Gln Leu Ala Ala Asn Asn Tyr130 135 140Thr Cys Val Asp Ile Asn Glu Cys Asp Ala Ser Asn Gln Cys Ala Gln145 150 155 160Gln Cys Tyr Asn Ile Leu Gly Ser Phe Ile Cys Gln Cys Asn Gln Gly165 170 175Tyr Glu Leu Ser Ser Asp Arg Leu Asn Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys180 185 190Arg Thr Ser Ser Tyr Leu Cys Gln Tyr Gln Cys Val Asn Glu Pro Gly195 200 205Lys Phe Ser Cys Met Cys Pro Gln Gly Tyr Glu Val Val Arg Ser Arg210 215 220Thr Cys Gln Asp Ile Asn Glu Cys Glu Thr Thr Asn Glu Cys Arg Glu225 230 235 240Asp Glu Met Cys Trp Asn Tyr His Gly Gly Phe Arg Cys Tyr Pro Arg245 250 255Asn Pro Cys Gln Asp His Tyr Val Leu Thr Ser Glu Asn Arg Cys Val260 265 270Cys Pro Val Ser Asn Thr Met Cys Arg Glu Leu Pro Gln Ser Ile Val275 280 285Tyr Lys Tyr Met Ser Ile Arg Ser Asp Arg Ser Val Pro Ser Asp Ile290 295 300Phe Gln Ile Gln Ala Thr Met Ile Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Thr Phe305 310 315 320Arg Ile Lys Ser Gly Asn Glu Asn Gly Glu Phe Tyr Leu Arg Gln Thr325 330 335Ser Pro Val Ser Ala Met Leu Val Leu Val Lys Ser Leu Ser Gly Pro340 345 350Arg Glu Tyr Ile Val Asp Leu Glu Met Leu Thr Val Ser Ser Ile Gly355 360 365
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权利要求
1.呈现老化性疾患或症状的非人基因敲除动物，其中全部或部分S1-5基因功能丧失。
2.权利要求1的动物，其中全部或部分S1-5基因功能的丧失是由S 1-5基因的破坏或变异引起的。
3.权利要求1的动物，其中老化性疾患或症状为选自骨变形、骨质疏松症、脱毛、组织损伤或坏死、肿瘤、胸部肥大、腹水、贫血、出血、皮肤老化及指甲老化中的至少一种。
4.权利要求1的动物，其是选自斑马鱼、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、猪、绵羊、山羊、犬、牛、猴及黑猩猩的任意动物。
5.从权利要求1～4任意一项的非人基因敲除动物中分离的细胞。
6.权利要求5的细胞，其是破骨细胞、角质化上皮细胞、血细胞、癌细胞、骨髓细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、真皮细胞、肌细胞、神经细胞、成骨细胞、淋巴细胞、血管平滑肌细胞、滑膜细胞、毛乳头细胞、肝细胞、色素细胞、脂肪细胞、子宫内皮细胞或肺泡上皮细胞。
7.出现老化性疾患的非人基因敲除动物的制备方法，其中所述方法包括使S1-5基因的全部或部分功能丧失。
8.权利要求7的方法，其中S1-5基因全部或部分功能丧失是由S1-5基因的破坏或变异引起的。
9.权利要求7的方法，其中老化性疾患或症状为选自骨变形、骨质疏松症、脱毛、组织损伤或坏死、肿瘤、胸部肥大、腹水、贫血、出血、皮肤老化及指甲老化中的至少一种。
10.权利要求7的方法，其中动物是选自斑马鱼、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、猪、绵羊、山羊、犬、牛、猴及黑猩猩的任意动物。
11.老化性疾患或症状的预防或治疗药物的筛选方法，其中对权利要求1～4任意一项的非人基因敲除动物给予所述预防或治疗药物的候选物质。
12.老化性疾患或症状的预防或治疗药物的筛选方法，其特征是使所述预防或治疗药物的候选物质与从权利要求1～4任意一项的非人基因敲除动物中分离的细胞相接触。
13.权利要求12的方法，其中所述细胞是破骨细胞、角质化上皮细胞、血细胞、癌细胞、骨髓细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、真皮细胞、肌细胞、神经细胞、成骨细胞、淋巴细胞、血管平滑肌细胞、滑膜细胞、毛乳头细胞、肝细胞、色素细胞、脂肪细胞、子宫内皮细胞或肺泡上皮细胞。
14.权利要求11～13任意一项的方法，其中老化性疾患或症状为选自骨变形、骨质疏松症、脱毛、组织损伤或坏死、肿瘤、胸部肥大、腹水、贫血、出血、皮肤老化及指甲老化中的至少一种。
15.破骨细胞功能抑制剂的筛选方法，其中使破骨细胞功能抑制剂的候选物质与权利要求1～4任意一项的非人基因敲除动物来源的破骨细胞相接触。
16.下面(a)-(d)任意一项的分离的蛋白质(a)包含SEQ ID NO2或4所述的氨基酸序列的蛋白质；(b)由包含SEQ ID NO1或3所述的碱基序列的编码区的DNA编码的蛋白质；(c)包含在SEQ ID NO2或4所述氨基酸序列中发生一个或多个氨基酸替换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的蛋白质，所述蛋白质在功能上与包含SEQ ID NO2或4所述氨基酸序列的蛋白质等同；(d)由可在严紧条件下与包含SEQ ID NO1或3所述碱基序列的DNA杂交的DNA编码的蛋白质，所述蛋白质在功能上与包含SEQ ID NO2或4所述氨基酸序列的蛋白质等同。
17.权利要求16的蛋白质的部分肽。
18.权利要求17所述的肽，其包含SEQ ID NO6记载的氨基酸序列。
19.老化性疾患或症状的预防或治疗药物，其含有权利要求16的蛋白质、或者权利要求17或权利要求18的肽。
20.权利要求19的预防或治疗药物，其中老化性疾患或症状为选自骨变形、骨质疏松症、脱毛、组织损伤或坏死、肿瘤、胸部肥大、腹水、贫血、出血、皮肤老化及指甲老化中的至少一种。
21.一种破骨细胞功能抑制剂，其含有权利要求16的蛋白质、或者权利要求17或权利要求18的肽。
22.一种抗体，其能够与权利要求16的蛋白质、或者权利要求17或权利要求18的多肽结合。
全文摘要
本发明人首先注意到丧失S1－5基因功能的基因敲除小鼠可出现老化性疾患或症状。而且，组织学分析表明，该基因敲除小鼠的骨盐量、骨密度、骨强度下降而骨组织中破骨细胞数增加。进一步，体外使用该基因敲除小鼠来源的骨髓细胞进行的破骨细胞形成能力分析结果表明，与野生型小鼠相比，该基因敲除小鼠中破骨细胞形成能力亢进且破骨细胞增大。此外，研究还表明，在该体外体系中加入纯化后的S1－5蛋白可以抑制破骨细胞形成能力。
文档编号G01N33/15GK101052298SQ200580029650
公开日2007年10月10日 申请日期2005年7月1日 优先权日2004年7月2日
发明者中岛利博, 八木下尚子, 天野彻也 申请人:罗克莫基因株式会社